Atg5和Atg7在兒童急性白血病中的表達及相關分析

吳曉莉，高 興，劉 娜，趙曉慶，馬夫天，張寶璽

(河北醫科大學第二醫院兒科，河北 石家莊 050000)

·論著·

Atg5和Atg7在兒童急性白血病中的表達及相關分析

吳曉莉，高 興，劉 娜，趙曉慶，馬夫天，張寶璽*

(河北醫科大學第二醫院兒科，河北 石家莊 050000)

目的探討Atg5蛋白、Atg7蛋白表達水平與兒童急性白血病(acute leukemia，AL)發生發展的關系。方法選取初診未治AL患兒50例，根據疾病類型分為急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)組30例，急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)組20例；另選取非惡性血液病患兒20例為對照組。采用免疫組織化學染色法對骨髓細胞中Atg5蛋白、Atg7蛋白進行檢測。結果ALL、AML組Atg5蛋白表達陽性率高于對照組，AML組Atg7蛋白表達陽性率高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。Spearman秩相關性分析結果顯示Atg5與Atg7蛋白表達水平無相關性(rs=0.333，P>0.05)。結論Atg5蛋白在AL中表達上調，可能參與了AL的發生發展；Atg7蛋白在AML中表達升高，可能與AML的發生發展有關。

白血病,淋巴樣；白血病，髓樣；兒童

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.014

急性白血病(acute leukemia，AL)是一類常見的異質性較強的造血干細胞惡性增殖性疾病，在兒童惡性疾病中，白血病的發病率最高，其中AL占90%～95%，但其病因及發病機制至今尚未完全明了。細胞自噬參與腫瘤的發生發展過程，其對腫瘤的生物學作用是一把雙刃劍，其活性降低或增強可導致正常細胞發生惡性轉化或促進腫瘤進展。目前認為自噬與兒童AL關系密切，但相關研究較少。自噬相關基因Atg5、Atg7蛋白在自噬體的形成過程中起關鍵作用，Atg5蛋白在自噬過程中起調控作用，Atg7蛋白參與自噬體的形成，其編碼的蛋白直接參與自噬體的形成，基因的轉錄翻譯影響因素多，尚未見用免疫組織化學染色的方法直接測定骨髓中Atg5、Atg7蛋白表達水平的研究，并且目前對于Atg7蛋白的研究多局限于基礎實驗。本研究應用免疫組織化學染色的方法，檢測在自噬體形成過程中Atg5、Atg7蛋白表達水平，探討自噬在白血病中的分子機制以及自噬與兒童AL發生發展的關系，旨在為AL的治療提供新思路及策略。現報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2014年1月—2016年6月河北醫學大學第二醫院兒科住院的初診未治AL患兒50例，根據疾病類型分為急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)組30例，男性17例，女性13例，年齡1～13歲，平均(5.4±2.2)歲；急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)組20例，男性13，女性7例，年齡1～12歲，平均(5.5±2.3)歲。另選取同期非惡性血液病患兒20例為對照組，男性11例，女性9例，年齡6個月～13歲，平均(6.6±2.2)歲，其中免疫性血小板減少癥14例、營養性貧血6例。3組性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經過河北醫學大學第二醫院倫理委員會批準。均獲得患兒父母的知情同意并簽署知情同意書。

1.2標本采集 采集新鮮骨髓標本2 mL，自然凝固后經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片。

1.3主要試劑 兔抗人Atg5、Atg7 多克隆抗體(工作濃度分別為1∶100、1∶200)購自北京百諾威生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒、SP9001試劑盒購自北京中杉生物工程公司。

1.4方法 免疫組織化學染色法按照試劑盒說明書操作，石蠟切片常規脫蠟、脫苯、水化，抗原修復，結合一抗，滴加二抗，DAB染色，蘇木精復染、脫水、透明、封片、觀察，實驗中用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.5結果判定 Atg5、Atg7陽性表達為胞漿、胞膜內出現從淺黃到深黃顏色不等的顆粒。雙盲法閱片，參照Fromowitz陽性細胞半定量分級法，每例標本隨機觀察5個高倍視野(×400)，按陽性細胞染色強度及所占百分比進行積分：首先按染色強度評分，不染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；然后根據白血病細胞陽性細胞所占的白血病細胞百分數進行積分，染色數目≤25%為1分，染色數目26%～50%為2分，染色數目51%～75%為3分，染色數目>75%為4分；再根據2項相加所得總分進行分析，0～2分為陰性，3分及以上為陽性。

