信號轉導與轉錄激活因子3、細胞周期素D1在膽管癌組織中的表達及意義

王文斌，劉 兵，王天陽，呂海濤，劉學青

(1.河北醫科大學第二醫院肝膽外科，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學第三醫院腫瘤科，河北 石家莊 050051)

·論著·

信號轉導與轉錄激活因子3、細胞周期素D1在膽管癌組織中的表達及意義

王文斌1，劉 兵2，王天陽1，呂海濤1，劉學青1

(1.河北醫科大學第二醫院肝膽外科，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學第三醫院腫瘤科，河北 石家莊 050051)

目的檢測信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、細胞周期素D1(Cyclin D1)在膽管癌組織中的表達并分析其臨床意義。方法采用免疫組織化學技術檢測STAT3、Cyclin D1在70例膽管癌組織和15例非腫瘤膽道上皮組織中的表達情況。結果免疫組織化學結果顯示70例膽管癌組織和15例非腫瘤膽道上皮組織中STAT3、Cyclin D1陽性表達率分別為61.4%、33.3%和42.9%、13.3%。STAT3、Cyclin D1蛋白在膽管癌組織中的表達均明顯高于非腫瘤膽道上皮組織(P<0.05)。STAT3蛋白表達與膽管癌的臨床分期、淋巴結轉移和組織學分級明顯相關(P<0.05)；膽管癌組織中Cyclin D1蛋白表達與淋巴結轉移和組織學分級明顯相關(P<0.05)。STAT3與Cyclin D1表達呈明顯正相關關系(P<0.05)。STAT3、Cyclin D1蛋白共陰性表達組生存時間明顯長于共陽性表達組(P<0.01)。結論STAT3、Cyclin D1可能是反映膽管癌發生發展的重要生物學指標。

膽管腫瘤;轉錄激活因子3；細胞周期素D1

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.009

膽管癌是一種相對較少見的腫瘤，占肝膽系統腫瘤的10%～15%，人類腫瘤的2%～3%[1-2]，但發生率逐年升高[3]。根據起源部位不同分為肝內膽管癌和肝外膽管癌，肝外膽管癌又分為肝門膽管癌和遠端膽管癌。由于發病隱匿，具有浸潤生長和淋巴、神經轉移等特點，綜合治療效果不理想[4]，5年生存率20%～40%[5]。故研究膽管癌的發生、發展、浸潤、轉移等生物學特點和機制，對于膽管癌的治療有著重要指導意義。信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)位于細胞質中，當被上游相關信號激活后，其磷酸化形成二聚體或與STAT3的其他成員形成異質二聚體。激活的STAT3復活物移位到細胞核中作用于STAT3目的基因，促進細胞周期素D1(Cyclin D1)等的表達，進而引起組織細胞的癌變、增殖和侵犯。已有研究顯示STAT3在多種實體腫瘤中均起到促癌作用[6-7]。Cyclin D1是STAT3的下游基因，其高表達可促進細胞大量增殖，進而引起癌變，與食管癌、肝癌等腫瘤的發生密切相關[8-9]。本研究采用免疫組織化學技術檢測STAT3、Cyclin D1在膽管癌中的表達并探討其臨床意義，旨在為膽管癌的診斷和治療提供一個新的靶點。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2009年3月—2014年4月在河北醫科大學第二醫院手術切除經病理證實的膽管癌標本70例(腺癌62例，黏液腺癌3例，乳頭狀腺癌3例，鱗癌1例，神經內分泌癌1例)，男性50例，女性20例，年齡35～82歲，平均(59.0±9.7)歲。其中，高分化31例，中分化18例，低分化21例。按照美國癌癥學會肝外膽管癌TNM分期(2006版)：Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期12例，Ⅳ期3例；Ⅰ+Ⅱ期為早期，Ⅲ+Ⅳ為進展期。所有患者術前未經放化療。選擇15例非腫瘤膽管上皮組織作為對照組，男性9例，女性6例，年齡32～61歲，平均(46.7±9.1)歲。

1.2試劑 鼠抗人STAT3單克隆抗體為英國Abcam公司產品，鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體為美國Zymed公司產品，ElivisionTM plus檢測試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3方法

1.3.1檢測方法 采用免疫組織化學鏈霉親和素-過氧化物酶法檢測標本中STAT3和Cyclin D1蛋白的表達。蠟塊經4 μm厚度連續切片后，置烤箱75 ℃烤片過夜；切片脫蠟至水：石蠟切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，95%、85%、75%酒精各5 min，自來水沖洗。用0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次?？乖迯停悍湃腓蹤此猁}緩沖液中(修復盒)加熱，保持92～98 ℃，15 min，室溫下自然冷卻。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。除去PBS，滴加一抗(STAT3稀釋濃度為1∶200，Cyclin D1稀釋濃度為1∶200)，濕盒內4 ℃冰箱內過夜。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗5 min×3次。除去PBS液，滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。除去PBS液，滴加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min。0.1 M PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。除去PBS液，滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3 min。自來水沖洗，蘇木素復染，鹽酸酒精分化。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片劑封片。染色過程中以結腸癌組織切片作為陽性對照，陰性對照以PBS替代一抗。

