SCN3A 基因突變型表達載體的構建及在 HEK 293 細胞中的表達

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(1.南華大學附屬南華醫院神經內科,湖南 衡陽 421002;2.深圳市羅湖區人民醫院神經內科;3.廣州醫科大學神經病學研究所)

·基礎醫學·

SCN3A基因突變型表達載體的構建及在HEK 293細胞中的表達

陳勇軍1，邱國真2，湯斌3，劉稀金1，李欣1，何妍妍1

(1.南華大學附屬南華醫院神經內科,湖南 衡陽 421002;2.深圳市羅湖區人民醫院神經內科;3.廣州醫科大學神經病學研究所)

目的體外構建含有SCN3A基因mRNA片段的質粒pCMV6-XL4-SCN3A的突變體N302S(c.905A>G)，為進一步的功能研究奠定實驗基礎。方法設計帶突變位點的引物，以野生型質粒為模板進行定點誘變，構建突變質粒。質粒經擴增純化后瞬時轉染到HEK293細胞中，24 h后用RT-PCR方法驗證目的基因的表達。結果重組質粒經酶切鑒定及測序證實突變成功。突變質粒轉入HEK293細胞系24 h后，RT-PCR可以檢測到目的基因的表達。結論本實驗成功地構建了SCN3A 基因突變型真核表達載體pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，并在基因水平上驗證了能在HEK293 細胞中表達。

SCN3A； 質粒； 表達； RT-PCR

癲癇是以腦部神經元異常高度放電所致的突發和短暫的中樞神經系統功能失常為特征的綜合征，電壓依賴性鈉離子通道作為神經系統興奮活動的基礎[1]，與癲癇的發生密切相關。在哺乳動物中，已經證實有功能表達的鈉通道亞型有9型[2-3]，亞型SCN1A早已明確為熱性驚厥相關性癲癇的主要致病基因[4-5]，而SCN3A與癲癇的相關性在近年才逐漸引起人們的關注[6-8]。本文作者對熱性驚厥相關性癲癇的病人進行SCN3A基因篩查時發現一例新發突變c.905A>G/p.N302S，該突變位于鈉離子通道的孔區，而正常人對照中沒有發現相應的突變，與人和哺乳動物各型鈉離子通道進行同源比對后發現高度保留，提示可能為致病性突變。為了進一步闡述基因突變后對蛋白功能的影響，如對鈉離子通道電生理功能的影響，以探討基因突變的致病機制，本實驗旨在構建SCN3A基因的突變表達載體，并在 HEK293 細胞上驗證表達，為深入的功能研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1質粒、菌株、細胞和主要試劑含有正常人SCN3A基因mRNA全長片段的真核細胞表達質粒(pCMV6-XL4-SCN3A)由北京敖銳東源生物科技有限公司(OriGene Technologies，Inc)合成。電轉化感受態大腸桿菌菌株(STBL2)購自于Invitrogen公司。HEK293細胞購自中科院上海細胞庫。定點誘變試劑盒(Stratagene公司)，EcoR I和Xhol I內切酶、DNA marker、膠回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，質粒提取試劑盒、轉染試劑(德國QIAGEN公司)，DMEM、優等胎牛血清(賽默飛世爾化學制品有限公司)，PCR擴增試劑盒(廣州東盛生物制品有限公司)，RNA提取試劑、逆轉錄試劑(Fermentas公司)，引物合成(上海生工生物工程有限公司)、millipore透析膜(美國密理博公司)。