1.6統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗；相關性采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13組Atg5、Atg7蛋白表達比較 ALL、AML組Atg5蛋白表達陽性率高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；ALL與AML 組Atg5蛋白表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。AML組Atg7蛋白表達陽性率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；ALL與AML組、ALL與對照組Atg7蛋白表達陽性率差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組Atg5和Atg7蛋白表達比較Table 1 Expression level of Atg5 and Atg7 protein in three groups (例數，%)

*P<0.05與ALL組比較 #P<0.05與AML組比較(χ2檢驗)

2.2相關性分析 Spearman秩相關性分析結果顯示， Atg5與Atg7蛋白表達水平無相關性(rs=0.333，P>0.05)。

3 討 論

AL是造血系統的惡性增殖性疾病，是兒童最常見的惡性腫瘤。細胞自噬(autophagy)是所有真核生物共有的分解代謝途徑，是一種在進化上高度保守的分解代謝方式，通過溶酶體降解體內多余的蛋白質及亞細胞成分等并進行重新利用從而為細胞提供物質及能量基礎，以維護細胞代謝平衡和細胞內環境穩定[1]。自噬通過“自食”成為一種內在的細胞保護機制。因此，被稱為細胞的“清道夫”。細胞自噬參與了多種生理病理過程，在動物疾病的發生發展中起著重要的作用[2]。研究表明，細胞自噬與多種人類疾病密切相關，如神經退行性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病及腫瘤等疾病[3-4]。研究發現自噬在腫瘤的誘發和惡變中充當矛盾的角色。正常生理情況下，細胞通過自噬清理細胞代謝廢物，消除了致癌因素的產生，從而保持細胞的正常功能和基因組穩定性，故最初被認為是一種抑制惡性轉化的過程。而當自噬功能異常時，則會使致癌的有害產物不斷累積。近年來的研究表明，細胞自噬在各種白血病的發病和治療中均起著重要作用[5-6]，并且與白血病細胞的耐藥密切相關[7-8]。mTOR信號途徑的調控與自噬的活性密切相關[9]，在惡性腫瘤細胞中，由于缺氧、營養供應不足、酸中毒等情況，mTOR信號通路被抑制，細胞自噬活性增強，自噬為腫瘤的代謝提供基本的物質及能量基礎，為腫瘤細胞的再生和轉移提供了機會[10]。當腫瘤細胞面臨化療、放療后，會產生大量的破損細胞器、損壞的蛋白質等有害成分，自噬活性升高有利于及時清除這些有害物質，并提供應急的底物和能量，為修復受損細胞贏得時間。因此，自噬又可以促進腫瘤細胞的生長及轉移。細胞自噬在腫瘤中的研究尤其突出。糖皮質激素可以誘導細胞凋亡，故廣泛用于ALL治療中，研究顯示低劑量Bcl-2拮抗劑甲磺酸鹽可以解離Beclin1基因并且降低mTOR的活性，激活細胞自噬性死亡而逆轉耐藥，從而增強地塞米松的治療效果。此外，mTOR抑制劑依維莫司(RAD001)可以引起ALL幼稚細胞凋亡及自噬性死亡；依維莫司不僅可以提高Beclinl基因的表達而誘導自噬，同時可以通過磷酸化磷酸腺苷激活的蛋白激酶調節mTOR的活性，減少白血病細胞浸潤，提高患者生存率。三氧化二砷(As2O3) 可以促進腫瘤細胞發生自噬并利用自噬溶酶體降解PML/RARa蛋白，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的[11]。由此可見，自噬可作為白血病治療的新思路，但自噬在不同類型的腫瘤及同一類型腫瘤的不同發展時期，甚至同一腫瘤的不同部位，扮演著不同的角色。自噬與白血病關系的研究逐漸深入，希望借助此研究，使白血病的診斷、分型、化療方案的制定、預后評估等更加完善，以提高患兒的治愈率及生存質量。

