燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥小腸損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

吳昆鵬，陳 瑩，黃治家*，言彩紅

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，麻醉科，湖南 衡陽 421001)

燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥小腸損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

吳昆鵬1，陳 瑩2，黃治家1*，言彩紅1

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽 421001； 2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，麻醉科，湖南 衡陽 421001)

研究報(bào)告

目的探索燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥小腸損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(TC組)，燕麥β-葡聚糖組(Oglu組)。TC組和Oglu組以盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)法建立膿毒癥模型。Oglu組以不同劑量燕麥β-葡聚糖灌胃。12 h后收集各組小腸組織，Western blot檢測小腸組織損傷基因表達(dá)。結(jié)果1)燕麥β-葡聚糖減輕膿毒癥誘導(dǎo)的小腸損傷，降低膿毒癥大鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平(P< 0.05)；(2)膿毒癥組小腸損傷相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax、caspase-3、Toll樣、凋亡基因FAS和FASL、NF-κB表達(dá)明顯增加；(3)燕麥β-葡聚糖組小腸粘膜Bax、caspase-3、Toll樣、凋亡基因FAS和FASL、NF-κB的表達(dá)低于明顯膿毒癥組，而Bcl-2表達(dá)較高。結(jié)論燕麥β-葡聚糖調(diào)控膿毒癥大鼠小腸損傷基因的表達(dá)，保護(hù)小腸上皮免受膿毒癥的損傷。

燕麥β-葡聚糖；膿毒癥；腸粘膜

目前認(rèn)為腸道是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素[1]，膿毒癥時(shí)造成腸黏膜上皮水腫，上皮細(xì)胞膜及細(xì)胞間連接斷裂，細(xì)胞壞死，上皮從絨毛頂端開始脫落，甚至黏膜全層脫落而形成潰瘍，造成腸道通透性增加、腸屏障功能受損，腸道細(xì)菌及其毒素得以吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)生細(xì)菌移位，使全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)加劇、失控，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至危及患者生命[2]。故腸功能的保護(hù)是膿毒癥治療中極為重要的論題。早在上世紀(jì)80年代，國外學(xué)者就發(fā)現(xiàn)燕麥和大麥中富含的水溶性β-葡聚糖對(duì)人體腸道的保護(hù)作用[3,4]，但主要強(qiáng)調(diào)營養(yǎng)膳食方面，對(duì)腸道基因影響方面的研究極少。為此，我們建立大鼠膿毒癥模型，研究燕麥β-葡聚糖對(duì)小腸損傷過程中基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只清潔級(jí)SD雄性大鼠，6～8周齡，體重280～320 g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供[SCXK(湘)2015-0001][SYXK(湘)2015-0001]。通過口服管飼法每天處理小鼠，并單獨(dú)飼養(yǎng)在25℃和55%(相對(duì)濕度)的籠中。

1.2 主要試劑

T試劑盒、Trizol、PCR試劑盒購自Promega公司；Taq聚合酶、RNase inhibitor購自TaKaRa公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、ELISA試劑盒購自美國Pierce公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、caspase-3、FAS、FASL、p65、β-actin和TPB抗體購自Santa Cruz。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 燕麥β-葡聚糖的提取

