乙酸致內臟痛模型小鼠杏仁中央核c-fos表達和動物焦慮樣行為的影響

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(1.南華大學人體解剖學教研室，湖南 衡陽421001；2.南華大學生理學教研室)

·基礎醫學·

乙酸致內臟痛模型小鼠杏仁中央核c-fos表達和動物焦慮樣行為的影響

李林1，曹文宇1，劉政海1，曾佳玉1，徐楊2，張仁麗1，萬煒1，向宇燕1*

(1.南華大學人體解剖學教研室，湖南 衡陽421001；2.南華大學生理學教研室)

目的探討乙酸所致內臟痛小鼠杏仁中央核(CeA)c-fos的表達時程變化及其與小鼠焦慮樣行為的關系。方法將雄性昆明小鼠隨機分為生理鹽水組、乙酸致內臟痛1 h組、乙酸致內臟痛2 h組以及乙酸致內臟痛24 h組，觀察各組動物1 h內腹壁收縮次數，采用曠場實驗對生理鹽水組、乙酸致內臟痛2 h組及乙酸致內臟痛24 h組動物焦慮樣行為進行檢測，行為學檢測結束后，采用免疫組織化學法分別檢測此3組動物杏仁中央核c-fos的表達變化。結果內臟痛評分表明，與生理鹽水組比較，乙酸致內臟痛1 h組動物腹壁收縮次數明顯增加(P<0.001)，而乙酸致內臟痛2 h組及乙酸致內臟痛24 h組動物腹壁收縮次數無明顯變化(P>0.05)；曠場實驗結果表明，與生理鹽水組比較，乙酸致內臟痛2 h組和乙酸致內臟痛24 h組中央格停留時間及穿越中央格子數均明顯減少(P<0.001)，而三組動物活動度間差異無統計學意義(P>0.05)。免疫組化結果表明，與生理鹽水組比較，乙酸致內臟痛2 h組及乙酸致內臟痛24 h組動物杏仁中央核c-fos表達增加(P<0.05)。結論乙酸致內臟痛小鼠焦慮情緒持續的時間遠遠長于疼痛本身，其機制可能與杏仁中央核神經元過度活化有關。

內臟痛； 杏仁中央核； c-fos； 焦慮

疼痛是一種與組織損傷或潛在損傷相關的不愉快的主觀感覺和情感體驗，它包括感覺和情感兩個層面：感覺層面主要指對疼痛程度的感受，情感層面則主要包括疼痛引起的焦慮樣或抑郁樣行為等，其中疼痛相關的負面情緒的影響比疼痛本身的危害更大[1-2]。內臟痛是病理性疼痛最常見的一種形式，常由機械性牽拉、痙攣、缺血和炎癥等刺激所致，但其定位不明確，患者常伴有不安、恐懼、焦慮樣行為[3-4]，然而，內臟痛引起個體焦慮行為改變的神經生物學機制仍不清楚。杏仁中央核(central nucleus of amygdala，CeA)是情感和疼痛感覺信號組成部分的一個集成中心，參與了疼痛等傷害性刺激誘導負性情緒的調節[5-6]。c-fos是一種存在于正常神經細胞核內的即刻早期基因，c-fos的表達與中樞對各種傷害性刺激的應答有密切關系，c-fos表達的數量與所受到的刺激強度正相關，是研究腦區激活的經典標記物[7]。本文旨在探討乙酸所致內臟痛小鼠杏仁中央核c-fos表達的時程變化及其與動物焦慮行為之間的關系。

1 材料與方法

1.1動物雄性昆明小鼠48只，體重22～25 g(湖南斯萊克景達提供)隨機分成生理鹽水組，乙酸致內臟痛1 h組、2 h組、24 h組，每組12只。所有小鼠均在本實驗室動物房適應性飼養7天，室溫控制在(24±2) ℃，12 h晝夜節律(光照時間08∶00-20∶00)，自由飲水與進食。

1.2動物分組

1.2.1 內臟痛模型的建立 乙酸致內臟痛1 h組(one hour after acetic acid-elicited visceral pain,AA-1h )、乙酸致內臟痛2 h組(two hour after acetic acid-elicited visceral pain,AA-2 h )以及乙酸致內臟痛24 h組(twenty-four hour after acetic acid-elicited visceral pain,AA-24 h )通過腹腔注射1.0%乙酸10 mL/kg建立內臟痛模型組[8]，生理鹽水組腹腔注射等量生理鹽水，AA-1h、AA-2 h及AA-24 h分別指乙酸腹腔注射后第1 h、第2 h以及第24 h。將小鼠單獨置于白色清潔飼養箱內，記錄所有動物1 h內的腹壁收縮次數。小鼠出現腹部收內凹、臀部歪扭和后肢伸張記為腹壁收縮1次。

