6-羥基多巴模型大鼠salsolinol氮甲基轉移酶活性檢測

張鎮松，柯 酩，鄧玉林*

(1.中國科學院生態環境研究中心，北京 100085； 2.北京理工大學生命學院，北京 100081)

6-羥基多巴模型大鼠salsolinol氮甲基轉移酶活性檢測

張鎮松1，柯 酩2，鄧玉林2*

(1.中國科學院生態環境研究中心，北京 100085； 2.北京理工大學生命學院，北京 100081)

研究報告

目的應用6-羥基多巴(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)制作帕金森病(Parkinson’ s disease，PD)大鼠模型，并對大鼠外周血淋巴細胞中salsolinol氮甲基轉移酶(SNMT)的活性進行測定。方法利用單側雙點注射6-OHDA損毀大鼠紋狀體，構建PD模型并對模型進行行為學評價；從模型大鼠外周血淋巴細胞中提取SNMT粗酶液，建立酶反應產物N-methyl-salsolinol(NMSal)的高效液相色譜串聯三重四極桿質譜檢測方法，以NMSal的生成量表征SNMT的活性。結果18只經過6-OHDA注射的大鼠共有7只經阿樸嗎啡誘導后表現為恒定向未損毀側旋轉(>7 r/min)，建模成功率為38.9%。建立了基于多反應監測技術的SNMT活性的高選擇性、高靈敏度、高重復性的表征方法。該方法中NMSal的檢出限和定量限分別達到49 pmol/L和98 pmol/L，日內和日間精密度均在6.0%以下。檢測結果顯示PD組大鼠外周血淋巴細胞中SNMT的活性與假手術組、正常組相比差異有顯著性(P< 0.01，n=5)，而正常組和假手術組之間差異無顯著性(P> 0.05，n=5)。結論外周血淋巴細胞中SNMT活性可能反映出PD發病狀況，有望成為診斷的指標之一。

Salsolinol氮甲基轉移酶；帕金森?。?-羥基多巴；外周血淋巴細胞；高效液相色譜串聯三重四極桿質譜

帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是一種與遺傳和環境因素相關的中老年神經系統變性疾病，主要臨床特征為靜止性震顫、肌強直、運動和認知功能障礙等[1]。該病平均發病年齡55歲，并隨年齡增加發病率呈上升趨勢。PD確切的發病機制尚未完全清楚。

自從MPTP(1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶)[2]等外源性神經毒素被報道能誘發產生PD相似癥狀之后，探尋自身存在且結構與MPTP相似的內源性神經毒素一直是PD的研究熱點。其中兒茶酚異喹啉類物質salsolinol[3](1-甲基-6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉，Sal)及其衍生物N-methyl-salsolinol(6,7-二羥基-1,2-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉，NMSal)可作為內源性神經毒素導致神經元特異性死亡，產生PD癥狀[4]。NMSal通過Sal氮甲基轉移酶(salsolinol N-methyltransferase，SNMT)催化Sal吡啶環的N位甲基化生成(如圖1所示)，這個氮甲基化的酶反應在體內和體外得到了證明。依據催化條件的不同，SNMT可分為中性SNMT和堿性SNMT，在紋狀體區可以檢測到中性SNMT活性[5-7]，說明只有中性SNMT與PD相關。SNMT催化Sal生成的NMSal可以引起線粒體功能紊亂和細胞凋亡，并可導致Wistar大鼠出現帕金森病[8]。據此可知，SNMT是Sal代謝過程中導致神經毒性顯著增加的關鍵致病因子，可能在PD發病過程中起到重要作用。

圖1 SNMT催化Sal生成NMSal的反應方程式Fig.1 The reaction equation of N-methyl-salsolinol from salsolinol catalyzed by SNMT