山西產(chǎn)燕麥品種：晉燕8號(hào)，山西省農(nóng)科院高寒作物研究所提供。燕麥原料經(jīng)布勒磨粉機(jī)分離燕麥麩皮和燕麥粉。收集麩皮并粉碎過篩后冷藏備用。根據(jù)Bhatty[5]和Ahmad[6]所述的方法，從燕麥麩中提取高分子量β-葡聚糖,不同之處在于固體：液體比例為1∶8，pH 7.0。通過控制酸水解時(shí)間(HCl，pH 1.0，80℃)，從初始分離物獲得中等分子量的β-葡聚糖和低分子量β-葡聚糖的樣品。然后將分離物進(jìn)行徹底透析3 d，并通過冷凍干燥濃縮。通過AOAC官方方法995.16，使用測定試劑盒(Megazyme International，Bray，Ireland)測定每種樣品的總β-葡聚糖含量。通過具有多角度激光散射(SEC-LLS)的尺寸排阻色譜法測定β-葡聚糖樣品的分子量的值。使用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的量。通過在121℃的真空烘箱中將稱重的樣品干燥5 h并測量重量損失來分析水分。使用Ubbelohde毛細(xì)管粘度計(jì)，在37℃下測定各β-葡聚糖溶液的特性粘度[η]，并根據(jù)Huggins方程進(jìn)行計(jì)算。3%(w/v)燕麥β-葡聚糖溶液進(jìn)行流變學(xué)測量。通過配有錐板幾何形狀(4,20 mm)的受控應(yīng)變流變儀(TA Instrument，USA)測量粘度，并且在37℃從0.1/s～100/s的剪切速率下進(jìn)行穩(wěn)定剪切速率掃描。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=20),實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(TC組，n=20)，燕麥β-葡聚糖組(Oglu組，n=20)。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。TC組和Oglu組以CLP法[7,8]建立膿毒癥模型。建模方法：實(shí)驗(yàn)大鼠用氯胺酮(60 mg/kg，肌注)麻醉，仰面固定四肢在操作臺(tái)上，隨后在腹部中線行一個(gè)2 cm切口，暴露盲腸，找到回盲瓣的遠(yuǎn)端，用18號(hào)針頭穿刺兩次，并擠出少許糞便，將腸管返回腹腔。逐層縫合腹部傷口，術(shù)后用立即30 mL / kg生理鹽水復(fù)蘇，然后將動(dòng)物放回籠內(nèi)。Oglu組經(jīng)口灌胃給予3%的Oglu溶液，依據(jù)文獻(xiàn)給予不同劑量[9]：500 mg/(kg·d)；1000 mg/(kg·d)；2000 mg/(kg·d)。TC組予以糖鹽水喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)12 h后三組分別處死10只大鼠[8]，取各組大鼠全部小腸組織，分為3部分：一部分用蒸餾水漂洗，浸泡于多聚甲醛中，進(jìn)行病理切片觀察[10]；一部分用0.9%生理鹽水按10%濃度制成勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液，冷凍于液氮中，用ELISA試劑盒檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6，依據(jù)文獻(xiàn)，以小腸粘膜病理損傷及炎癥因子確認(rèn)膿毒癥模型[11]。

1.3.3 RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR

采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測腸道組織細(xì)胞膜外Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR2、TLR4、TLR5、TLR6)基因表達(dá)。即將腸組織制成勻漿后，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入10 mmol/L 正向和反向引物以及SYBR后(Invitrogen, Carlsbad, CA)，實(shí)時(shí)定量PCR于ABI 7500上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min，隨后進(jìn)入以下35個(gè)循環(huán)：94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 3 min。本研究所用的引物如下：TLR2：forward 5′- GCTCCTGTGACTTCCTGTCC-3′, reverse 5′- CCG AAAGCACAAAGATGGTT-3′; TLR4： forward 5′- AG GCAGCCATAACTTCTCCA-3′, reverse 5′- GGTTGAG TAGGGGCATTTGA-3′；TLR5：forward 5′- AACGCTTT GCTCAAACACCT-3′, reverse 5′- ACCCTCTGATGGA CTGATGC-3′；TLR6：forward 5′- ACTGACCTTCCTGG ATGTGG-3′, reverse 5′- GCACCACTCACTCTGGACA A-3′；β-actin, forward 5′-ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA-3′, reverse 5′-CGG AAC CGCTCA TTG CC-3′。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.3.4 蛋白提取與Western blot分析

采用Western blot檢測小腸組織Bcl-2、Bax、caspase-3、FAS和FASL基因的表達(dá)以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位。即采用Pierce提供的試劑盒提取細(xì)胞總蛋白和核蛋白。測定其濃度后，將加入等體積的2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，取20 μL蛋白用于SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，將其電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，后，加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、FAS、FASL以及p65或β-actin或TPB一抗(Santa Cruz)4℃孵育過夜，并采用ECL發(fā)光(Millipore,Billerica,MA)、顯影(VL Chemi-Smart 3000,Viogene Biotek, CA)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)

病理學(xué)分析顯示正常組腸粘膜完整(圖1 A)。 膿毒癥組中，上皮細(xì)胞間隙增大，絨毛上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞數(shù)量減少，絨毛上皮排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。相比之下，在燕麥β-葡聚糖組中，上皮細(xì)胞間隙僅在少數(shù)區(qū)域擴(kuò)大，隱窩上皮細(xì)胞豐富，炎性細(xì)胞減少(圖1C)。

2.2 各組小腸組織中炎性因子水平比較

膿毒癥組小腸組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著高于正常對(duì)照組及燕麥β-葡聚糖組(P< 0.05)；燕麥β-葡聚糖組仍高于正常對(duì)照組(P< 0.05)。(表1)

