干擾STAT3基因?qū)ο瓪獾罁p傷的影響*

楊遠艦， 張 楨， 程 哲

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 河南 鄭州 450052)

·短篇論著·

干擾STAT3基因?qū)ο瓪獾罁p傷的影響*

楊遠艦， 張 楨， 程 哲△

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 河南 鄭州 450052)

目的探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在哮喘氣道損傷中的作用及相關(guān)機制。方法首先，通過Western blot檢測哮喘患者的支氣管黏膜組織中STAT3的表達及活化情況；其次，以支氣管上皮細胞為研究對象，檢測屋塵螨抗原P1(Derp1)刺激對STAT3的表達及活化的影響；再次，采用shRNA干擾支氣管上皮細胞中STAT3的表達，CCK-8實驗檢測細胞活力，同時檢測細胞培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和IL-6 的含量來反映細胞的炎癥反應(yīng)，檢測細胞中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性來反映細胞氧化應(yīng)激水平；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。結(jié)果哮喘患者的支氣管黏膜組織中p-STAT3的蛋白水平顯著上升，Derp1刺激可顯著上調(diào)支氣管上皮細胞中p-STAT3的蛋白水平。沉默STAT3可抑制TNF-α、 IL-1β和IL-6釋放，降低MDA的含量，升高SOD和GSH-Px的活性，并抑制細胞凋亡，提高細胞活力(P<0.05)。結(jié)論沉默STAT3可減輕塵螨誘導(dǎo)的氣道損傷，其作用機制可能是通過抑制JAK/STAT信號通路的激活，抑制支氣管上皮細胞分泌炎癥細胞因子及細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而減少細胞凋亡。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3； 哮喘； 支氣管上皮細胞； 炎癥細胞因子； 氧化應(yīng)激

哮喘是一種慢性氣道炎癥反應(yīng)，近年來因環(huán)境污染等因素的影響，其患病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，給人類健康帶來了嚴重的危害[1]。目前關(guān)于其病理機制的研究多集中在氣道炎癥和氣道重塑等方面，而支氣管上皮則是氣道內(nèi)外環(huán)境的第一道屏障，在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[2-4]。因此增強支氣管上皮細胞的防御及修復(fù)功能，對于哮喘的治療有著重要意義。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，可被多種因素激活，進而在胞內(nèi)編碼一系列炎癥相關(guān)蛋白，并促進這些蛋白的釋放，擴增炎癥反應(yīng)[5-6]。有研究顯示在哮喘小鼠的肺組織中STAT3的表達明顯升高，加入STAT3抑制劑可明顯改善哮喘相關(guān)炎癥反應(yīng)[7]。本研究以支氣管上皮細胞為研究對象，通過屋塵螨抗原P1(Dermatophagoidespteronyssinusantigen P1，Derp1)誘導(dǎo)刺激來觀察STAT3對哮喘所致支氣管上皮損傷的影響并初步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；Derp1購自Abcam；人支氣管上皮細胞16-HBE購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection， ATCC)；干擾STAT3的sh-RNA、陰性對照shRNA及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑由Origene提供；抗p-STAT3/STAT3和β-actin抗體購自CST；CCK-8細胞活力分析試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

2 實驗方法

2.1纖維支氣管鏡活檢 選取2010年10月～2016年10月間經(jīng)本院臨床確診的哮喘患者32例為實驗組，另取來我院就診的非哮喘患者21例為對照組，2組患者在年齡和性別上無顯著差異。經(jīng)患者簽署知情同意書后，常規(guī)方法行纖維支氣管鏡檢查，取氣道活組織標(biāo)本3～4塊，置于10%福爾馬林中固定后石蠟包埋備用。

2.2細胞培養(yǎng)、分組和處理 16-HBE細胞貼壁培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。每隔1 d換液，每3～4 d用胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞消化后接種于6孔板中，待細胞生長至約80%融合時，將細胞隨機分為4組：空白對照(control)組、Derp1(培養(yǎng)基中加入5 mg/L Derp1干預(yù)8 h)組、陰性對照(negative control， Neg；細胞中轉(zhuǎn)入陰性對照shRNA后，加5 mg/L Derp1干預(yù)8 h)組和轉(zhuǎn)染(shRNA；細胞中轉(zhuǎn)入STAT3 shRNA后，加5 mg/L Derp1干預(yù)8 h)組。各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后進行后續(xù)實驗分析。STAT3 shRNA轉(zhuǎn)染方法如下：將質(zhì)粒及LipofectamineTM2000分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫下孵育5 min；將2者輕柔混合后室溫下繼續(xù)孵育25 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合體加入相應(yīng)組別的細胞中，補充培養(yǎng)基并將細胞置于培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定干擾效率并用于后續(xù)實驗分析。

2.3CCK-8法測定細胞活力 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中(密度為2×107/L)，經(jīng)相應(yīng)處理后，向細胞中加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值。每組設(shè)3個復(fù)孔取均值，另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對照。

