聚羥基丁酸酯/聚乙二醇納米復合支架的生物相容性研究

王譯婕，王 潔，萬婉婷，杜嬋媛，白樂康，鄒 蕊

(1.西安交通大學口腔醫學院陜西省顱頜面精準醫學研究重點實驗室 陜西 西安 710004；2.西安交通大學口腔醫學院口腔正畸科 陜西 西安 710004；3.陜西中醫藥大學附屬醫院 陜西 咸陽 712000；4.西安交通大學口腔醫學院口腔修復科 陜西 西安 710004)

聚羥基丁酸酯/聚乙二醇納米復合支架的生物相容性研究

王譯婕1,2，王 潔3，萬婉婷1,2，杜嬋媛1,2，白樂康4，鄒 蕊1,2

(1.西安交通大學口腔醫學院陜西省顱頜面精準醫學研究重點實驗室 陜西 西安 710004；2.西安交通大學口腔醫學院口腔正畸科 陜西 西安 710004；3.陜西中醫藥大學附屬醫院 陜西 咸陽 712000；4.西安交通大學口腔醫學院口腔修復科 陜西 西安 710004)

目的：采用聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)/聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)納米復合生物材料構建三維培養支架并與大鼠髁突軟骨細胞(condylar chondrocytes)復合培養，評價其生物相容性。方法：應用靜電紡絲法制備PHB/PEG納米復合生物支架，將大鼠髁突軟骨細胞接種于PHB/PEG支架上，分別于復合培養4h，72h時利用熒光顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察細胞在三維支架上的粘附、鋪展及生長情況，并應用MTT四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法檢測細胞的增殖活性，評價其生物相容性。結果：熒光顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察顯示復合培養4h時細胞已粘附于支架表面，部分細胞開始鋪展，培養72h細胞在支架表面增殖及生長良好，MTT結果顯示PHB/PEG納米三維支架復合培養大鼠髁突軟骨細胞較對照組具有更高的增殖活性。結論：靜電紡絲法制備的PHB/PEG納米復合生物支架可以促進大鼠髁突軟骨細胞的粘附、生長和增殖，具有良好生物相容性，為組織工程軟骨再生奠定一定的實驗基礎。

髁突軟骨細胞；PHB/PEG納米支架；復合培養；生物相容性

髁突軟骨是口腔顳下頜關節的重要結構，是一種特化的、具有負重功能的結締組織，也是下頜骨主要生長中心之一，可承受機械振蕩刺激并將該刺激均勻傳遞至下方區域的骨組織[1]。正常范圍的力學刺激有助于維持關節軟骨結構和功能的完整性，髁突軟骨作為一種繼發性軟骨，其發育后的繼續生長與功能負荷密切相關，而這一生物學特性是口腔正畸功能矯形及修復咬合重建治療的基礎[2-3]。髁突軟骨細胞是關節軟骨的主要功能成分，為了維持體外培養細胞表型以及生物學特性穩定，選擇合適的支架材料對其進行三維培養成為目前國內外的研究熱點。眾所周知，生理性應力對細胞的作用是通過改變細胞生長的三維微環境而實現的，細胞外基質微環境的空間物理結構顯著影響細胞增殖分化及功能表達[4-5]。傳統二維培養模式下細胞無重疊的分布方式在很大程度上簡化和忽略了力學信號轉導過程中細胞間、細胞和細胞外基質間的協同作用及相互依賴性，并不能在體外精準模擬在體組織三維空間環境變化。隨著實驗方法的改進及研究內容的不斷深化，細胞力學實驗已逐漸由早期二維細胞力學實驗向生物支架復合細胞三維力學加載過渡[6-7]，從而獲得與在體情況更加接近的體外細胞力學實驗模型，以期更加接近臨床問題的力學實質。本研究應用靜電紡絲法構建三維力學加載支架，并與大鼠髁突軟骨細胞復合培養，研究PHB/PEG三維支架的生物相容性，為最終揭示三維培養細胞的力學信號轉導機制及構建組織工程髁突軟骨提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：SD乳鼠12只，出生后3～5d，雌雄不限(西安交通大學醫學院動物醫學中心提供)。

