病理性瘢痕成纖維細胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表達及意義

劉啟勝

(大冶市中醫醫院檢驗科 湖北 大冶 435100)

病理性瘢痕成纖維細胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表達及意義

劉啟勝

(大冶市中醫醫院檢驗科 湖北 大冶 435100)

目的：探討病理性瘢痕成纖維細胞中凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表達及意義。方法：采用Western bolt技術檢測46例病理性瘢痕組織、25例非病理性瘢痕組織和22例正常皮膚組織中凋亡相關因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3 的陽性表達率，并分析其相關性。結果：病理性瘢痕成纖維組織中Fas、caspase-3陽性表達率分別為21.74％、23.91％低于非病理性瘢痕的60.0％、72.0％和正常皮膚組織的86.36％、90.90％，差異有統計學意義(P＜0.05)；病理性瘢痕成纖維組織Bcl-2、survivin陽性表達率分別為78.26％、82.61％高于非病理性瘢痕的44.0％、48.0％和正常皮膚組織的13.64％、18.18％，差異有統計學意義(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮膚組織中上述指標也存在明顯差異(P＜0.05)；Spearman相關分析顯示，Fas蛋白與Bcl-2蛋白、survivin蛋白表達呈負相關關系(r=-0.513、-0.629，P＜0.05)，與caspase-3蛋白表達呈正相關關系(r=0.691，P＜0.05)；Bcl-2蛋白表達與survivin蛋白表達呈正相關關系(r=0.6.16，P＜0.05)，與caspase-3蛋白表達呈負相關關系(r=-0.638，P＜0.05)，survivin蛋白表達與caspase-3蛋白表達呈負相關關系(r=-0.621，P＜0.05)。結論：病理性瘢痕成纖維組織中凋亡相關因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的異常表達，可能參與病理性瘢痕的形成。

病理性瘢痕；成纖維組織；凋亡相關因子；表達

瘢痕是創傷修復的必然結果，但過度修復可能造成纖維細胞功能異常，引起組織良性增生，出現病理性瘢痕，進而影響局部周圍組織的正常功能。目前，病理性瘢痕的機制尚未完全明確。近年來，隨著細胞、分子生物學的研究進展，多數學者認為，細胞凋亡可能是病理性瘢痕的重要發病機制[1-2]。Fas是誘導細胞凋亡的重要膜蛋白分子，也是介導成纖維細胞死亡的重要通道；Bcl-2家族直接影響細胞凋亡情況，Bcl-2蛋白作為Bcl-2家族中的抗細胞凋亡因子，可抑制成纖維細胞凋亡；survivin可作用于各個凋亡途徑的匯集點，抑制由caspase-3/caspase-7過度凋亡引起的細胞凋亡[3]。本研究主要分析病理性瘢痕成纖維組織細胞中相關凋亡因子Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3表達的陽性率，并與非病理性瘢痕和正常組織比較。

圖1 Fas在病理性瘢痕中表達(SP染色，400×)

圖2 Fas在正常組織中表達(SP染色，400×)

圖3 caspase-3在病理性瘢痕中表達(SP染色，400×)

圖4 caspase-3在非病理性瘢痕中表達(SP染色，400×)

圖5 caspase-3在正常組織中表達(SP染色，400×)

圖6 Bcl-2在病理性瘢痕中表達(SP染色，400×)

圖7 Bcl-2在正常組織中表達(SP染色，400×)

圖8 Survivin在病理性瘢痕中表達(SP染色，400×)

圖9 Survivin在非病理性瘢痕中表達(SP染色，400×)

1 資料和方法

1.1 臨床資料：標本均來源于2015年1月-2016年1月本院整形外科行瘢痕切除的患者，均經臨床病理證實。病理性瘢痕46例，男21例，女25例；年齡8～48歲，平均(27.16±2.86)歲；其中瘢痕疙瘩20例，增生性瘢痕26例。非病理性瘢痕均為傷后傷口界限內生長，向外壓迫周圍組織，增殖后自行退化、攣縮而留下的纖維性組織，共選取25例，男12例，女13例；年齡7～53歲，平均(29.64±3.52)歲。正常皮膚組織為美容切除和全厚皮片移植剩余的全厚皮，共選取22例，男8例，女14例；年齡10～51歲，平均(29.41±3.94)歲。三組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。本次研究均取得患者的知情同意。