2.3 各組小腸損傷相關(guān)基因表達(dá)

2.3.1 燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，膿毒癥組(TC組)Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)明顯增加，燕麥β-葡聚糖處理后Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，而Bax蛋白表達(dá)下降，并且隨燕麥β-葡聚的劑量增加而下降明顯。見圖2。

2.3.2 燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織Caspase-3活化表達(dá)的影響

注：A：對(duì)照組；B：膿毒癥組；C：Oglu組。圖1 各組空腸組織病理學(xué)檢查(Bar=100 μm)Note.A：Control group；B：Sepsis group；C：Oglu group.Fig.1 Histopathological examination of jejunum in each group.HE staining表1 各組小腸組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平(pg/mg)Tab.1 TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in the small intestine

炎癥因子Inflammatoryfactor正常對(duì)照組Controlgroup 膿毒癥組Sepsisgroup燕麥β?葡聚糖組OglugroupTNF?α102±010472±044?280±031?#IL?1β019±001626±071?379±023?#IL?6 052±001589±078?392±027?#

注：與正常對(duì)照組比較，*P< 0.05；與膿毒癥組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the normal control group,*P< 0.05; compared with the sepsis group,#P< 0.05.

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖2 各組大鼠小腸組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.2 Expression of Bcl-2 and Bax proteins in the small intestine of rats

注：A：各組大鼠小腸組織細(xì)胞膜外Toll樣受體表達(dá)；B：實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線；1：正常對(duì)照組；2：膿毒癥組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。；與正常對(duì)照組相比，* P< 0.05;與膿毒癥組相比，#P< 0.05。圖4 各組大鼠小腸組織細(xì)胞膜外Toll樣受體表達(dá)及PCR擴(kuò)增Note.A：Expression of Toll-like receptor in the small intestine tissue of rats in each group；B：Real-time quantitative PCR amplification curve；1：Normal control group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu grop; 5∶2000 mg/kg·d Oglu grop；Compared with the normal control group, *P < 0.05; compared with the TC group,#P < 0.05.Fig.4 Expression and proliferation of Toll-like receptors and PCR amplification in the small intestine of rats in each group

與正常對(duì)照組相比，膿毒癥組(TC組)Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加，燕麥β-葡聚糖處理后Caspase-3蛋白表達(dá)下降，并且隨燕麥β-葡聚有劑量增加而下降明顯。見圖3。

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖3 各組大鼠小腸組織Caspase-3活化表達(dá)Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.3 Expression of caspase-3 in the small intestine of rats in each group

2.3.3 燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥大鼠腸道組織細(xì)胞膜外Toll樣受體(TLR2、TLR4、TLR5、TLR6)基因表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，膿毒癥組(TC組)Toll樣受體2,4,5表達(dá)明顯增加，燕麥β-葡聚糖處理后各Toll樣受體表達(dá)下降，并且隨燕麥β-葡聚有劑量增加而下降明顯。見圖4。

2.3.4 燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥大鼠小腸細(xì)胞凋亡時(shí)FAS和FASL基因表達(dá)的影響

膿毒癥大鼠小腸細(xì)胞凋亡基因FAS和FASL表達(dá)明顯增加，而燕麥β-葡聚糖下調(diào)FAS和FASL凋亡基因的表達(dá)，隨麥β-葡聚糖劑量增加，兩者表達(dá)明顯減少。見圖5。

2.3.5 燕麥β-葡聚糖對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位的影響

膿毒癥模型組中細(xì)胞核內(nèi)NF-κB亞基p65含量明顯增高，而用不同濃度Oglu處理后，細(xì)胞核內(nèi)p65水平逐漸降低，表明NF-κB活性受到抑制。而細(xì)胞核內(nèi)參TBP(TATA盒結(jié)合蛋白)水平無明顯變化。見圖5。

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖5 各組大鼠小腸組織FAS和FASL表達(dá)Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.5 Expression of FAS and FASL in the small intestine of rats in each group

注：1：NC組；2：TC組；3∶500 mg/kg·d Oglu組；4∶1000 mg/kg·d Oglu組；5∶2000 mg/kg·d Oglu組。圖6 各組大鼠小腸組織NF-κB表達(dá)Note.1：NC group; 2：TC group; 3∶500 mg/kg·d Oglu group; 4∶1000 mg/kg·d Oglu group; 5∶2000 mg/kg·d Oglu group.Fig.6 Expression of NF-κB in the small intestine of rats in each group