1.2 實驗試劑：高糖DMEM培養基(Gibco Co,USA)；胎牛血清(Gibco Co,USA)；青鏈霉素(Gibco Co,USA)，Ⅱ型膠原酶(Gibco Co,USA)；0.25％胰蛋白酶(Gibco Co,USA)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma,USA)；孔板(Coning,USA)；細胞培養皿(Coning,USA)；PBA液，PBS液等自行配制。

1.3 儀器和設備：掃描電子顯微鏡(Hitachi，TM-1000)；酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad公司)；倒置相差顯微鏡及照相系統(OLYMPUS FSX100)。

1.4 實驗方法

1.4.1 PHB/PEG三維生物支架的制備：將2.7g PHB、0.3g PEG溶解于45ml三氯甲烷并磁力攪拌12h使其充分溶解，再與5ml二甲基甲酰胺(DMF)混合均勻制備PHB/PEG紡絲溶液。利用自組建的靜電紡絲設備，以15kV電壓將PHB/PEG紡絲溶液以1.2ml/h的流速噴射出形成紡絲纖維。噴絲頭方向垂直于接收屏，且噴絲頭和接收屏之間紡絲距離約15cm，靜電紡絲時間大約1h，從而制得薄膜狀的多孔三維立體的支架材料。

1.4.2 髁突軟骨細胞培養及生物學鑒定：選擇出生3～5d的大鼠乳鼠進行髁突軟骨細胞的原代培養，取第三代髁突軟骨細胞行甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學染色。

1.4.3 大鼠髁突軟骨細胞在PHB/PEG支架上的接種培養：取第三代大鼠髁突軟骨細胞加2ml 0.25％胰蛋白酶37℃消化2～3min，以生長培養基終止消化，稀釋后反復吹打成細胞懸液，以l×l05/ml密度接種于24孔板內的PHB/PEG支架上，每孔1ml，復合培養。

1.4.4 復合培養細胞熒光顯微鏡觀察：4h、72h后將上述復合培養的PHB膜從孔板中取出，置于載玻片上，滴加熒光染色劑，立即于熒光倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4.5 復合培養細胞掃描電鏡觀察：4h、72h后將上述復合培養PHB膜從孔板中取出，固定，室溫過夜，送檢、制樣、觀察。

1.4.6 MTT比色法檢測大鼠髁突軟骨細胞的增殖生長狀態：將上述復合培養細胞及相同條件下的細胞培養板上的髁突軟骨細胞，分別培養ld、3d、5d、7d后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)100μl，37℃環境下孵育4h。將孔內液體吸出，每孔加入600μl 二甲基亞砜(DMSO)，即出現藍紫色產物，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。吸出藍紫色液體后，將其加入96孔板，實驗組和對照組各選3孔，每孔200μl。在酶聯免疫檢測儀上選擇490nm波長，測定各孔吸收值，記錄結果，以時間(d)為橫軸，光吸收值(OD值)為縱軸繪制細胞生長曲線，設空白對照。

通過以上方法與普通單層方法培養細胞進行對比，分析PHB/PEG復合納米纖維支架材料的細胞相容性。

1.5 統計學分析：采用SPSS 19.0軟件包，對MTT結果重復測量數據行方差分析。

2 結果

2.1 大鼠髁突軟骨細胞的生物學特性鑒定結果：第三代軟骨細胞甲苯胺藍染色觀察，絕大部分呈多角形，胞漿內呈紫紅色異染顆粒，細胞周圍有少量異染顆粒出現(圖1A)；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陽性結果，胞漿被染成棕黃色(圖1B)。