目前關于SNMT的分子生物學研究并不多見，為表征PD病人外周血淋巴細胞中SNMT活性，尋找PD診斷的潛在生物標志物，本文通過6-羥基多巴(6-OHDA)雙點注射單側損毀大鼠紋狀體構建PD模型，從大鼠外周血分離的淋巴細胞中提取出SNMT粗酶液。由于粗酶液中SNMT濃度極低，因此對酶活測定方法的靈敏度要求很高。為此建立以多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)技術為基礎的高效液相色譜串聯電噴霧離子化三重四極桿質譜(HPLC-ESI-QQQ)的SNMT活性測定方法。該方法通過MRM母離子-子離子雙重選擇，可有效排除其他不關注的干擾離子，使目標物的信噪比大幅提高，既提高定性結果的特異性，又提高定量結果的靈敏度。通過對6-OHDA誘導的PD模型大鼠外周血淋巴細胞中的SNMT活性進行檢測，可為PD的診斷提供一定的實驗參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠，2～3月齡，體重(200±20 g)，購于中國醫學科學院實驗動物研究所[SCXK(京)2005-0013]，飼養于北京理工大學動物實驗室[SYXK(京)2012-0035]。36只大鼠隨機分成PD組18只、假手術組9只和正常組9只。飼養條件：單獨隔離籠具飼養，溫度控制在18～21℃，濕度大于40%，自由進食進水，每隔一天換一次木屑墊料。實驗均按實驗動物使用與管理規范給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

6-OHDA、抗壞血酸、戊巴比妥鈉、異丙基腎上腺素(isoproterenol，Isop)、阿樸嗎啡(apomorphine, APO)、N-methyl-(R)-salsolinolhydrobromide、S-腺苷甲硫氨酸(甲基供體，SAM)、和Ro 41-0960均購于美國Sigma公司；大鼠淋巴細胞分離液購于北京索萊寶科技有限公司；甲醇等色譜純的有機試劑購自美國Fisher公司；Sal由本實驗室合成并純化；其他分析純化學試劑均從北京化學試劑公司訂購。

日本Narishige立體定位儀、牙科鉆；日本Hitachi CR21G2高速離心機；美國Agilent 1290高效液相色譜；美國Agilent 6460三重四級桿質譜。

1.3 實驗方法

1.3.1 單側雙點注射6-OHDA損毀紋狀體

腹腔注射質量分數為1%的戊巴比妥鈉溶液深度麻醉大鼠，嚴格顱平位固定大鼠腦顱于立體定位儀上，剃除頭頂部毛發，于頭顱中部切開大鼠頭皮以及筋膜，用3% 雙氧水消化骨膜，以暴露出前囟。參照Paxinos等[9]大鼠腦立體定位圖譜，確立右側紋狀體雙點法注射坐標。注射坐標之一：前囟后0.2 mm，中線右側2.6 mm，硬膜下6.0 mm；注射坐標之二：前囟前0.7 mm，中線右側3.0 mm，硬膜下4.5 mm。用牙科鉆小心鉆透顱骨，將微量注射器緩慢進針到預定深度，PD組大鼠分別在兩個坐標處向右側紋狀體注射6-OHDA 10 μg(溶于5 μL含0.2%抗壞血酸的生理鹽水)，假手術組大鼠分別在兩個坐標處向右側紋狀體注射抗壞血酸10 μg(溶于5 μL含0.2%抗壞血酸的生理鹽水)，正常組不進行任何處理。注射速度1 μL/min。留針5 min后退針，用牙科膠覆蓋鉆孔，縫合傷口。

1.3.2 行為學評價

6-OHDA立體定位注射4周后對大鼠進行腹腔注射APO(0.5 mg/kg)，10 min后放入塑料臉盆中觀察并記錄大鼠40 min內首尾相接旋轉的圈數。若大鼠恒定向未損毀側(左側)旋轉，且平均每分鐘旋轉圈數大于7圈，可視為建模成功；若大鼠沒有旋轉行為、旋轉方向無規律、恒定轉向損毀側(右側)或以小于7 r/min轉速轉向左側，則視為建模不成功。旋轉行為測試從6-OHDA注射手術后第4周開始連續測試3次，每周一次。