2.4TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA含量及SOD和GSH-Px活性的檢測 各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后， TNF-α、IL-1β和IL-6的檢測依據(jù)武漢博士德生物工程有限公司提供的ELISA試劑盒檢測說明書進行；MDA含量、SOD及GSH-Px活性的檢測依據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測說明書進行。

2.5流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測細胞凋亡 經(jīng)相應(yīng)處理后各組細胞用不含EDTA的胰酶消化，而后離心收集細胞。加PBS漂洗3次，離心并加入Binding Buffer重懸細胞，避光加入Annexin V-FITC室溫孵育10 min，然后避光加入PI繼續(xù)孵育5 min。流式細胞術(shù)檢測激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。

2.6Western blot法測定蛋白水平 裂解收集各組織或細胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量分析后調(diào)整各孔上樣蛋白總量為60 μg，并加入4倍體積的蛋白上樣緩沖液，采用8% SDS-PAGE。而后通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下加5%脫脂牛奶于搖床上封閉90 min。加入相應(yīng)比例的 I 抗4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后加TBST洗滌3次，每次5 min；然后加入相應(yīng)的 II 抗室溫下孵育90 min，加TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影，定影并沖洗膠片。結(jié)果采用ImageJ進行灰度半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同條件下STAT3的表達情況

Western blot 檢測結(jié)果顯示，哮喘患者支氣管黏膜組織中p-STAT3的蛋白水平顯著升高，是正常對照組的(2.19±0.12)倍；STAT3的蛋白水平與對照組相比輕微升高，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖1A)。給予Derp1刺激后，支氣管上皮細胞16-HBE中p-STAT3的蛋白水平也顯著升高，是正常對照組的(1.86±0.07)倍；STAT3的蛋白水平與對照組相比輕微升高，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖1B)。此外Derp1刺激可顯著降低16-HBE細胞活力，而干擾STAT3則可部分逆轉(zhuǎn)Derp1刺激所致的16-HBE細胞活力降低(圖1C)。這些結(jié)果說明STAT3可能與哮喘氣道損傷有關(guān)。

Figure 1. The protein levels of STAT3 and the cell viability. A: the protein levels of STAT3 in bronchial mucosa of asthmatic patients; B: the effects of Derp1 andSTAT3 shRNA on the protein levels of STAT3 in the 16-HBE cells； C: the effects of Derp1 andSTAT3 shRNA on the viability of the 16-HBE cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDerp1 group.

圖1STAT3的蛋白水平及細胞活力的變化

2 干擾STAT3對16-HBE細胞炎癥反應(yīng)的影響

如表1所示，Derp1可促進16-HBE細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β和 IL-6的釋放(P<0.05)；而干擾STAT3可抑制Derp1所致的TNF-α、IL-1β和 IL-6釋放，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果說明干擾STAT3可改善Derp1所致支氣管上皮細胞炎癥因子的釋放。

表1干擾STAT3對Derp1所致16-HBE細胞炎癥因子釋放的影響

Table 1. The effect ofSTAT3 knockdown on Derp1-induced releases of inflammatory cytokines in the 16-HBE cells (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupTNF-αIL-1βIL-6Control31.24±2.13101.45±9.2787.88±7.34Derp1156.83±8.37*314.65±10.49*278.42±11.18*Neg150.58±9.72310.26±10.58281.34±9.26shRNA82.35±6.21#247.89±9.24#203.47±6.21#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDerp1 group.

3 干擾STAT3對16-HBE細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

如表2所示，Derp1可顯著增加16-HBE細胞中MDA的含量，同時降低SOD及GSH-Px的活性(P<0.05)；而相較于Derp1組，干擾STAT3可致MDA的含量降低，而SOD及GSH-Px的活性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果說明干擾STAT3可抑制Derp1所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表2干擾STAT3對Derp1所致16-HBE細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

Table 2. The effect ofSTAT3 knockdown on Derp1-induced oxidative stress response in the 16-HBE cells (Mean±SD.n=6)

GroupMDA(nmol/mg)SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)Control7.32±1.03159.15±8.32221.15±9.26Derp126.41±2.27*86.38±6.97*124.32±7.49*Neg25.78±2.3284.22±6.78122.27±7.58shRNA14.37±1.01#123.29±5.43#183.89±8.24#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDerp1 group.

4 干擾STAT3對16-HBE細胞凋亡的影響

與對照組比較，Derp1刺激可致細胞早期凋亡率由5.32%±0.47%上升至27.54%±1.58%。而干擾STAT3之后，細胞早期凋亡率降低至15.11%±1.36%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果說明干擾STAT3可抑制Derp1所致細胞凋亡，見圖2。

Figure 2. The effect ofSTAT3 knockdown on Derp1-induced 16-HBE cell apoptosis. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDerp1 group.

