經皮電刺激對大鼠周圍神經端側吻合效果的影響

孫 乾，曹群華，祝 偉，梅遠東，顧 晨

(常熟市第二人民醫院手足外科，江蘇 常熟 215500)

經皮電刺激對大鼠周圍神經端側吻合效果的影響

孫 乾，曹群華，祝 偉，梅遠東，顧 晨

(常熟市第二人民醫院手足外科，江蘇 常熟 215500)

研究報告

目的觀察和探索經皮電刺激促進神經端側吻合后神經再生的效果及其臨床價值。方法選取雄性SD大鼠32只，隨機分為正常對照組(A組)，肌皮神經損傷后端端吻合至尺神經組(B組)，肌皮神經損傷后端側吻合至尺神經組(C組)，肌皮神經損傷后端側吻合至尺神經+術后經皮電刺激組(D組)。觀察各組大鼠患側肢體的肌力恢復情況以及神經纖維的再生情況。結果C組和D組大鼠振幅、傳導速度低于A組，潛伏期高于A組；而D組大鼠振幅、傳導速度低于C組，潛伏期高于C組；B、C、D三組大鼠肱二頭肌濕重比以及肌纖維橫截面積均低于A組，且C組肌肉恢復最差；B、C、D三組大鼠NF-200表達明顯低于A組，D組NF-200表達明顯強于C組，但仍顯著少于B組，差異均具有顯著性(P< 0.05)。電鏡檢查顯示B組神經纖維髓鞘成熟，C組以無髓神經纖維為主，髓鞘成熟度差。D組髓鞘增生情況較C組好轉，但仍有部分無髓神經纖維存在。結論神經端側吻合術后經皮電刺激能有效促進神經軸突再生以及延緩靶肌的失神經萎縮，盡管較之神經端端吻合存在差距，仍不失為臨床修復周圍神經損傷的有效方法之一。

電刺激；端側縫合；神經

周圍神經長距離缺損一直是周圍神經修復再生研究領域的難題，其中因暴力等因素導致的神經長段缺損通常無法直接縫合修復[1]。臨床上主要利用神經組織移植或神經移位術作為修復這類長距離損傷的主要手段，但實際上可供選擇的移植神經或動力神經來源十分有限[2]。尤其高平面周圍神經損傷，由于受損神經近端難以利用，而神經再生距離較長、靶器官較遠，使得直接修復無法完成，移位修復效果亦受到影響；為克服這種較為嚴重的損傷狀況，臨床上進行了各種嘗試，其中神經端側縫合是較早進入人們視線的一種術式[3]。神經端側吻合作為一種可行的治療方法，其臨床療效一直存在爭議，目前相關研究的進展相對主要局限于具體手術方式的改進。經皮肌電刺激可以讓肌肉有節律地收縮，維持其正常活動，防止因長期失用導致的廢用性萎縮；為受損神經的修復再生，以及傳導功能的恢復提供寶貴時間和有利條件，上述觀點已被不少臨床研究所證實[4,5]。通過神經端側吻合術后經皮電刺激方法，提高神經端側吻合術后神經的側枝芽生，同時延緩失神經肌肉的萎縮，從而提升了神經端側吻合修復神經損傷的手術療效，并與神經端端吻合效果進行對比。觀察和探討經皮電刺激是否能有效提高神經端側吻合的實際修復效果，為臨床治療長距離周圍神經缺損特別是高平面周圍神經損傷提供更多的參考和依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠32只，體重(250±15)g，7周，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2012-0002]。所有大鼠在南通大學動物實驗中心[SYXK(蘇)2007-0021]動物房常規喂養，隨機分為A組(正常對照組)，B組(肌皮神經損傷后端端吻合至尺神經組)，C組(肌皮神經損傷后端側吻合至尺神經組)，D組(肌皮神經損傷后端側吻合至尺神經+術后經皮電刺激組)，每組8只。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑和儀器

神經絲蛋白200(NF200)抗體(武漢博士德生物工程有限公司，BM0100)；耀洋康達KT-90 A型神經肌肉電刺激儀(北京耀洋康達醫療儀器有限公司，京食藥監械(準)字2014第2260208號)；海鯊NDI-094C型海神肌電圖誘發電位儀(上海海神醫療電子儀器有限公司，粵食藥監械(準)字2011第2210110號)；寧波成和顯微器械一套(寧波市成和顯微器械廠)；Philips CM-120透射電鏡(荷蘭飛利浦公司)；二甲苯、無水乙醇、95%、85%、75%乙醇、磷酸鹽緩沖液(PBS)、蘇木素伊紅染色液等試劑(南京化學試劑一廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 手術方法