1.3.3 SNMT粗酶液制備制備

單側損毀手術后第6周，對正常組、假手術組和行為學評價成功的PD組大鼠進行腹腔注射1%(質量分數)戊巴比妥鈉溶液深度麻醉，然后解剖胸腔，從大鼠心臟中抽取新鮮血液緩慢鋪在預先加有淋巴分離液的離心管中。2000 r/min離心30 min后，吸取中間的白色淋巴細胞層，轉移到另一離心管中，用PBS緩沖液反復沖洗干凈后，用液氮多次凍融破碎淋巴細胞，高速低溫離心40 min后吸取少量上清液用Bradford法測蛋白濃度，其余上清液作為SNMT粗酶液。

1.3.4 酶反應條件

本文設置對照組，以扣除酶反應底物中參雜的NMSal以及大鼠腦中內源性的NMSal的干擾。對照組中SNMT粗酶液預先在95℃水中維持10 min以使SNMT失活，其余操作同酶反應組。酶反應組和對照組按表1所示條件添加反應試劑混勻，37℃恒溫條件下放置30 min后，加入25 μL 2 mol/L高氯酸溶液(含0.25% Vc防止反應產物NMSal被氧化)終止酶反應，加入25 μL 30 nmol/L Isop作為內標，混勻后置于17 000 g條件下低溫離心30 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC-ESI-QQQ檢測。

1.3.5 色譜條件

固定相：Discovery?HS F5五氟苯基色譜柱(4.6 mm直徑×100 mm, 孔徑5 μm)；流動相A：10 mmol/L甲酸銨溶液，pH值為4；流動相B：甲醇。B相梯度變化時間表：0～5 min: 25% B; 5～15 min:25%～90% B; 15～19 min: 90% B; 19～21 min: 90%～25% B; 21～26 min: 25% B；柱溫：30℃；樣品溫度：4℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：15 μL。

1.3.6 質譜條件

離子源：ESI正離子模式；對NMSal和Isop的特征離子對、毛細管出口電壓和碰撞能量參數設置如表2所示。

表1 酶反應組和對照組反應條件Tab.1 Conditions of the enzyme reaction group and control group

注：“√”表示添加；“*”表示預先在95℃水中維持10 min。

Note.“√”means reagents added; “*” means the supernatant was incubated in water at 95℃ for 10 min before added into the reaction system.

表2 NMSal和Isop的MRM參數Tab.2 MRM parameters of NMSal and Isop

1.3.7 SNMT活性定量檢測

根據上述色譜、質譜條件對酶反應組和對照組中NMSal含量進行HPLC-ESI-QQQ檢測，以二者差值作為酶反應產物的生成量，用每毫克蛋白每小時催化生成反應產物NMSal的量作為SNMT活性單位pmol/(h·mg)，分別對PD組、假手術對照組和正常組大鼠外周血淋巴細胞中SNMT的活性進行表征。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 6-OHDA模型大鼠行為學評價

動物的行為學變化是評價6-OHDA模型是否成功的可靠標志。在鼠腦大腦紋狀體單側注射6-OHDA造成損害，導致兩側大腦半球機能不對稱。當中樞神經系統多巴胺能神經元缺失90%以上時，突觸后膜多巴胺受體出現超敏現象。APO是突觸后膜D2受體激動劑，可誘導模型大鼠出現向健側的旋轉行為，其旋轉次數與神經元數目成反比。因此，可利用APO誘導進行PD大鼠旋轉行為測試[10]。

注射6-OHDA兩周后發現PD組部分大鼠出現尾巴及四肢震顫、僵化等現象、還伴有翻滾、拱背、壓尾、扒背、頭部靜止性震顫、躁動、肢體強直、僵直性轉頭動作等異常行為，偶有抽搐表現(圖2)。建模手術4周后連續3周對正常組、假手術組及PD組大鼠腹腔注射APO，觀察記錄大鼠的旋轉行為，測試結果如表3所示。18只經過6-OHDA誘導的PD組大鼠中，共有7只連續2周40 min內恒向旋轉速率>7 r/min，建模成功率達到38.9%。正常組和假手術組進行平行測試，發現注射APO后40 min內無明顯轉圈行為發生。