1.3.2結果判定 STAT3陽性細胞為胞漿或胞質內出現棕黃色的著色顆粒，Cyclin D1陽性染色位于胞核，為黃色、深棕黃色顆粒，從陽性腫瘤細胞百分數和染色深淺兩個方面評分。按陽性區域染色強度評分，無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；按陽性細胞所占比例評分，無陽性細胞計0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩分值相乘，0～3分為陰性，>3分為陽性。

1.4隨訪 通過電話、信訪、門診檢查的方式隨訪，隨訪率為100%。

1.5統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗；相關性采用Pearson直線相關分析；用Kaplan-Meier生存曲線法計算患者生存率并行log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1STAT3、Cyclin D1在膽管癌組織中的表達 STAT3主要表達于膽管癌細胞的胞漿和胞核，以胞漿為主，呈棕黃色顆粒。70例膽管癌組織中43例(61.4%)STAT3蛋白表達陽性，15例非腫瘤膽道上皮組織中6例(33.3%)STAT3蛋白表達陽性。STAT3蛋白在膽管癌組織中的表達高于非腫瘤膽道上皮組織中的表達，差異有統計學意義(χ2=3.967，P=0.046)。Cyclin D1陽性染色位于細胞核內，為黃色、棕黃色顆粒。在部分正常膽管組織和膽管癌細胞中，細胞漿也呈淡棕黃色著色。70例膽管癌組織中30例(42.9%)Cyclin D1蛋白表達陽性，15例非腫瘤膽道上皮組織中2例(13.3%)Cyclin D1蛋白陽性表達。Cyclin D1蛋白在膽管癌組織中的表達高于非腫瘤膽道上皮組織中的表達，差異有統計學意義(χ2=4.587，P=0.032)。見圖1，圖2。

2.2STAT3、Cyclin D1表達與膽管癌臨床病理特征的關系 STAT3表達與膽管癌臨床進展相關，Ⅲ+Ⅳ期STAT3蛋白表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，中低分化組STAT3蛋白表達明顯高于高分化組(P<0.05)，淋巴結轉移組STAT3蛋白表達明顯高于高分化組(P<0.05)；年齡、性別、腫瘤大小間STAT3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。Cyclin D1表達與膽管癌組織學分級密切相關，中低分化組Cyclin蛋白表達明顯高于高分化組(P<0.05)，淋巴結轉移組Cyclin D1蛋白表達明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期間Cyclin D1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1STAT3在膽管癌組織中的表達(免疫組織化學染色×20)

Figure1ExpressionofSTAT3incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×20)

圖2CyclinD1在膽管癌組織中的表達(免疫組織化學染色×20)

Figure2ExpressionofCyclinD1incholangiocarcinoma(immunohistochemicalstaining×20)

表1 膽管癌組織中STAT3、Cyclin D1蛋白表達與膽管癌臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between expression of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma and clinical pathological factors (例數，%)

2.3STAT3與Cyclin D1蛋白相關分析及對膽管癌患者預后的影響 在STAT3蛋白陽性表達43例中Cyclin D1蛋白表達陽性23例，而STAT3蛋白陰性表達27例中Cyclin D1蛋白表達陰性20例，STAT3與Cyclin D1蛋白在膽管癌組織中的表達呈明顯正相關關系(r=0.271，P=0.023)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，STAT3與Cyclin D1共同陽性表達組中位生存時間為13個月，共同陰性表達組中位生存時間為47個月。STAT3與Cyclin D1共同陰性表達組生存時間明顯長于共同陽性表達組，差異有統計學意義(χ2=19.560，P=0.000)，見表2，圖3。

表2 膽管癌組織中STAT3與Cyclin D1表達的相關性Table 2 Correlation between expression of STAT3 andCyclin D1 in cholangiocarcinoma tissues (例數)

圖370例膽管癌生存曲線

Figure3Theoverallsurvivalcurveof70casesofpatientswithcholangiocarcinoma

3 討 論

膽管癌的發生是一個多因素、多基因改變相互作用的復雜過程，膽管癌的預后因而也受到各種因素的影響．目前在對腫瘤的具體發生機制不甚明了的情況下，對腫瘤的治療仍以手術為主，輔以放療、化療及其他治療，但是效果仍然很差。因此，尋找能有效反映膽管癌惡性生物學行為，判斷患者預后的指標就顯得很重要。

STAT3是一類結構保守的轉錄因子家族成員，除了具有STAT 家族成員共同的結構之外，還含有N端氨基酸保守序列、與蛋白相互作用的螺旋區域、DNA結合域、SH2結構域、保守的Tyr705以及位于C端的編碼轉錄激活區域。作為多種細胞因子及生長因子下游重要的信號轉錄因子，廣泛參與細胞的生長、增殖、分化過程，維持機體微環境穩態，調控免疫功能。STAT3目前被公認為癌基因之一，是腫瘤研究的熱點。在正常細胞中，其活性是瞬間的，當在某些外在刺激或內在因素的作用下[10]，STAT3持續性活化，并且持續位于細胞核中，恒定地調控目的基因的轉錄，如抗凋亡基因MCL-1、誘導細胞凋亡基因Bak、細胞周期調控基因Cyclin D1以及血管內皮生長因子、生存素等，促使細胞惡性增殖，最終導致惡性腫瘤的產生[11-12]。