1.2.2 焦慮行為檢測 將小鼠預適應實驗環境1 h后逐一置于曠場中央格區讓其自由活動5 min，并用攝像機記錄小鼠整個活動過程。采用單盲法觀察記錄小鼠中央格運動時間、中央格穿越格子數、總穿越格子數。每只小鼠檢測完畢后，均清潔曠場并予75%酒精清除實驗箱內氣味。實驗中小鼠穿越格子總數代表小鼠活動度，中央格穿越格子數越多、中央格停留時間越長說明其焦慮程度越輕[3]。

1.2.3 免疫組織化學染色 行為學檢測結束后，動物立即給予10% 水合氯醛深度麻醉，先用生理鹽水灌注，再用 4 ℃ 的4% 多聚甲醛固定液固定，取腦于 4 ℃冰箱后固定過夜，依次予15%、30%蔗糖充分沉糖后，冰凍切片機行連續冠狀切片，片厚30 μm。取一套切片依次經3%過氧化氫溶液處理及0.01%mmol/L PBS漂洗三遍后，5%羊血清室溫封閉2 h，加入羊抗兔多克隆抗體c-fos(santa cruz,1∶1 000)室溫下孵育2 h，然后轉至4 ℃冰箱過夜。0.01 mmol/L PBS沖洗，10 min×3次；加入山羊抗兔Ig G(1∶200)，室溫下孵育2 h；0.01 mmol/L PBS沖洗，10 min×3次；加入過氧化酶標記的ABC復合物(A液和B液比例為1∶200，提前30 min配制)室溫下孵育2 h；0.01 mmol/L PBS沖洗，10 min×3次；DAB顯色。切片常規脫水、透明和封片，400倍光學顯微鏡下進行觀察。光學顯微鏡采集圖像(MC55廣東明美科技公司)。

2 結 果

2.1注射乙酸后不同時間點動物內臟痛評分AA-1h組動物腹部劇烈疼痛，腹壁收縮次數顯著增加，而生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組均僅有極少數扭體行為發生(圖1)。統計結果表明，AA-1h組腹壁收縮次數明顯多于生理鹽水組(P<0.001)，而AA-2 h組及AA-24 h組與生理鹽水組比較腹壁收縮次數間差異無顯著性(P>0.05)。

2.2注射乙酸后不同時間點動物焦慮行為評分

曠場實驗檢測了生理鹽水組、AA-2 h組和AA-24 h組動物焦慮情緒(圖2)。與生理鹽水組相比，AA-2 h組和AA-24 h組小鼠在曠場中央格穿越格子數明顯減少(P<0.001)，AA-2 h組和AA-24 h組小鼠在曠場中央格停留的時間也明顯減少(P<0.001)，但各組動物在曠場中穿越的總格子數無差異(P>0.05)。

圖1 乙酸或生理鹽水對腹痛的時程影響與生理鹽水組比較，***P<0.001

圖2 生理鹽水或乙酸對小鼠焦慮行為的影響A：生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組中央格停留時間；B：生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組中央格穿越格子數；C：生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組穿越總格子數. 與生理鹽水組比較，***P<0.001;與生理鹽水組比較，**P<0.01

2.3注射乙酸后不同時間點小鼠杏仁中央核c-fos表達變化免疫組化結果顯示(圖3)，與生理鹽水組比較，AA2 h組和AA24 h組小鼠杏仁中央核c-fos陽性細胞數明顯增加(P<0.05)。而AA24 h組與AA2 h組比較c-fos陽性細胞數明顯減少(P<0.01)，杏仁中央核在內臟痛消失后仍然處于激活狀態。

圖3 生理鹽水或乙酸對杏仁中央核c-fos 表達的影響A、B、C為別為生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組杏仁中央核c-fos免疫組化結果，D為免疫組化結果直方圖，與生理鹽水組比較，***:P<0.001；與生理鹽水組比較， *:P<0.05；與AA-2 h組及生理鹽水組比較,##:P<0.01，bar=100 μm

3 討 論

內臟痛是臨床常見癥狀，隨著研究的深入，人們對內臟痛的認識也逐步加深。乙酸致內臟痛是指通過腹腔注射乙酸引起腹腔內臟器官出現化學性炎癥，使動物產生內臟疼痛。盡管存在由于乙酸可能造成腹壁緊張，導致軀體痛混雜的缺點，但這類模型操作方便，避免了麻醉藥對模型的影響，疼痛行為反應即時出現，變化明顯。通過Schmauss C[9]提出的評分方法能方便的量化疼痛行為指標，是目前應用較廣泛的內臟痛模型之一。本課題組前期實驗用大鼠復制了這一疼痛模型[10]；本實驗中，在小鼠腹腔注射乙酸后1 h內腹壁收縮次數明顯增加，同樣建立了炎性內臟痛模型。