C組與D組使用10%水合氯醛作為麻醉劑進行腹腔注射。動物深度麻醉后取右上肢縱形切口，充分游離和暴露尺神經、肌皮神經，鈍性分離胸大肌、胸小肌，進一步解剖尺神經、肌皮神經至外、內側束起始處；隨后切除離起始段約1.5 mm處的尺神經外膜，同時切斷肌皮神經起始段，并將其與尺神經外膜進行縫合，以12-0縫線縫合3針；傷口內撒入青霉素鈉粉末用以預防感染，最后以5-0縫線常規逐層縫合關閉傷口(見圖1)。A組完成神經游離顯露后即關閉創面，作為實驗假手術對照組。B組將肌皮神經與尺神經進行端端吻合，其余操作與C組與D組相同。術后1周，D組大鼠右側上肢用KT-90 A神經肌肉電刺激儀(頻率為2 Hz,波長0.3 ms，電流峰值6～8 mA)給予經皮電刺激；陽極置于右頸處，陰極置于肱二頭肌腹遠端，刺激部位預先備皮脫毛，電極外敷導電糊后緊貼皮膚固定。成功進行經皮電刺激標準：電刺激時右上肢出現明顯二頭肌收縮，但動物無躁動及皮膚灼傷。經皮電刺激每日進行l次，每次30 min，持續6周，動物常規飼養至13周處死。

注：U：尺神經；M:正中神經；MC：肌皮神經。圖1 手術示意圖Note.U: Ulnar nerve；M: Median nerve; MC: Musculocutaneous nerve.Fig.1 Sketch map of the surgical operation

1.3.2 行為學評估及大體觀察

術后每周觀察各組大鼠患側肢體肌力恢復情況。通過在大鼠頭頂部皮膚手術側滴加冰水，觀察大鼠是否出現反射性屈肘、抬高患肢和抓撓頭頂等梳洗動作，據此評估大鼠的屈肘功能恢復情況。另外，通過二次手術肉眼大體觀察吻合神經以及肱二頭肌外觀和形態。

1.3.3 電生理及組織學觀察

術后通過肌電圖檢測肌皮神經傳導速度(nerve conductive velocity，NCV)和肌復合動作電位(compound muscle action potentials，CMAPs)進行電生理學評估。術后13周，室溫下成功腹腔麻醉大鼠并稱重，術區常規備皮、消毒和鋪巾。再次打開右上肢內側縱形切口暴露肌皮神經，小心分離神經旁增生黏連的結締組織，充分游離神經后，進行復合肌動作電位的測定：按Suzuki法把記錄電極前上方45°插入靶肌肱二頭肌中點0.2 cm深，干擾電極放在分離皮膚上，依次把電極放于肌皮神經斷端吻合口遠側和近側，電擊兩次，記錄CMAPs，測量波幅。測量兩次電極刺激位置之間的距離A(mm)及潛伏期差值B(ms)，A/B即可以得到神經傳導速度，單位為 m/s。刺激參數：頻率1.1 Hz，波寬0.2 ms，刺激強度：3.0 mA。

利用免疫組織化學染色觀察神經組織結構，抗神經絲蛋白-200(NF-200)染色特異性標記神經軸突以分析新生神經纖維再生軸突情況，NF-200的陽性信號的多少反映再生神經軸突的數量。

分離完整的肱二頭肌，分析天平上稱量其濕重，濕重比=(實驗側肌濕重/對側肌濕重)× 100%。

取肱二頭肌肌腹中部常規甲醛固定后行石蠟包埋切片，HE染色后用數字圖像分析法計算肱二頭肌肌纖維橫截面積，評價各組大鼠神經纖維的再生情況以及肱二頭肌萎縮和神經重支配狀況。

取吻合口遠端2 mm處神經組織標本，常規戊二醛固定、脫水、樹脂包埋、超薄切片、鋨酸染色后利用透射電鏡進行超微機構的觀察。觀察神經髓鞘再生成熟情況。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 行為學以及大體觀察觀察

各組大鼠術后切口愈合良好，未發生感染，各組大鼠梳洗試驗患肢出現不同程度的活動受限；2周時大鼠患肢屈肘活動較差；第8周時B組、C、D出現好轉。所有神經吻合口處均無神經瘤產生，周緣無明顯疤痕增生卡壓等情況。C組大鼠在第二次手術時可發現吻合口遠端神經明顯變細，肱二頭肌萎縮比較明顯。B組與D組神經大體無明顯區別，肱二頭肌較A組輕度萎縮。