3 討論

大量的基礎(chǔ)及臨床研究均已表明燕麥β-葡聚糖對(duì)腸道有很好的保健作用[12,13]，燕麥β-葡聚糖纖維在減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)和控制血糖方面的作用已得到廣泛的確認(rèn)，但其他潛在的益處，包括調(diào)節(jié)腸道微生物群和炎癥，仍在被探索[14]。膳食β-葡聚糖可能會(huì)改變幼豬腸組織反應(yīng)，在斷奶后期特異性調(diào)控了腸段基因的選擇和形態(tài)的表達(dá)[15]。在給予回腸造口術(shù)患者富含燕麥β-葡聚糖飲食后發(fā)現(xiàn)，其小腸和結(jié)腸細(xì)胞系免疫功能是增強(qiáng)的，這些對(duì)腸細(xì)胞的免疫刺激作用有可能有助于增強(qiáng)宿主對(duì)侵襲性病原體的抵抗能力[16]。

本研究建立膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)其膿毒癥能明顯誘導(dǎo)大鼠小腸損傷，而燕麥β葡聚糖能減輕膿毒癥誘導(dǎo)的小腸病理改變，能抑制炎癥反應(yīng)，如膿毒癥模型大鼠中小腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低所示。進(jìn)一步探索燕麥β葡聚糖保護(hù)小腸的分子機(jī)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)燕麥β-葡聚糖對(duì)腸道功能的調(diào)節(jié)影響到基因?qū)哟危湟种崎L鏈脂肪酸和膽固醇的體外腸吸收，是由于β-葡聚糖下調(diào)參與脂肪酸合成和膽固醇代謝的基因的表達(dá)，減少腸道脂肪酸結(jié)合蛋白和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 mRNA[17]。同樣我們知道膿毒癥模型中存在大鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡，Bcl-2家族基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而Bax表達(dá)升高[18,19]。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物，是細(xì)胞存活促進(jìn)因子，Bcl-2蛋白家族是一個(gè)特別的家族，目前已發(fā)現(xiàn)25種Bcl-2家族同源蛋白，其成員中有些促進(jìn)凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些成員阻止細(xì)胞凋亡,如Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Bcl-2能夠阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制了細(xì)胞凋亡。本研究使用燕麥β-葡聚糖干預(yù)后，RT-PCR顯示Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，Bax / Bcl-2比例有所改善，提示燕麥β-葡聚糖能明顯防止膿毒癥誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞凋亡，且增加燕麥β-葡聚糖劑量，能提升這種保護(hù)效應(yīng)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)殺傷機(jī)制的重要組成部分，細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控,在正常細(xì)胞caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，caspase被活經(jīng)隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡，在腸上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[20]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型小腸組織caspase-3表達(dá)增加，喂食燕麥β-葡聚糖后能明顯抑制caspase-3的表達(dá)，從而減少了小腸上皮細(xì)胞的凋亡，且在實(shí)驗(yàn)使用的劑量范圍內(nèi)有一定的劑量依賴性。

Toll樣受體是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時(shí)，TLR可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答[21]。腸上皮細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體，其在保守的微生物因子如脂多糖(LPS)上誘導(dǎo)上皮反應(yīng)，包括上皮細(xì)胞增殖，分泌型IgA分泌到內(nèi)腔中并產(chǎn)生粘蛋白和抗微生物肽，從而促進(jìn)腸屏障功能[22]。在腸上皮細(xì)胞和對(duì)照魚的固有層細(xì)胞中，TLR2以低水平表達(dá)。腸上皮通過其促炎基因的表達(dá)，炎性細(xì)胞因子的釋放和炎性細(xì)胞的募集直接參與粘膜免疫反應(yīng)。如在炎癥性腸病腸易激綜合征患者小腸粘膜中Toll樣受體2,4,5和9的表達(dá)明顯增加[23,24]。膿毒癥小腸粘膜存在炎癥反應(yīng)，在本研究中，膿毒癥大鼠空腸組織中Toll樣受體2,4,5表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，而在燕麥β-葡聚糖組表達(dá)下降，提示了燕麥β-葡聚糖可能導(dǎo)致腸黏膜TLRs的表達(dá)下降及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化減弱，從而減輕腸粘膜炎癥。