2.2 背景基質中內源性NMSal、Isop考察

為了讓標準曲線工作液盡可能地反映成分復雜的生物樣品的真實信息，使酶反應產物NSMal的定量結果更為可靠，本研究中以正常大鼠外周血淋巴細胞SNMT粗酶液作為生物背景基質溶液，再往溶液中添加內標Isop和NMSal的標準品來配制用于NMSal定量的標準曲線工作液。Zhang等[11]直接使用純水稀釋NMSal配制標準曲線工作液，可能導致標準溶液與實際樣品中NMSal的保留時間存在偏差，造成NMSal假陽性的定性結果。對生物背景基質溶液中的內源性NMSal和Isop進行考察。取正常大鼠外周血淋巴細胞SNMT粗酶液在17 000 g條件下低溫離心30 min以除去沉淀，再用0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC-ESI-QQQ檢測，結果顯示從大鼠外周血淋巴細胞中提取的SNMT粗酶液含有極少量NMSal(圖3 A)，而Isop在檢出限以下(圖3B)。說明生物背景基質中并無Isop干擾物的存在，可以選取Isop作為NMSal定量的內標。

用6 mol/LNaOH調節正常大鼠外周血淋巴細胞SNMT粗酶液pH值至12，并在室溫中放置24 h后用甲酸調節pH值至4，于17 000 g低溫條件下離心30 min，濾膜過濾后進行HPLC-ESI-QQQ檢測。結果顯示(圖4)，SNMT粗酶液中檢測不到NMSal和Isop的存在，說明強堿處理法能夠有效去除內源性NMSal等物質，可用此方法制備標準曲線工作液。

注：(A)尾巴僵化；(B)翻身；(C)壓尾。圖2 APO誘導后大鼠行為表現。Note.(A) Tail rigidity; (B) Turning over; (C) Stressing tail.Fig.2 Behavioral performance of the APO-induced rats表3 APO誘導后大鼠旋轉實驗結果Tab.3 Results of rotation test of the APO-induced rats

APO誘導次數TimesofinductionbyAPO旋轉速率>7r/min的大鼠數量Numberofratswithrotationrateofmorethan7r/min平均旋轉速率(r/min)Averagerotationrate1597±1427135±2737142±28

圖3 SNMT粗酶液中NMSal和Isop的HPLC-ESI-QQQ提取色譜圖Fig.3 HPLC-ESI-QQQ extracted chromatograms of NMSal and Isop in the supernatant containing SNMT

圖4 強堿處理后NMSal及Isop的HPLC-ESI-QQQ提取色譜圖Fig.4 HPLC-ESI-QQQ extracted chromatograms of NMSal and Isop after alkali treatment

2.3 NMSal標準曲線及線性范圍、最低檢出限和最低定量限

用生物背景基質溶液(強堿處理后，下同)配制100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L(依此等比遞減至24.4 pmol/L)等13個不同濃度NMSal的標準曲線工作液，其中內標物Isop的濃度均為10 nmol/L。對標準曲線工作液進行HPLC-ESI-QQQ分析，以NMSal和Isop的濃度比為橫坐標、峰面積比為縱坐標，進行線性回歸，得到線性方程。其線性系數、線性范圍、檢出限和定量限如表4所示。

表4 NMSal線性方程、線性系數、線性范圍、檢出限和定量限Tab.4 The calibration curve, coefficient, range, LOD and LQD of NMSal

表5 HPLC-ESI-QQQ測定SNMT活性的精密度Tab.5 The precision of SNMT activity determined by HPLC-ESI-QQQ

2.4 精密度考察

對取自同一酶原的樣品平行6次進行酶反應后，以酶反應組和對照組中NMSal含量的差值作為酶反應產物的生成量，用每毫克蛋白每小時催化Sal生成產物NMSal的量pmol/(h·mg)作為酶活性單位，對SNMT的活性進行HPLC-ESI-QQQ檢測，結果表明該方法具有良好的精密度，日內和日間精密度均在6.0%范圍內(見表5)。