2.2 神經電生理

術后肌皮神經振幅、潛伏期、傳導速度結果見表1，C組和D組大鼠振幅、傳導速度低于A組，潛伏期高于A組；而D組大鼠振幅、傳導速度低于C組，潛伏期高于C組，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 肱二頭肌濕重比及肌纖維橫截面積

各組大鼠肱二頭肌濕重比結果見表2，肌纖維橫截面積結果見表3，HE染色結果見圖2。從結果以及圖像中可見B、C、D三組大鼠肱二頭肌濕重比以及肌纖維橫截面積均低于A組，且C組肌肉恢復最差，差異有顯著性(P< 0.05)。

表1 各組大鼠肌皮神經振幅、潛伏期、神經傳導速度Tab.1 The amplitude, latency and nerve conduction velocity of the musculocutaneous nerve in the rats of each group

注：與A組比較，*P< 0.05；與C組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the group A，*P< 0.05. Compared with the group C,#P< 0.05.

注： A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。圖2 肌纖維橫截面積(HE×200)Note.A:group A. B: group B. C: group C. D: group D.Fig.2 Cross-sectional area of muscle fibers. HE staining表2 各組大鼠肱二頭肌肌濕重比Tab.2 Wet weight ratio of biceps brachii muscle of the rats in each group

組別Groups濕重比WetweightratioA9865±370B8827±538?#C7234±519?D8485±436?#

注：與A組比較，*P< 0.05；與C組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the group A，*P< 0.05. Compared with the group C,#P< 0.05.

表3 各組大鼠肱二頭肌肌纖維橫截面積Tab.3 Transverse sectional area of biceps brachii muscle fibers in the rats of each group

注：與A組比較，*P< 0.05；與C組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the group A，*P< 0.05. Compared with the group C,#P< 0.05

2.4 新生神經纖維軸突增生情況

D組NF-200陽性面積高于C組，但仍明顯低于B組，見表4。從表中可看出，D組NF-200表達明顯強于C組，但仍顯著少于B組，經皮電刺激雖然能顯著提高端側吻合后神經軸突再生能力，但仍與傳統的端端吻合有明顯差距。

表 4 各組大鼠肌皮神經NF-200染色陽性的 面積百分比Tab.4 Ratios of NF-200 positive staining in the musculocutaneous nerve fibers of rats in each group

注：與A組比較，*P< 0.05；與C組比較，#P< 0.05；與B組比較，▲P< 0.05。

Note.Compared with the group A,*P< 0.05. Compared with the group C,#P< 0.05. Compared with the group B,▲P< 0.05.

注：A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。圖3 電鏡檢查結果(×6000)Note.A: group A. B: group B. C: group C. D: group D.Fig.3 Ultrastructural changes of the nerve fibers

2.5 電鏡結果

電鏡檢查顯示B組神經軸突結構發育良好，神經中絲、微管與線粒體較豐富，神經纖維髓鞘成熟；C組雪旺細胞增生活躍，可見到新生的軸突及其散在分布、薄而不整的髓鞘，部分髓鞘形成同心圓板層結構；D組有明顯的神經束結構，髓鞘厚度接近正常。電鏡檢查顯示B組神經纖維髓鞘成熟，C組以無髓神經纖維為主，髓鞘成熟度差。D組髓鞘增生情況較C組好轉，但仍有部分無髓神經纖維存在。

3 討論

神經端側吻合給臨床修復長段周圍神經缺損尤其高位神經損傷提供了一個可能的解決方法，但是神經端側縫合和端端縫合修復結果是否等效，實驗結果是否代表臨床治療效果，仍存在廣泛的爭論[6,7]。研究表明，端側縫合可以達到端端縫合神經再生能力的約76%～80%，為正常的55%～70%[8,9]。另一些實驗結果卻恰恰相反，神經端側吻合后側枝萌出神經纖維數量極少[10,11]。結果顯示，神經端側吻合術后，主干神經確有側枝萌出通過吻合口長入肌皮神經，但與神經端端吻合相比有明顯差距。神經絲蛋白(NF)是構成神經細胞軸突中間絲的蛋白質，常作為軸突特異性標志之一，主要由NF-L、NF-M、NL-H三種特定的蛋白亞基組裝而成，為神經纖維提供彈性防止斷裂[12]。NF-200表達水平可間接反映神經軸突損傷再生程度；其表達越強，表示神經纖維越多，說明神經再生良好[13,14]。實驗結果表明，B組NF-200表達明顯強于C組，其結果有顯著性差異，證明端端吻合術后神經軸突的恢復效果明顯優于端側吻合，這與之前的一些報道相一致。通過電鏡進行再生神經組織的超微結構觀察，可以看出C組神經髓鞘結構不完整，神經纖維髓鞘成熟度差，見部分無髓神經纖維。組織學的差距相應反應到實際生理功能，導致C組電生理指標也與B組有明顯差距。綜合所有觀察指標，神經端側吻合術后確有神經側枝萌出，但實際的效果仍與端端吻合存在一定差距。