Fas/FasL作為可直接啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑，也是是負(fù)向調(diào)節(jié)介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡最為重要的膜蛋白分子[25]。在本研究中，膿毒癥組小腸組織Fas/FasL基因表達(dá)明顯增加，而燕麥β-葡聚糖組Fas和Fasl凋亡基因的表達(dá)明顯下調(diào),隨燕麥β-葡聚糖劑量增加，這種效應(yīng)更加明顯。前面的研究均提示燕麥β-葡聚糖可以調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)，富含燕麥β-葡聚糖的糞便水刺激細(xì)胞因子誘導(dǎo)的腸細(xì)胞免疫反應(yīng)[16]。使用燕麥β-葡聚糖的小鼠在腸細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的腸NF-κB反式激活，特別是在小腸近端(回腸)，但是在結(jié)腸中未被激活[26]。本研究膿毒癥模型組中細(xì)胞核內(nèi)NF-κB亞基p65含量明顯增高，而用不同濃度燕麥β-葡聚糖處理后，p65水平逐漸降低，表明NF-κB活性受到抑制。

綜上所述，燕麥β-葡聚糖能通過不同途徑抑制膿毒癥大鼠的小腸細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)其膿毒癥腸道保護(hù)作用，但是如在動(dòng)物和人體中觀察到的，燕麥β-葡聚糖對(duì)腸道免疫的影響研究還處在初期，從宏觀到微觀的潛在機(jī)制，都需要進(jìn)一步評(píng)估。

[1] Fay KT, Ford ML, Coopersmith CM. The intestinal microenvironment in sepsis[J]. Biochim Biophys Acta,2017,1863(10):2574-2583.

[2] Rombeau JL, Takala J.Summary of round table conference：gut dysfunction in critical illnesss[J]．Intensive Care Med，1997，23(4)：476-479．

[3] Estrada A, van Kessel A, Laarveld B．Effect of administration of oat beta-glucan on immune parameters of healthy and immunosuppressed beefsteers[J]．Can J Vet Res，1999,63(4):261-268．

[4] Bourdon I, Yokoyama W, Davis P.Postprandial lipid，glucose，insulin，and cholecystokinin responses in men fed barley pasta enriched with beta-glucan[J]．Am J Clin Nutr，1999,69(1):55-63．

[5] Bhatty RS.Laboratory and pilot plant extraction and purification of β-glucans from hull-less barley and oat brans[J]. J Cereal Sci, 1995, 22(2):163-170.

[6] Ahmad A, Anjum FM, Zahoor T,et al. Extraction and characterization of β-d-glucan from oat for industrial utilization[J]. Int J Biol Macromol,2010,46 (3):304-309.

[7] Siempos II, Lam HC, Ding Y, et al. Cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice[J]. J Vis Exp, 2014, (84):e51066.

[8] 王寧，周紅，郭毅斌，等.心導(dǎo)管留置術(shù)后盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)膿毒癥動(dòng)物模型的建立[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008,18(10):12-14.

[9] Liu M, Zhang Y, Zhang H, et al. The anti-diabetic activity of oat β-d-glucan in streptozotocin-nicotinamide induced diabetic mice[J]. Int J Biol Macromol,2016, 91:1170-1176.

[10] 趙玉瓊，李瑞生，陳華.三種固定液對(duì)大、小鼠腸道組織石蠟切片質(zhì)量的影響[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014,24(11):53-56.

[11] Wan SX, Shi B, Lou XL, et al. Ghrelin protects small intestinal epithelium against sepsis-induced injury by enhancing the autophagy of intestinal epithelial cells[J]. Biomed Pharmacother,2016, 83:1315-1320.

[12] Earnshaw SR, McDade CL, Chu Y, et al. Cost-effectiveness of maintaining daily intake of oat β-glucan for coronary heart disease primary prevention[J]. Clin Ther,2017,39(4):804-818.e3.

[13] Ryan PM, London LE, Bjorndahl TC, et al. Microbiome and metabolome modifying effects of several cardiovascular disease interventions in apo-E- /- mice[J]. Microbiome,2017,5(1):30.

[14] Menon R, Gonzalez T, Ferruzzi M, et al. Oats-from farm to fork[J]. Adv Food Nutr Res,2016,77:1-55.

[15] Metzler-Zebeli BU, G?nzle MG, Mosenthin R, et al. Oat β-glucan and dietary calcium and phosphorus differentially modify intestinal expression of proinflamma-tory cytokines and monocarboxylate transporter 1 and cecal morphology in weaned pigs[J]. J Nutr,2012,142(4):668-674.