圖2干擾STAT3對Derp1所致16-HBE細胞凋亡的影響

討 論

本研究首先檢測了哮喘患者支氣管上皮組織中STAT3的表達情況，結(jié)果顯示哮喘患者支氣管黏膜組織中p-STAT3的蛋白水平顯著升高。Derp1是一種直接的環(huán)境過敏原，存在廣泛且與大多數(shù)過敏性哮喘患者的發(fā)病有著相關(guān)性[8]。本研究以Derp1刺激16-HBE細胞，觀察這種哮喘相關(guān)的外源性刺激對細胞中STAT3表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Derp1可顯著增加細胞中p-STAT3的蛋白水平，且可降低16-HBE細胞存活率；經(jīng)shRNA干擾STAT3后，16-HBE細胞的存活率出現(xiàn)部分回升。結(jié)果提示STAT3可能與哮喘所致支氣管上皮細胞損傷有關(guān)。

STAT3是炎癥信號通路上的關(guān)鍵分子，已被證實參與多種細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6, 9-10]。本研究先檢測了Derp1所致的16-HBE細胞損傷中是否涉及炎癥因子的釋放，結(jié)果表明Derp1可致支氣管上皮細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放；干擾STAT3可抑制該反應(yīng)的發(fā)生。哮喘發(fā)病過程中還存在氧化應(yīng)激的機制，哮喘氣道抗氧化能力顯著下降[11-12]。當(dāng)氣道上皮細胞中原本的氧化還原平衡被打破后，易導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的激活；且研究證實氣道上皮發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后，更容易受損，導(dǎo)致細胞凋亡增加[13-15]。本研究進一步分析了Derp1所致的16-HBE細胞損傷中氧化應(yīng)激的水平及細胞凋亡情況，結(jié)果顯示Derp1可顯著增加16-HBE細胞中MDA的含量，同時降低SOD及GSH-Px的活性，細胞早期凋亡率也顯著提高；說明Derp1可顯著提高細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平并導(dǎo)致細胞凋亡；從另一方面進一步證實了哮喘發(fā)病過程中的氧化應(yīng)激機制。STAT3是JAK/STAT信號通路的重要成員；而JAK/STAT是細胞重要的固有免疫應(yīng)答炎癥細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可經(jīng)氧化應(yīng)激、細胞因子等刺激激活后參與調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等病理生理過程[16-17]。我們的結(jié)果顯示，干擾STAT3可明顯抑制Derp1所致的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，降低細胞早期凋亡率，提示干擾STAT3改善Derp1所致的16-HBE細胞損傷可能與改善細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制細胞凋亡相關(guān)；但是其具體的作用機制還有待進一步深入的研究。

綜上所述，沉默STAT3可保護塵螨誘導(dǎo)的氣道損傷，其作用機制可能是通過抑制JAK/STAT信號通路的激活，抑制支氣管上皮細胞分泌炎性因子及細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而減少細胞凋亡。

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Effect of STAT3 down-regulation on airway injury in asthma

YANG Yuan-jian, ZHANG Zhen, CHENG Zhe

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:chengzhehi@126.com)

AIM: To investigate the effect of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) on airway injury in asthma and its mechanism.METHODSThe expression and activation of STAT3 in bronchial mucosa tissues of asthmatic patients were measured by Western blot. The expression and activation of STAT3 in bronchial epithelial cells pretreated withDermatophagoidespteronyssinusantigen P1 (Derp1) were estimated. Bronchial epithelial cells were transfected withSTAT3 shRNA. STAT3 expression was measured by Western blot. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The concentrations of TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. The content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were also determined for evaluating the status of oxidative stress. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.RESULTSThe protein level of p-STAT3 was significantly up-regulated in both bronchial mucosa of asthmatic tissues and bronchial epithelial cells pretreated with Derp1. Knockdown ofSTAT3 inhibited the releases of TNF-α, IL-1β and IL-6, decreased the content of MDA and enhanced the activity of SOD and GSH-Px with the suppression of cell apoptosis (P<0.05).CONCLUSIONDown-regulation ofSTAT3 attenuates Derp1-induced the airway injury. The mechanism may involve that knockdown ofSTAT3 suppresses the activation of JAK/STAT signaling pathway, the release of asthma-related inflammatory cytokines and oxidative stress in bronchial epithelial cells, thus inhibiting cell apoptosis.

Signal transducer and activator of transcription 3; Asthma; Bronchial epithelial cells; Inflammatory cytokines; Oxidative stress

1000- 4718(2017)12- 2269- 05

2016- 07- 27

2017- 03- 11

河南省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項目(No. 201503057); 河南省高等學(xué)校重點科研項目(No. 18A320056); 河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程(豫衛(wèi)科2010-52號)

△通訊作者 Tel: 0371-66295072； E-mail： chengzhehi@126.com

R363.1+4； R562.2+5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.025

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)