2.2 熒光染色法觀察細胞在三維支架上的生長：將大鼠髁突軟骨細胞與PHB/PEG三維生物支架復合培養4h熒光染色，熒光顯微鏡下清晰可見亮染細胞核分布于支架表面及支架之間，部分細胞已開始鋪展；72h鏡下可見細胞明顯鋪展生長，細胞核亮染而且數目明顯增多，細胞開始分裂增殖(圖2)。

圖2 熒光顯微鏡下細胞支架復合培養結果

2.3 掃描電鏡(SEM)觀察細胞在支架復合體上的生長狀態：大鼠髁突軟骨細胞與PHB/PEG三維生物支架復合培養4h，掃描鏡下觀察可見，PHB/PEG三維支架表面及支架內上散在大量的髁突軟骨細胞(圖3A)，多數細胞開始粘附在支架表面呈球狀，有部分細胞開始伸出偽足(圖3B)。復合培養72h，整個PHB/PEG支架表面可見密集排列的細胞，與培養4h相比，細胞數量明顯增多，并已在支架表面增殖、鋪展，相互重疊(圖3C)。高倍鏡下可見細胞開始跨越多孔結構的支架孔隙和間隔，覆蓋于支架材料表面。有些地方可見增生的髁突軟骨細胞幾乎完全包裹纖維支架，有部分細胞偽足伸入支架孔隙內部生長(圖3D)。

圖3 掃描電子顯微鏡下髁突軟骨細胞與PHB/PEG支架復合培養

2.4 細胞增殖活性檢測結果：MTT結果表明(圖4)：實驗組與對照組的大鼠髁突軟骨細胞隨著培養時間的延長而增殖。細胞接種第1天，可見兩組的髁突軟骨細胞OD值均較低，細胞逐步開始增殖生長；細胞接種第3天，兩組的細胞數量均增高，OD值明顯高于第一天，但兩組之間未出現顯著性差異；細胞接種第5天，PHB/PEG支架復合培養細胞增殖活力明顯增高，對照組細胞增殖活力雖有增長，但顯著低于實驗組；細胞接種第7天，PHB/PEG支架組細胞增殖活力仍呈現上升趨勢，對照組與第5天相比同樣有少量增加，可見增長曲線放緩。PHB/PEG支架復合培養組細胞增殖活性顯著高于對照組。

圖4 細胞增殖活性檢測結果

3 討論

聚-β-羥基丁酸酯(PHB)作為聚羥基脂肪酸酯(PHAs)家族中的一員，由于其優良的生物相容性和生物可降解性，在生物醫學領域得到了廣泛應用[8-9]。PHB材料制成的多孔支架材料，具有可支撐各種細胞存活的三維空間結構，能夠嵌入或攜帶細胞，并提供良好的細胞生長環境[10]。通過調整支架材料的孔隙率及孔徑大小，可適應培養多種細胞的要求。但PHB材料表面呈現較高的疏水性和生物惰性，材料本身強度欠佳。聚乙二醇(PEG)是一種水溶性的高聚物，同時又是完全可降解材料，無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，與許多有機物有良好的相容性[11-12]。聚乙二醇(PEG)的引入，可顯著促進PHB材料的生物活性并提高其機械強度。

細胞外基質的三維結構是細胞的生長和分化所依賴的微環境，同時也是細胞內信號傳遞和化學反應的起始者，可參與調控細胞分化及各種其他功能活動。越來越多的實驗證據證明，只有生長在三維基質微觀環境中，細胞形態才更接近在體細胞[13]。同時，細胞形態、細胞骨架結構和細胞外基質的相互作用與細胞的代謝過程密切相關[14]。近年來組織工程技術的飛快發展，為構建細胞的體外三維生長環境提供了可能。理想的組織工程支架材料應具備高度仿生的微觀形態結構，即具備適當的孔隙率、充分的表面積和適宜的表面化學，從而促進細胞的黏附、生長、增殖和分化。目前，已有多種技術可用于制備滿足以上要求的支架材料，而靜電紡絲技術能夠制造出直徑達納米級的連續纖維[15]，引起了學者們的廣泛關注。因此本實驗利用靜電紡絲技術，選用PHB/PEG復合生物材料制作髁突軟骨細胞類胞外基質微環境支架，為研究力學刺激下髁突軟骨細胞的生物學行為變化奠定微觀結構基礎。