[16] Ramakers JD, Volman JJ, Bi?rklund M, et al. Fecal water from ileostomic patients consuming oat beta-glucan enhances immune responses in enterocytes[J]. Mol Nutr Food Res,2007,51(2):211-220.

[17] Drozdowski LA, Reimer RA, Temelli F,et al. Beta-glucan extracts inhibit the in vitro intestinal uptake of long-chain fatty acids and cholesterol and down-regulate genes involved in lipogenesis and lipid transport in rats[J]. J Nutr Biochem,2010,21(8):695-701.

[18] Fu H, Wang QS, Luo Q, et al. Simvastatin inhibits apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax[J]. World J Emerg Med,2014,5(4):291-297.

[19] Klingensmith NJ, Yoseph BP, Liang Z, et al. Epidermal growth factor improves intestinal integrity and survival in murine sepsis following chronic alcohol ingestion[J]. Shock,2017,47(2):184-192.

[20] Grossmann J, Walther K, Artinger M, et al. Induction of apoptosis before shedding of human intestinal epithelial cells[J]. Am J Gastroenterol,2002,97(6):1421-1428.

[21] Kim CH. B cell-helping functions of gut microbial metabolites[J]. Microb Cell,2016,3(10):529-531.

[22] Johnston DG, Corr SC. Toll-like receptor signalling and the control of intestinal barrier function[J]. Methods Mol Biol, 2016,1390:287-300.

[23] Tan Y, Zou KF, Qian W,et al. Expression and implication of toll-like receptors TLR2, TLR4 and TLR9 in colonic mucosa of patients with ulcerative colitis[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2014,34 (5): 785-790.

[24] 郭文濤, 劉萍, 董麗娜, 等. 腹瀉型腸易激綜合征患者腸黏膜優(yōu)勢菌的改變與Toll 樣受體2和4基因表達(dá)的相關(guān)性研究[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2016, 55(7): 541-543.

[25] Zimmerman MA, Singh N, Martin PM, et al. Butyrate suppresses colonic inflammation through HDAC1-dependent Fas upregulation and Fas-mediated apoptosis of T cells[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2012,302(12):G1405-1415.

[26] Volman JJ, Mensink RP, Ramakers JD,et al. Dietary (1→3), (1→4)-β-D-glucans from oat activate nuclear factor-κB in intestinal leukocytes and enterocytes from mice[J]. Nutr Res,2010,30(1):40-48.

Effectsofoatβ-glucanontheexpressionofsmallintestineinjury-relatedgenesinsepticrats

WU Kun-peng1， CHEN Ying2， HUANG Zhi-jia1*， YAN Cai-hong1

(1.Department of Intensive Care Medicine,The Second Hospital Affiliated to South China University,Hengyang 421001，China； 2.Department of Anesthesia，The Second Hospital Affiliated to South China University,Hengyang 421001)

ObjectiveTo explore the effect of oat β-glucan on gene expression in small intestine injury in sepsis.MethodsSD rats were randomly divided into normal control group (NC group), experimental control group (TC group) and oat β-glucan group (Oglu group).TC group and Oglu group were used to establish sepsis model with CLP method ,and oglu group with different doses of oat β-glucan. After 12 h the small intestine tissue were collected. Western blot was used to detect gene expression in the small intestine tissue injury.Results1)Oat β-glucan reduced sepsis-induced small intestine injury,and reduced the TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in small intestine of septic rats.(2) The expression of small intestinal injury-related proteins such as Bax, caspase-3, Toll-like, apoptotic genes FAS and FASL and NF-κB were significantly increased,and Bcl-2 expression was down-regulated in the TC group.(3)The expressions of Bax, caspase-3, Toll-like, apoptotic genes FAS and FASL and NF-κB in oat β-glucan-treated rats were lower than that in the septic rats, while Bcl-2 expression was higher than the TC group.ConclusionsOat β-glucan regulates the expression of small intestinal injury genes in septic rats and protects the small intestinal epithelium against sepsis-induced injury.

Oat β-glucan; Sepsis; Intestinal mucosa

2017-05-22

湖南省教育廳基金(15C1212)。

吳昆鵬(1980-)，男，主治醫(yī)師，研究方向：膿毒癥。E-mail: iron_head@yeah.net

黃治家(1983-)，男，主治醫(yī)師，研究方向：膿毒癥。E-mail: 35675205@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0039-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.007

〔收稿日期〕2017-05-30