炎癥痛的同時存在焦慮情緒，但疼痛的存在會影響焦慮行為的檢測。因此，本實驗在注射AA后2 h、24 h檢測了小鼠的疼痛行為，發現這兩個時間點動物的腹壁收縮次數顯著減少，提示動物的內臟痛消失，這一結果與文獻報道及本課題組之前的研究相一致[3,10]。進一步在曠場實驗中，注射乙酸后2 h動物無論是在中央格停留的時間及中央格穿越的次數明顯減少，但動物的活動度無明顯改變，提示動物在內臟痛消失后仍然出現焦慮樣行為，與早期報道的文獻相一致[3]；為了觀察動物焦慮情緒持續的時間，采用曠場實驗檢測動物在注射乙酸后24 h的焦慮樣行為，結果表明模型小鼠在中央格停留的時間及中央格穿越的格子數仍然顯著少于生理鹽水對照組，提示內臟痛伴隨的焦慮情緒遠遠長于疼痛本身，出現疼痛與情緒相互分離的現象。疼痛與情緒相分離這一現象在軀體疼痛，如福爾馬林疼痛、切割痛中已有報道[11-12]。

c-fos是一種存在于正常神經細胞核內的即刻早期基因，c-fos的表達與中樞對各種傷害性刺激的應答有密切關系，它的表達可反應神經元功能處于激活狀態，被認為是神經元活化的標志物[13]，也就是說表達c-fos蛋白的神經元可能參與了這種刺激信息的處理過程。早期的研究指出，乙酸誘導的內臟痛大鼠藍斑核、孤束核、下丘腦室旁核c-fos的表達增加，可以持續至乙酸注射后6 h[14]。與生理鹽水組相比，AA-2 h組、AA-24 h組動物杏仁中央核c-fos陽性細胞數目均顯著增加，提示杏仁中央核神經元處于激活狀態。與生理鹽水組相比，AA-2 h組、AA-24 h組動物在曠場實驗中表現出焦慮樣行為，這可能是與杏仁中央核神經元過度激活有關。在傷害性刺激結束后，杏仁中央核的激活被認為是誘導動物出現負性情緒的重要原因[5-6]。所謂表觀遺傳是指：基因表達發生了可遺傳的改變，但序列卻沒有發生變化。甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑及非編碼調控機制共同構成了表觀遺傳涉及的機制。表觀遺傳修飾在即早基因表達調控中具有重要的作用，研究表明c-fos基因甲基島甲基化水平的降低可能與其表達上調密切相關，并且參與動物行為的調節[15]。因此，推測在乙酸誘導內臟痛小鼠的焦慮樣行為產生的過程中，杏仁中央核的活化可能起到了關鍵的調控作用，其具體的機制仍然有待于進一步探討。

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Theexpressionofc-fosinthecentralnucleusofamygdalaanditsrelationshipwithvisceralpainrelatedanxiety-likebehaviourinmice

LI Lin,CAO Wenyu,LIU Zhenghai,et al

(DepartmentofClinicalAnatomy,SchoolofMedicine,UniversityofSouthChina,Hengyang,421001Hunan,China)

ObjectiveTo explore the expression of c-fos in the central nucleus of amygdala (CeA) and its relationship with acetic acid-elicited visceral pain (AAVP)related anxiety behavior in mice.MethodsMale Kunming mice were randomly divided into normal saline (NS)group and one hour after acetic acid-elicited visceral pain (AA-1h)group,two hours after acetic acid-elicited visceral pain (AA-2 h)group and twenty-four hours after acetic acid-elicited visceral pain (AA-24 h)group,visceral pain behaviours of all animals were measured by Writhing test while the anxiety-like behavior of NS group and AA-2 h group and AA-24 h group animals were determined by open field test (OFT).After the behavior test,the three group animals were scarified for the determination of c-fos in the CeA by immunohistochemistry.ResultsCompared to NS group， AA-1h group animals showed significantly increased number of writhes(P<0.001),while no statistics difference between NS group and AA-2 h or AA-24 h group(P>0.05，respectively) .In the OFT,AA-2 h or AA-24 h group showed significantly decreased time and number of crossing in the center compared with the NS group(P<0.001，respectively),while no difference in the locomotive activity was found among the three groups(P>0.05，respectively).The results of immunohistochemistry showed that compared to NS group,AA-2 h or AA-24 h group showed significantly increased number of c-fos positive cell in the CeA(NS vs AA-2 h,P<0.001,NS vs AA-24 h,P<0.05).ConclusionAA treatment leads to anxiety-like behavior in the mice even after the visceral pain disappeared,which might be due to the over-activated neuron in the CeA.

visceral pain； central nucleus of amygdala； c-fos；anxiety

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.007

2016-10-08；

2017-01-10

湖南省教育廳重點項目(編號：12A119) ，南華大學博士科研啟動基金(編號：2015XQD28)，湖南省(南華大學)研究生科研創新項目(編號：CX2016B479 )，衡陽市科技發展計劃項目(編號：2015KJ19).

*通訊作者，E-mal:xyy6887@163.com.

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蔣湘蓮)