多年來，國內外學者通過大量的研究，已經證實了電刺激的促進神經再生作用[15]。研究采用更容易在臨床中實踐應用的經皮電刺激方法，通過組織學以及電生理等技術手段檢測；結果顯示經皮電刺激能有效促進端側吻合后側枝神經萌出，促進側枝神經萌出后的髓鞘成熟，但其與神經端端吻合的再生結果相比仍有一定差距。同時，經皮電刺激能顯著緩解肌肉的失神經性萎縮，經皮電刺激組術后的肱二頭肌組織學指標與端端吻合組無明顯差異，證實經皮電刺激在防止失神經性肌肉萎縮方面作用較大，從而為神經對于靶肌的再支配創造有利條件。因此，提高神經端側吻合的實際臨床修復效果，側重點在于努力提高神經側枝萌出數量，提高側枝萌出后神經纖維髓鞘的成熟度；可以考慮經皮電刺激的基礎上，通過改善神經吻合技術、改善局部神經再生微環境等途徑進一步提高神經端側吻合后側枝萌出的效率，配合電刺激對靶肌萎縮的保護作用，不失為一個有價值的臨床周圍神經損傷修復的選擇。

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Promotingeffectofpercutaneouselectricalstimulationonnerveregenerationafterend-to-sideneurorrhaphyinrats

SUN Qian， CAO Qun-hua， ZHU Wei， MEI Yuan-dong， GU Chen

(Department of Hand and Foot Surgery, the Second People’ s Hospital of Changshou City, Changshu 215500, China)

ObjectiveTo observe and explore the effect and clinical value of percutaneous electrical stimulation on nerve regeneration after end-to-side neurorrhaphy in rats.MethodsThirty-two SPF male S-D rats were randomly divided into four groups (n=8): group A, the normal control group; group B, with end to end neurorrhaphy of musculocutaneous nerve injury matched to the ulnar nerve; group C, with end to side neurorrhaphy of musculocutaneous nerve injury matched to the ulnar group; and group D, with end to side neurorrhaphy of musculocutaneous nerve injury matched to the ulnar nerve plus postoperative transcutaneous electrical stimulation (30 min per day for 6 weeks). Electromyography, postoperational nerve conduction velocity, the histological and ultrastructural changes of the nerve fibers were examined, and NF-200 expression in frozen sections was observed using imunohistological staining, to assess the recovery of muscle strength of the diseased side limb and the neuroregeneration in the rats after treatment.ResultsThe amplitude and conduction velocity of the groups C and D were lower than that of the group A, the latency was higher than that of the group A, while the amplitude and conduction velocity of the group D were lower than that of the group C, and the latency was higher than that of the group C. The wet weight ratio of the biceps brachii muscle and the cross-sectional area of muscle fibers in the groups B, C and D were lower than those in the group A, and the recovery of muscle in the group C was the worst. The expression of NF-200 in the rats of groups B, C and D was significantly lower than that in the group A, and the expression of NF-200 in the group D was significantly higher than that in the group C, but still significantly less than that in the group B (P< 0.05). Electron microscopy showed mature myelinated fibers in the group B, whereas unmyelinated fibers were the main component and the myelin sheath was poorly developed in the group C. The myelin regeneration in the group D was better than that in the group C, but still some unmyelinated nerve fibers were seen.ConclusionsThe percutaneous electrical stimulation can effectively promote nerve axonal regeneration and can delay the atrophy of the target muscle after end-to-side neurorrhaphy. Though there is difference compared with the end-to-end neurorrhaphy, the end-to-side neurorrhaphy is still an effective method in clinical repair of peripheral nerve injury.

Rat; Peripheral nerve injury; End to side neurorrhaphy; End to end neurorraphy; Neuroregeneration; Electrical stimulation; Histology; Electron microscopy

常熟市科技計劃項目任務書(csws201302)。

孫乾(1979-)，男，碩士生，主治醫師，研究方向：周圍神經損傷。E-mail： sunqian1528sqywx@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0073-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.013

2017-04-07