2.5 6-OHDA誘導的PD模型大鼠SNMT活性的檢測

按上述建立的方法，對正常組、假手術組和PD組大鼠外周血淋巴細胞中的SNMT進行酶活性測定。如圖5所示，正常組、假手術組和PD組大鼠外周血淋巴細胞中SNMT活性分別為(2.16±5.82)、(0.58±2.32)、(43.37±9.49) pmol/(h·mg)。PD組SNMT活性分別是假手術組和正常組的74.8倍和20.0倍，差異有顯著性(P< 0.01)，而正常組和假手術組之間差異無顯著性(P> 0.05)。

注：與正常組、假手術組比，* P<0.01。圖5 正常組、假手術組和PD組大鼠外周 血液淋巴細胞中SNMT的活性(n=5)Note.Compared with the normal and sham-operated groups,* P<0.01.Fig.5 SNMT activity in peripheral lymphocytes from the normal, sham-operated and PD groups

3 討論

6-OHDA單側損毀大鼠模型是目前研究PD發病過程和篩選治療藥物最常用的模型之一，其過程呈慢性漸進式改變，通過逆向軸漿運輸將6-OHDA運輸至黑質致密部引起黑質多巴胺能神經元變性死亡，可模擬PD中、早期發病癥狀[12]。Zhang所用模型為大鼠腦黑質致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)定點注射6-OHDA，SNpc定點注射12 h后即出現約90%的多巴胺細胞丟失，稱為“急性完全損毀”模型，該模型大鼠易死于不能取食和渴感缺乏等并發癥[13]，更適用于模擬晚期PD癥狀。為表征PD患者外周血淋巴細胞中SNMT活性，尋找PD早期診斷的潛在生物標志物，實驗通過單側紋狀體雙點注射6-OHDA制備PD大鼠模型。模型的行為學評價結果顯示，18只經過6-OHDA誘導的大鼠中共有7只通過行為學評價，模型建模成功率比較低的主要原因是鼠腦紋狀體體積較小，造成定位注射準確率降低。

關于SNMT活性的檢測目前報道的方法主要有高效液相色譜串聯電化學檢測器(HPLC-ECD)[14,15]和高效液相色譜串聯電噴霧離子化飛行時間質譜(HPLC-ESI-TOF)[11,16]等，實驗開發了基于多反應監測模式(MRM)的SNMT活性的高選擇性、高靈敏度、高重復性的檢測方法。該方法通過MRM技術的子母兩級離子選擇，有效排除了復雜生物樣品中在同一保留時間共流出的其他離子的干擾，使復雜生物樣品的質譜檢測背景和假陽性率顯著降低，目標化合物的信噪比顯著提高，能夠滿足HPLC-ECD或HPLC-ESI-TOF等其他檢測方法難以達到的高靈敏度要求。該方法中NMSal的檢出限低達49 pmol/L，靈敏度與竇凱飛等[17]建立的HPLC-ECD檢測方法相比提高約2個數量級。Zhang[11]、牟曉玲[18]等建立的HPLC-ESI-TOF檢測方法利用高效液相色譜的保留時間性質和飛行時間質譜的高分辨率特性對NMSal進行定性，以及高效液相色譜電噴霧離子化飛行時間質譜(HPLC-ESI-TOF)儀器的提取離子流色譜圖(extracted ion chromatograms，EIC)對NMSal進行定量。因生物樣品的復雜性，該方法容易造成NMSal定性結果的假陽性，而本文建立的HPLC-ESI-QQQ方法采用MRM定量模式，可通過特征離子對(MRM transitions)排除與待測物相同質荷比的子離子共流出對待測物定量造成的干擾，其高選擇性的優勢是HPLC-ECD和HPLC-ESI-TOF等方法無法比擬的，其靈敏度也比HPLC-ESI-TOF方法高約3個數量級。