Cyclin D1是細胞周期素家族成員之一，Cyclin D1基因位于第11號染色體短臂上，長約15 kd，含5個外顯子和4個內含子，編碼由295個氨基酸組成，相對分子質量為34 000的蛋白質。Cyclin D1與依賴周期素的激酶和激酶抑制因子是細胞生長發育過程中細胞周期調控的主要因子。Cyclin D1在正常細胞中的功能是促進細胞周期從G1期進入S期，啟動DNA的合成，參與細胞的增生、分化和凋亡，當其表達過量時，可使細胞持續增殖，若失控則導致多種腫瘤的形成，故也被視為一種癌基因[13-14]。國內學者證實通過轉染誘導Cyclin D1過表達促進了宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞增殖和上皮間質轉化[15]。

STAT3通過激活相關的靶基因，能夠引起細胞癌變的關鍵性基因產物的過度表達，Cyclin D1為其重要靶基因之一。STAT3可能通過調節細胞周期蛋白依賴性激酶/細胞周期素復合物與細胞周期依賴性激酶抑制因子成員之間的平衡，縮短細胞周期中G1至S這一時相，進而調節惡性腫瘤細胞異常增殖，介導細胞惡性轉化。有學者報道STAT3、Cyclin D1可能促進了惡性黑色素瘤的發生、浸潤和淋巴轉移，兩者具有協同作用[16]。Li等[17]報道食管鱗癌STAT3、Cyclin D1陽性表達患者的預后差。表明兩者在腫瘤預后判斷方面存在一定價值。

目前STAT3、Cyclin D1在膽管癌中的共表達情況以及預后的相關性未見報道。本研究發現，STAT3、Cyclin D1在膽管癌組織中的表達較非腫瘤膽管組織中的表達明顯升高。STAT3蛋白表達與膽管癌的臨床進展、淋巴結轉移以及組織學分級密切相關，臨床進展期(Ⅲ+Ⅳ期)、有淋巴結轉移以及中低分化膽管癌患者的STAT3陽性表達率明顯高于臨床早期(Ⅰ+Ⅱ期)、無淋巴結轉移及高分化患者；而Cyclin D1蛋白表達與膽管癌的淋巴結轉移以及組織學分級密切相關，有淋巴結轉移以及中低分化膽管癌患者的Cyclin D1陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移及高分化患者。說明STAT3、Cyclin D1可能參與了膽管癌的發生、增殖、浸潤、轉移。STAT3與 Cyclin D1的表達呈高度一致性，呈明顯的正相關關系，表明STAT3可通過調控Cyclin D1促使細胞周期的運轉，從而參與膽管癌發生發展，并促進膽管癌的浸潤轉移。生存分析顯示兩者共同陽性表達患者的預后明顯差于陰性表達患者，表明兩者在膽管癌預后分析方面具有重要的參考價值，可作為膽管癌患者預后評估的有效指標。

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TheexpressionandclinicalsignificanceofSTAT3andCyclinD1incholangiocarcinoma

WANG Wen-bin1, LIU Bing2, WANG Tian-yang1, LYU Hai-tao1, LIU Xue-qing1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China； 2.DepartmentofOncology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of signal transducer and activator of transcription 3(STAT3 ) and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma tissues.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect the expression of STAT3 and Cyclin D1 in 70 cases of cholangiocarcinoma and 15 cases of non-tumor bile duct epithelium.ResultsThe expression of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma(61.4%, 42.9%) was significantly higher than that in non-tumor bile duct epithelium(33.3%, 13.3%)(P<0.05). STAT3 expression significantly correlated with clinical stage, lymph nodes metastasis and tumor grade. The positive rates of STAT3 was significantly higher in the stage Ⅲ+Ⅳ group , lymph nodes metastasis group and moderately or poorly-differentiated group than those in stageⅠ+Ⅱ group, no lymph nodes metastasis group and well-differentiated group(P<0.05). Cyclin D1 expression was significantly correlated with lymph nodes metastasis and tumor grade. The positive rates of Cyclin D1 was significantly higher in the lymph nodes metastasis group and moderately or poorly-differentiated than those in no lymph nodes metastasis group and well-differentiated. A significant correlation was found between the expressions of STAT3 and Cyclin D1 in cholangiocarcinoma(P<0.05). The survival time of negative expression of STAT3 and Cyclin D1 group was longer than that of positive expression of STAT3 and Cyclin D1 group(P<0.01).ConclusionSTAT3 and Cyclin D1 may be important biomarkers in carcinogenesis and progression of cholangiocarcinoma.

bile duct neoplasms; activating transcription factor 3； Cyclin D1

2017-05-05；

2017-06-02

王文斌(1973-)，男，河北保定人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，醫學博士，從事肝膽外科疾病診治研究。

R735.8

A

1007-3205(2017)12-1397-05

劉斯靜)