Salusin-β對心肌梗死大鼠凋亡及氧化應激的影響

蔡銀鏈 徐 玲

(福建醫科大學附屬第二醫院(泉州)心內二區，福建 泉州 362000)

Salusin-β對心肌梗死大鼠凋亡及氧化應激的影響

蔡銀鏈 徐 玲

(福建醫科大學附屬第二醫院(泉州)心內二區，福建 泉州 362000)

目的研究Salusin-β改善心肌梗死大鼠發病及相關凋亡及氧化應激機制。方法Wistar大鼠隨機分為假手術組，模型組及治療組(給予Salusin-β干預)，模型組和治療組為心肌梗死模型大鼠。觀察各組心功能、組織病理學改變、凋亡情況及氧化應激情況。結果假手術組相比，模型組及治療組收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)及左室舒張壓(LVSP)顯著降低，左室舒張末壓(LVEDP)顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，治療組SBP、DBP及LVSP顯著升高，LVEDP顯著降低(P均<0.05)。假手術組心肌組織細胞結構完整，肌纖維排列整齊；模型組細胞排列紊亂，水腫變形嚴重，肌纖維排列紊亂，間質充血水腫；治療組病理學改變同模型組，但病變程度均減輕。假手術組基本不存在凋亡情況，模型組及治療組凋亡情況顯著增加；相比于模型組，治療組凋亡顯著降低。與假手術組相比，模型組及治療組心肌組織Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低。與假手術組相比，模型組及治療組SOD含量顯著降低，MDA含量表達顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，治療組SOD含量顯著升高，MDA含量表達顯著降低(均P<0.05)。結論Salusin-β可通過改善心肌梗死大鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡，改善心肌組織氧化應激從而發揮治療心肌梗死疾病的作用。

Salusin-β；心肌梗死；Bcl-2；Bax；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

心肌梗死致病機制復雜，至今未明確，細胞凋亡及多種氧化應激產物表達的失衡是造成機體損傷的重要機制〔1〕。Salusins具有心血管活性調節作用，在分子細胞水平方面，具有減輕心肌細胞鈣超載、抗心肌細胞凋亡等作用，Salusins包括Salusin-α及Salusin-β〔2〕。實驗報道〔3〕，Salusin-β可明顯減少動物心肌缺血再灌注致惡性心律失常的發生，其是否可以通過調控體內凋亡及氧化應激的表達來改善疾病仍然未知。本文觀察心肌梗死大鼠的發病情況及體外給予Salusin-β的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 購自北京華阜康生物公司雄性Wistar大鼠120只，體重210～250 g，周齡8～10 w，隨機分為假手術組模型組和治療組各40只。其中模型組和治療組均構建心肌梗死大鼠模型，治療組給予10-8mol/L的Salusin-β(日本大阪肽研究所)腹腔注射干預，模型組給予同等劑量的生理鹽水干預。

1.2動物模型構建 參考相關文獻〔3〕，建立心肌梗死模型。大鼠乙醚麻醉后開胸。暴露胸腔后，在肺動脈圓錐與左心耳交界處，結扎左冠狀動脈，采用心電監護顯示ST 段抬高和( 或)T波抬高，提示心肌梗死模型構建成功。假手術組操作同上，僅暴露各組血管，而不進行線栓結扎。操作過程中無死亡率，存活率為100%。

1.3血流動力學檢測 造模后2 w，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪開鼠頭部皮膚，頸正中切口，分離右側頸總動脈，然后頸總動脈和左心室插管，測定血壓收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)及血流動力學指標左室舒張壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)。

1.4心肌組織病理形態檢測 造模后2 w，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠處死，取心臟組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，包埋，切片后進行HE染色，光鏡下觀察心臟組織形態。

1.5原位末端標記法檢測心肌細胞凋亡 將石蠟切片脫蠟，二甲苯透明，梯度酒精脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，嚴格按照說明書原位末端標記法(北京鼎國有限公司)操作，清洗后封片顯微鏡觀察。凋亡指數= (熒光細胞數/細胞總數)×100%。

1.6凋亡蛋白檢測 取大鼠心臟組織，用小剪刀剪碎，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，12 000 r/min，4℃，離心30 min取上清，應用蛋白定量檢測蛋白濃度后，將各樣品濃度配齊，并加入上樣緩沖液煮沸變性。上樣跑膠，轉膜，封閉，加Bcl-2，Bax及內參β-actin一抗4℃過夜，第2天辣根過氧化物酶二抗常溫孵育2 h，暗室內顯影定影。