良好的生物相容性是生物支架材料的重要性能之一。本實驗將大鼠髁突軟骨細胞與PHB/PEG納米復合生物支架進行復合培養，并進行形態學觀察及細胞增殖活性檢測，初步證實了PHB/PEG纖維支架材料有利于細胞的粘附、生長、增殖，具有良好的細胞生物相容性。熒光染色及掃描電鏡觀察從定性的角度表征了支架良好的生物相容性，細胞在接種4h粘附于支架表面并開始鋪展，而接種72h細胞的增殖顯著增加，并呈現出三維生長。MTT結果從定量的角度評價了大鼠髁突軟骨細胞與PHB/PEG支架材料復合培養不同時間點細胞的增殖情況。檢測結果顯示，培養前3d，與對照組相比，PHB/PEG支架上復合培養的大鼠髁突軟骨細胞數量雖略有增加，但二者未出現顯著差異；培養5～7d后，PHB/PEG復合纖維支架上復合培養的大鼠髁突軟骨細胞增殖活性明顯高于對照組。由此可見，靜電紡絲技術制備的PHB/PEG纖維支架材料對大鼠髁突軟骨細胞的粘附、生長、增殖具有一定的促進作用，具有良好的生物相容性，并可為細胞生長提供良好的微觀結構，可為進一步研究力學刺激誘導髁突軟骨損傷修復及再生重建提供新的組織工程材料。

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The Biocompatibility Study on Polyhydroxybutyrate/Polyethylene Glycol Nanocomposite Scaffolds

WANG Yi-jie1,2,WANG Jie3,WAN Wan-ting1,2,DU Chan-yuan1,2,BAI Le-kang4,ZOU Rui1,2
(1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University ,Xi'an 710004,Shaanxi,China;2.Department of Orthodontics,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China;3.Af fi liated hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,China;4.Department of Prosthodontics,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China)

Objective Three-dimensional nano composite biological scaffolds were prepared using polyhydroxybutyrate (PHB)/polyethylene glycol(PEG) and compound culture with rat condylar cartilages,to evaluate its biocompatibility.Methods The PHB/PEG nano composite biological scaffolds were prepared by electrospinning and the rat condylar cartilages were seeded in it. The adhesion,growth and spreading of cells were observed by fl uorescence microscope and scanning electron microscope after seeding 4h and 72h,and evaluated cells’ proliferation and scaffold biocompatibility using MTT.Results From the results of fl uorescence microscope and scanning electron microscope,cells adhere on the scaffolds completely and some cells began spreading after 4h,the proliferation and growth were better after 72h. The results of MTT showed that PHB/PEG nanocomposite scaffolds can promote proliferation of rat condylar cartilages.Conclusion The PHB/PEG nanocomposite biological scaffolds have good biocompatibility and can promote adhesion,growth and proliferation of rat condylar cartilages,which will establish on experimental basis for tissue engineering cartilage regeneration.

condylar cartilages; PHB/PEG nano scaffolds; compound culture; biocompatibility

R318.08

A

1008-6455(2017)11-0059-04

國家自然科學基金(81300915)；陜西省自然科學基礎研究計劃(2015JM8414)

鄒蕊，西安交通大學口腔醫院正畸科，副教授，副主任醫師，碩士生導師，科教科副科長；長期從事錯牙合畸形的臨床矯治、頜面部組織再生與修復、口腔生物力學等臨床及科研工作； E-mail:rainy@mail.xjtu.edu.cn

2017-09-14

2017-10-13

編輯/朱婉蓉