自噬在腎透明細胞癌中表達水平下調，而這種下調與多種自噬相關蛋白的表達變化相關[12]。Atg5是參與細胞自噬的重要基因之一，位于人類染色體6p21，含384個核苷酸多態性位點，共編碼276個氨基酸。Atg5參與自噬體形成，促進自噬前體膜的延伸。發生突變的Atg5不能與Atg12相結合，影響自噬體的形成，使自噬表達下調。Atg7是一種泛素E1樣連接酶，可以激活泛素樣蛋白Atg12和哺乳動物中的所有3種Atg8。Atg7在自噬體的形成過程中起到了重要的調控作用。并且自噬相關因子Atg7結合并調控p53介導的細胞周期阻滯細胞老化，提示Atg7可能發揮抑制腫瘤形成的作用，但其具體機制尚不明確。為了進一步探索自噬在維持造血干細胞穩定性中的作用，有研究證實小鼠中Atg7的表達缺失破壞了正常造血干細胞的作用，推測Atg7在維持造血干細胞穩定性中起到十分關鍵的作用[13]。Atg5 mRNA在ALL骨髓細胞中表達水平升高，但在AML中表達水平降低，隨著危險度的增高，2種類型的白血病自噬活性均呈明顯下降趨勢[14]。并且有研究表明在嬰幼兒血管瘤增殖期[15]、前列腺癌、卵巢癌中，Atg5表達水平上調，但是在胃癌[16]、結腸癌等疾病中表達水平下調，可見同一指標在不同疾病，在同一疾病的不同階段及病理分型中表達水平亦有不同，更近一步證實自噬是復雜連續的過程。有研究通過RT-PCR方法證實在兒童AL骨髓單個核細胞中Agt3、Atg5表達水平增強，提示其自噬活性增強[17]。本研究采用免疫組織化學染色方法直接檢測Atg5編碼蛋白的表達情況，發現ALL和AML級Atg5蛋白表達陽性率高于對照組，但是在ALL與AML間表達差異無統計學意義，提示Atg5在AL的發生發展過程中起到重要的調控作用，本研究結果與RT-PCR方法實驗結論不謀而合。目前對Atg7的研究多局限基礎實驗，有實驗證實Atg7在維持造血干細胞穩定方面起到關鍵作用，發現Atg7在兒童AL與對照組相比表達水平差異無統計學意義，分別將ALL與AML、對照組進行比較，其表達水平差異無統計學意義，但是AML中Atg7表達水平呈上升趨勢，提示Atg7在AML的發病過程中起到調節的作用。Atg5、Atg7在各組間均有表達，但其表達水平受疾病種類、分型的影響。

總之，Atg5、Atg7在不同腫瘤中表達水平不同，自噬活性的變化可從腫瘤細胞凋亡、血管生成及抗腫瘤治療等多個層面影響腫瘤進程，今后仍需進一步研究，探索自噬相關基因在白血病發病中的臨界值，從而有利于治療方案的選擇。

[1] Zou M, Lu N,Hu C，et al. Beclin 1-mediated autophagy in hepatocellular carcinoma cells:implication in anticancer efficiency of oroxylin A via inhibition of mTOR signaling[J]. Cell Signal，2012，24(8)：1722-1732.

[2] 孔祥鳳，韋金英，段惠軍.自噬與糖尿病腎病關系的研究進展[J].河北醫科大學學報，2016,37(4)：477-480.

[3] Choi AMK,Ryter SW,Levine B. Autophagy in human health and disease[J]. N Engl J Med,2013,368(19):1845-1846.

[4] Nencioni A,Cea M，Montecucco F，et al. Autophagy in blood cancers:biological role and therapeutic implications[J]. Haematologica，2013,98(9):1335-1343.

[5] Helgason GV，Mukhopadhyay A，Karvela M，et al. Autophagy in chronic myeloid leukaemia:stem cell survival and implication in therapy[J]. Curt Cancer Drug Targets，2013,13(7):724-734.