1.2 排除標準：①合并皮膚病、結締組織病、傳染病、重要臟器官疾病者；②既往有放化療史、激光治療史者；③1年內有局部注射藥物、瘢痕處接受外用藥物治療者。

1.3 方法：所有標本離體后均用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)固定，常規脫水、浸蠟、包埋，4～6μm厚切；常規脫蠟后置于蒸餾水新鮮配置的3％H2O2中，室溫孵育15min，消除標本中內源性過氧化物酶活性，蒸餾清洗3次，2min/次，PBS浸泡2次，5min/次；抗原修復后，蒸餾水洗5次，1min/次，PBS沖洗2次，3min/次；滴加二抗同種動物血清封閉血液，室溫下孵育10min；滴加一抗工作液，4℃恒溫下過夜，0.01ml PBS沖洗3次，5min/次；分別滴加即用型生物素標記二抗、滴加辣根酶標記鏈霉卵蛋白工作液后孵育，0.01ml PBS沖洗3次，5min/次；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木素復染，蒸餾水沖洗后，1％鹽酸酒精分化，流水沖洗；二甲苯透明，中性樹膠封固；PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定[4-5]：Fas主要定位于成纖維細胞膜，Bcl-2、survivin、caspase-3主要定位于成纖維細胞漿，鏡下觀察切片著色強度及面積進行評分。著色強度：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性著色面積：0分，無著色；1分，著色面積＜1/3；2分，著色面積為1/3～2/3；3分，著色面積＞2/3。2項之和≥3分為陽性。1.5 統計學分析：采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計數資料用率表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用雙變量Spearman檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組標本組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的表達：Fas在正常組織中的成纖維細胞膜內呈棕黃色，caspase-3在正常皮膚組織成纖維細胞漿內呈棕黃色，非病理性組織和病理性瘢痕組織中少量表達(見圖1～5)；Bcl-2、survivin在病理性瘢痕組織成纖維細胞漿內呈棕黃色，非病理性瘢痕組織和正常皮膚組織中少量表達(見圖6～10)。

2.2 三組標本組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的陽性表達率：病理性瘢痕成纖維組織中Fas、caspase-3陽性表達率分別為21.74％、23.91％低于非病理性瘢痕的60.0％、72.0％和正常皮膚組織的86.36％、90.90％，差異有統計學意義(P＜0.05)；Bcl-2、survivin陽性表達率分別為78.26％、82.61％高于非病理性瘢痕的44.0％、48.0％和正常皮膚組織的13.64％、18.18％，差異有統計學意義(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮膚組織中上述指標也存在明顯差異(P＜0.05)。見表1。

2.3 病理性瘢痕組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3的相關性分析：Spearman相關分析結果顯示，Fas蛋白與Bcl-2蛋白、survivin蛋白呈負相關關系(r=-0.513、-0.629，P＜0.05)，與caspase-3蛋白呈正相關關系(r=0.691，P＜0.05)；Bcl-2蛋白與survivin蛋白呈正相關關系(r=0.616，P＜0.05)，與caspase-3呈負相關關系(r=-0.638，P＜0.05)，survivin蛋白與caspase-3蛋白呈負相關關系(r=-0.621，P＜0.05)。

3 討論

病理性瘢痕是發生于創傷、感染后的一種纖維代謝疾病，發病機制尚未完全明確。隨著臨床對病理性瘢痕組織相關生物細胞學和分子生物學研究的增多，發現細胞增生和凋亡失衡可能是病理性瘢痕的重要病理基礎。王暑光等[6]指出，成纖維細胞凋亡不足可能在病理性瘢痕的發生中起重要作用。

Fas屬于一種跨膜蛋白，在細胞凋亡過程中起信號傳遞作用，可表達于成纖維細胞，誘導細胞凋亡。研究發現，Fas與其受體結合后可最終形成死亡誘導信號，并激活Caspase的一系列凋亡蛋白，誘導細胞凋亡。目前，臨床研究已證實，FasL-FasR系統可參與細胞增殖和調控[7]。楊愛琴等[8]發現尖銳濕疣患者病變皮損部位Fas呈低表達。

Bcl-2即B細胞淋巴細胞瘤/白血病-2基因，首次由Tsujimoto在t(14,18)染色體異位的濾泡性淋巴瘤中發現，該基因表達可抑制多種組織細胞凋亡，是重要的抗細胞凋亡因子。隨著臨床對Bcl-2抗凋亡機制的深入研究，發現其可能通過抑制脂質過氧化反應、鈣離子跨膜流動及caspase活化等發揮抗凋亡作用。陳釗等[9]指出，瘢痕疙瘩成纖維組織中Bcl-2陽性表達升高。

survivin迄今為止是凋亡抑制蛋白家族中的一員，在胚胎或胎兒組織、器官中呈高表達，但成人分化成熟的終末組織無表達。survivin作為一種抗細胞凋亡因子，主要通過與caspase家族相互作用抑制細胞凋亡，其機制可能為：針對caspase-8經細胞死亡刺激因子(如：Fas等)啟動的外源性細胞凋亡，survivin可直接或間接影響caspase-3/caspase-7活性，阻斷其水解微管結構蛋白；針對caspase-9啟動的內源性細胞凋亡，可通過阻斷細胞凋亡信號的傳導，間接抑制caspase-3/caspase-7活性[10]。

caspase家族在細胞凋亡中起關鍵作用，其表達異常增多會誘導細胞凋亡。caspase-3是caspase家族中最重要的成員之一，是介導細胞凋亡的重要效應因子之一。吳焱秋[11]指出，caspase-3可介導多數細胞凋亡因子引起的細胞凋亡。臨床研究發現，caspase-3激活的途徑主要通過凋亡刺激因子(Fas、TNFR等)與受體結合，誘導上游的caspase-8被激活，或線粒體釋放細胞色素C誘導的下游caspase-9被激活，進而導致下游的caspase-3被激活，參與細胞凋亡。萬遠芳等[12]報道，皮膚紅斑狼瘡患者皮損組織中caspase-3的活性明顯高于正常皮膚組織，可能參與皮膚紅斑狼瘡發病。