1.7超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測 造模后2 w，對大鼠進行眼球取血，靜置2 h后高速離心取血清置于深凍冰箱備用。應用SOD、MDA試劑盒(碧云天試劑公司)，嚴格按照說明書及文獻配置多種試劑及顯色劑及操作〔3〕，SOD應用儀器檢測吸光度。SOD(U/ml)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度×50%×稀釋倍數。MDA采用熒光檢測法，嚴格參照說明書及相關文獻配置試劑及標準品〔3〕，試劑混勻后95℃水浴40 min，再流水沖洗，3 500 r/min離心10 min，取上清后測定吸光度。MDA(nmol/ml)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(標準吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度×稀釋倍數。

1.8統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組心功能 與假手術組相比，模型組及治療組SBP、DBP及LVSP顯著降低(P<0.05)，LVEDP顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組SBP、DBP及LVSP顯著升高(P<0.05)，LVEDP顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2各組組織病理學 假手術組心肌組織細胞結構完整，肌纖維排列整齊；模型組細胞排列紊亂，水腫變形嚴重，肌纖維排列紊亂，間質充血水腫；治療組病理學改變同模型組，但病變程度均減輕，見圖1。

表1 各組心功能指標

與假手術組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；表2同

圖1 各組心肌組織HE染色(×200)

2.3各組心肌細胞的凋亡 熒光顯微鏡圖片中綠色熒光提示凋亡情況，假手術組基本不存在凋亡情況，模型組及治療組凋亡情況顯著增加；相比于模型組，治療組凋亡顯著降低，見圖2。

圖2 各組心肌細胞的凋亡(×200)

2.4各組凋亡蛋白表達 與假手術組相比，模型組及治療組心肌組織Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低，見圖3。

圖3 各組凋亡蛋白表達

2.5各組SOD及MDA含量比較 與假手術組相比，模型組及治療組SOD含量顯著降低(P<0.05)，MDA含量表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組SOD含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量表達顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組SOD及MDA含量比較

3 討 論

缺血缺氧導致的心肌組織及細胞的凋亡和壞死是疾病發生和發展的重要因素。已有研究表明，參與凋亡的機制有很多，其中線粒體作為重要的產能器官，多種凋亡蛋白可以誘發線粒體啟動凋亡程序。并且，多種病理因素可以調控細胞內的Caspase-3，程序性細胞死亡因子(PDCD)-5及Bcl-2，Bax蛋白，誘導細胞的凋亡〔4,5〕。在眾多凋亡蛋白中，Bax蛋白含量對細胞凋亡有正性加重作用，可誘導并促進細胞的凋亡。而Bcl-2蛋白具有抑制細胞凋亡的作用，可減輕體內凋亡情況〔6,7〕。Bcl-2及Bax蛋白是一對正負調節蛋白，互相作用調節機體內的凋亡情況。已有研究證實，急性心肌梗死患者體內Bcl-2蛋白含量降低，而Bax含量升高〔8〕，提示二者參與心肌梗死疾病的發生發展中。與此同時，機體在正常情況下可以清除體內多余的自由基，然而在心肌缺血缺氧的情況下，機體內會出現較多的氧自由基積聚，從而加重心肌組織損害。SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除體內自由基；而MDA與線粒體膜的穩定性呈負相關，因此通過測定兩者情況可以評估機體內氧自由基水平〔9,10〕。

Salusins是日本學者利用生物信息學分析方法，于2003年從已經完成的人類基因組計劃的基因文庫中，根據表達序列標記的開放閱讀框架預測的肽類物質中篩選出的新的生物活性肽。Salusins具有心血管活性調節作用，在分子細胞水平方面，具有減輕心肌細胞鈣超載、抗心肌細胞凋亡等作用。本研究結果說明，Salusin-β可通過降低心肌細胞凋亡和改善體內氧化應激途徑來減弱心肌梗死的發病。于芳等〔11〕研究提示，Salusin-β可能通過干預鈣通道，促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路參與心肌生長發育過程，從而參與心肌梗死疾病中。王鍵飛等〔12〕研究提示Salusin-β可以顯著減小大鼠心肌梗死區域，然而相關機制其并未闡明。本研究提示Salusin-β可通過降低心肌細胞凋亡和改善體內氧化應激途徑來減弱心肌梗死的發生發展。

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12王鍵飛,王 茵,單世富,等.Salusins通過減輕內質網應激保護缺血心肌〔J〕.中國科學:生命科學,2012;42 (6) :54-62.

R541.4

A

1005-9202(2017)23-5788-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.016

福建省衛生計生青年科研課題(2016-1-67)

徐 玲(1983-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事心電生理研究。

蔡銀鏈(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要從事冠心病研究。

〔2016-11-25修回〕

(編輯 苑云杰)