[6] Yang X,Yu DD,Yan F,et al. The role of autophagy induced by tumor microenvironment in different cells and stages of cancer[J]. Cell Biosci，2015,5:14.

[7] Sui X,Chen R,Wang Z,et al. Autophagy and chemotherapy resistance:a promising therapeutic target for cancer treatment[J]. Cell Death Dis，2013,4:e838.

[8] 蔣卉男，胡榮，劉卓剛.自噬與白血病治療研究最新進展[J].中國實驗血液學雜志,2015,23(1):290-294.

[9] 謝利霞，趙飛宇，王冕,等.黃芩素通過抑制mTOR通路激活自噬促進神經細胞過量表達的alpha-突觸核蛋白清除[J].河北醫科大學學報，2017,38(5):585-589.

[10] Hamacher-Brady A. Autophagy regulation and integration with cell signaling[J]. Antioxid Redox Signal,2012,17(5):756-765.

[11] 閆兵,任雅麗,何群,等.自噬相關蛋白在腎透明細胞癌與癌旁組織中表達狀況的比較研究[J].中華泌尿外科雜志,2013,34(11):823-826.

[12] Isakson P,Bj?r?s M,B?e SO，et al. Autophagy contributes to therapy-induced degradation of the PML/RARA oncoprotein[J]. Blood,2010,116(13):2324-2331.

[13] Mortensen M,Soilleux EJ,Djordjevic G,et al. The autophagy protein Atg7 is essential for hematopoietic stem cell maintenance[J]. J Exp Med,2011,208(3):455-467.

[14] 李龍平,周勇軍,王新華,等.自噬基因Atg5和MAPLC3在急性白血病中的表達及其意義[J].實用檢驗醫師雜志,2014,6(3):153-156.

[15] 米萱,孫峰,仇利紅,等.自噬相關蛋白Atg5和LC3在嬰幼兒血管瘤中的表達[J].中國美容整形外科雜志,2016,27(6):343-346.

[16] 周藝,聶玉強,林泳,等.miR-181a及其靶基因Atg5在胃癌中的表達及臨床意義[J].胃腸病學和肝病學雜志,2016,25(3):276-278.

[17] 王叨，敖苗，孫玉峰，等.自噬基因Atg3與Atg5在兒童急性白血病骨髓單個核細胞中的表達及臨床意義[J].中華實用兒科臨床雜志,2014,29(3):219-222.

ExpressionandcorrelationanalysisofAtg5andAtg7inchildhoodacuteleukemia

WU Xiao-li, GAO Xing, LIU Na, ZHAO Xiao-qing, MA Fu-tian, ZHANG Bao-xi*

(DepartmentofPediatrics,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveTo explore the relationship of the expression level of Atg5 protein and Atg7 protein with the occurrence and development of leukemia.MethodsFifty children who were newly diagonesd with acute leukemia(AL) were collected as experiment group, including 30 cases of acute lymphoblastic leukemia(ALL) and 20 cases of acute myelogenous leukemia(AML). Twenty cases of non-malignant hematological disease children were selected as control group. Immunohistochemical staining was used to test the expression level of Atg5 protein and Atg7 protein in bone marrow cells.ResultsThe positive rate of Atg5 protein expression in ALL and AML group was higher than that in control group, and the positive rate of Atg7 protein expression in AML group was higher than that in control group, the difference was statistically significant(P<0.05). Spearman rank correlation analysis showed that there was no correlation between the expression of Atg5 and Atg7 protein(r=0.333,P>0.01).ConclusionAtg5 protein is up-regulated in AL and may be involved in the development of AL. The elevated expression of Atg7 protein in AML may be related to the occurrence and development of AML.

leukemia, lymphoid； leukemia, myeloid； child

2017-07-27；

2017-08-15

河北省科技計劃項目(152777206)

吳曉莉(1973-)，女，河北辛集人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，副教授，醫學博士，從事小兒血液腫瘤疾病診治研究。

*通訊作者

R733.7

A

1007-3205(2017)1418-12-04

趙麗潔)