本研究中，病理性瘢痕成纖維組織中Fas、caspase-3陽性表達率低于非病理性瘢痕和正常皮膚組織，Bcl-2、survivin陽性表達率明顯高于非病理性瘢痕和正常皮膚組織(P＜0.05)；且非病理性瘢痕和正常皮膚組織中上述指標也存在明顯差異(P＜0.05)，說明成纖維細胞抗凋亡因子Bcl-2、survivin高表達，Fas、caspase-3低表達可能參與病理性瘢痕形成過程。付昱等[13]研究指出，黃芪總苷可通過抑制survivin、 Bcl-2，避免成纖維細胞過度增殖，從而起到治療瘢痕疙瘩的效果，認為凋亡相關因子survivin、Bcl-2過度表達可能參與病理性瘢痕形成。張蘇文等[14]進行體外研究發現，腫瘤壞死因子α刺激基因(TSG-6)可通過促進凋亡相關因子caspase-3高表達達到誘導成纖維細胞凋亡的目的。另外，Spearman相關分析顯示，Fas蛋白與Bcl-2蛋白、survivin蛋白呈負相關關系(P＜0.05)，與caspase-3蛋白呈正相關(P＜0.05)；Bcl-2蛋白與survivin蛋白呈正相關，與caspase-3蛋白呈負相關(P＜0.05)；survivin蛋白與caspase-3蛋白呈負相關關系(P＜0.05)，說明病理性瘢痕組織凋亡因子異常表達可能存在相互作用的關系，但具體作用機制尚有待研究。

綜上，病理性瘢痕成纖維組織中，Bcl-2、survivin表

表1 三組標本組織中Fas、Bcl-2、survivin、caspase-3陽性表達率 [例(％)]

(本文未完，)達呈高陽性率，Fas、caspase-3表達呈低陽性率，且凋亡因子Bcl-2、survivin、Fas、caspase-3異常表達存在相關性，可能是病理性瘢痕重要的發病機制。有待深入研究凋亡相關因子的作用機制，進一步探討病理性瘢痕的發病機制，為臨床防治病理性瘢痕提供新思路。

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The Expression and Signi fi cance of Apoptotic Factors Fas,Bcl-2,Survivin and Caspase-3 Protein in Pathological Scar Fibroblasts

LIU Qi-sheng
(Department of Clinical Laboratory,Daye Hospital of Traditional Chinese Medicine,Daye 435100,Hubei,China)

Objective To investigate the expression and significance of apoptotic factors Fas,Bcl-2,survivin and caspase-3 protein in pathological scar fi broblasts.Methods The positive expression rates of apoptosis-associated factors Fas,Bcl-2,survivin and Caspase-3 protein in 46 cases of pathological scar tissues,25 cases of non-pathological scar tissues and 22 cases of normal skin tissues were detected by Western bolt,and the correlation was analyzed.Results The positive expression rates of Fas and caspase-3 in pathological scar fi broblasts (21.74％,23.91％) were lower than those in the non-pathological scar (60.0％,72.0％) or those in normal skin tissues (86.36％,90.90％) (P＜0.05),while the positive expression rates of Bcl-2 and survivin in pathological scar fi broblasts (78.26％,82.61％) were signi fi cantly higher than those in non-pathological scars (44.0％,48.0％)or those in normal skin tissues (13.64％,18.18％) (P＜0.05). There were signi fi cant differences in above-mentioned indexes between non-pathological scars and normal skin tissues (P＜0.05). Spearman correlation analysis showed that Fsa protein was negatively related to Bcl-2 protein and survivin protein (r=-0.513,-0.629,P＜0.05),and positively correlated with caspase-3 protein (r=0.691,P＜0.05). Bcl-2 protein was positively correlated survivin protein (r=0.6.16,P＜0.05),and negatively correlated with caspase-3 protein (r=-0.638,P＜0.05). The survivin protein was negatively correlated with caspase-3 protein(r=-0.621,P＜0.05).Conclusion The abnormal expression of apoptosis related factors Fas,Bcl-2,survivin and caspase-3 in pathological scar fi broblasts may be involved in the occurrence of pathological scar.

pathological scar; fi broblast; apoptosis associated factor; expression

R619+.6

A

1008-6455(2017)11-0063-03

2017-08-14

2017-09-08

編輯/朱婉蓉