PD主要病理特征為中腦黑質多巴胺能神經元的大量缺失以及殘存的神經元中形成路易小體，典型的臨床運動癥狀通常只在病人黑質多巴胺能神經元缺失一半、紋狀體中多巴胺分泌減少80%以上時才表現出來，而早期臨床癥狀并不典型且較隱蔽，因此容易被誤診或漏診。目前關于PD的早期診斷主要依靠功能影像學成像技術和尋找生物標志物兩方面。有研究表明血清中C3c補體及相關蛋白有望作為PD診斷的生物標志物[19]；在散發PD病人CSF中Dj-1基因水平升高，是PD在基因水平上潛在的診斷標志物[20]；以8-羥基-2-鳥核苷酸作為DNA氧化損傷的指標，也可能是PD的臨床診斷生物標志物[21]；另有研究發現PD病人血漿中α-synuclein含量降低[22]，但仍處在實驗初級階段。本文對6-OHDA誘導的PD模型大鼠外周血淋巴細胞中的SNMT活性進行表征，結果發現PD模型組大鼠SNMT活性顯著升高。與Zhang等測得的大鼠外周血淋巴細胞中SNMT的活性相比數值小了約3個數量級，分析其原因，除了所建的模型不同之外，可能是Zhang等在酶反應步驟并沒有設置對照組以扣除酶反應底物中可能含有的NMSal以及大鼠腦中內源性的NMSal的干擾，故造成SNMT的活性檢測結果偏大。實驗結果提示以外周血淋巴細胞中SNMT活性為考察對象，可為利用PD大鼠模型篩選潛在的生物標志物提供初期的實驗依據。

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DeterminationofsalsolinolN-methyltransferaseactivityin6-OHDA-lesionedrats

ZHANG Zhen-song1， KE Ming2， DENG Yu-lin2*

(1.Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China； 2.School of Life Sciences，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081)

ObjectiveThe aim of this study was to establish a rat model of Parkinson’ s disease (PD) by using 6-hydroxydopamine (6-OHDA) and detect the salsolinol N-methyltransferase (SNMT) activity in peripheral lymphocytes of PD rats for the development of a biomarker for early diagnosis of PD.MethodsRat model of PD was established by unilateral double-pointed injection of 6-OHDA into the striatum and was verified by behavior observation. An analytical method was developed based on multiple reaction monitoring with HPLC-ESI-QQQ to determine the SNMT activity in peripheral lymphocytes.ResultsSeven of 18 rats injected with 6-OHDA showed steadily apomorphine-induced rotation (>7 r/min). The success rate was 38.9%. A sensitive and stable quantitative method with internal standard added was created, based on multiple reaction monitoring mode to analyze SNMT activity. The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LQD) of N-methyl-salsolinol, which is the product of Salsolinol catalyzed by SNMT, were 49 pmol/L and 98 pmol/L, respectively. The precisions of intra-day and inter-day assays both were below 6.0%. SNMT activity of peripheral lymphocytes in the 6-OHDA-lesioned rats was significantly increased [43.37±9.49 pmol/(h·mg)NMSal] in comparison with that in the normal group [2.16±5.82 pmol/(h·mg)NMSal] and the sham-operated group [0.58±2.32 pmol/(h·mg)NMSal](P< 0.01,n=5). There was no significant difference between the normal group and sham-operated group (P< 0.05,n=5).ConclusionsOur results indicate that SNMT activity may reflect the changes in the course of Parkison’ s disease and may become a potential clinical biomarker in diagnosis of this disease.

Salsolinol N-methyltransferase; Parkinson’s disease; 6-OHDA; Peripheral lymphocytes; HPLC-ESI-QQQ

張鎮松(1987-)，男，碩士生，助理工程師，研究方向：生物化學與分子生物學。E-mail： zszhang@rcees.ac.cn

鄧玉林(1962-)，男，博士生，教授，研究方向：神經生物學。E-mail： deng@bit.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0084-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.015

2017-04-12