1.2實驗方法

1.2.1 pCMV6-XL4-SCN3A野生質粒鑒定 將pCMV6-XL4-SCN3A全長序列輸入軟件Primer Genesis中(方法：進入http://primergenesis.com，點擊DNA Tools，輸入堿基序列，點Restriction Map顯示出所有酶切位點，選擇合適內切酶，能將該序列切為長短不同的兩個以上的便于辨認的片段)，選擇EcoR I，Xho I 酶切位點，其中EcoR I有兩個酶切位點，能將該質粒切為長短不同的三個片段，依次為：2 514 bp、3 637 bp、7 526 bp。配置雙酶切體系：取質粒約150 ng，EcoRI 0.5 μL，XhoI 0.5 μL,10×buffer 1 μL，加ddH2O 到10 μL。37 ℃孵育45 min，使用1%瓊脂糖凝膠電泳。選取酶切正確的質粒純化后送華大基因公司測序，參照文獻[9]所列引物測通SCN3A基因編碼區全長序列，無堿基改變的質粒作為定點誘導突變的模板。

1.2.2 pCMV6-XL4-SCN3A-N302S突變質粒構建 采用Quick change XL site-directed mutagenesis kit定點誘變試劑盒，按說明書要求設計引物及進行擴增，正反向引物為反向互補，所用引物如下。

SCN3A-N302S-F：5′-GGCACAATGGATTCAAGTGGGACATTTGTTAATG -3′，SCN3A-N302S-R：5′-CATTAACAAATGTCCCACTTGAATCCATTGTGCC -3′。

(1)突變質粒的PCR擴增：反應體系為50 μL，按次序加入ddH2O 37 μL，10× Reaction buffer 5 μL，dNTP mix (10 mM)1 μL，正、反向引物(125 ng/μL) 各1 μL， PfuTurbo DNAPolymerase (2.5 U/μL) 1 μL，pCMV6-XL4-SCN3A 質粒(約20 ng) 1 μL，Quik Solution 3 μL。反應條件為：95 ℃預變性1 min，然后95 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，68 ℃延伸14 min，18個循環，最后68 ℃保溫40 min。(2)模板質粒的去除：在上述PCR產物中加入1 μL Dpn I于37 ℃水浴中處理1 h，以除掉母質粒。該步驟的原理是：Dpn I內切酶作用于來自大腸桿菌的甲基化的質粒DNA，而PCR擴增的新質粒DNA沒有甲基化，不會被Dpn I內切酶所消化。(3)突變質粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S的克隆：將上述酶切處理的PCR產物透析后，再電擊轉化STBL2感受態細胞，涂布于LB平板上(含100 μg/mL氨芐青霉素)，30 ℃條件下培養48～72 h，挑取單克隆入LB液體培養基(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，于30 ℃條件下振蕩培養36～48 h至液體混濁，提取質粒。

透析過程：取預冷的20% PEG8000透析液2 mL加入小培養皿內，培養皿平放冰上，夾取millipore透析膜一張平放浮于透析液面上，光面朝上，PCR產物小心滴在膜上，透析1 h。

電轉化過程：吸取透析剩余液體約5 μL，加入40 μL大腸桿菌STBL2電擊感受態細胞中混勻，冰浴3 min。混合液吸入0.1 cm電擊杯中，注意避免產生氣泡，EcoⅠ模式按壓pusle鍵一次，電擊參數為1.75 kV、5.00 ms。電擊杯內快速加入500 μL SOC混勻吸出，加入1.5 mLEP管內，然后經37 ℃ 200 rpm振搖1 h復蘇后涂板。

(4)pCMV6-XL4-SCN3A-N302S質粒的鑒定和擴增：按QIAGEN質粒提取試劑盒抽提質粒，Ecol I和Xhol I雙酶切初步鑒定，電泳條帶符合預期的質粒送華大基因公司測序。測序符合c.905A>G而其它位點堿基無變化的質粒為突變成功，留取菌液150 μL加入150 mL LB液體培養基中擴大搖，30 ℃條件下持續振蕩培養24 h，提取質粒，經酶切正確者測濃度后放入-20 ℃保存，供后續實驗使用。

1.2.3 質粒異源表達的鑒定

(1)細胞培養及轉染：以含10%FBS的DMEM高糖培養基培養HEK293細胞，6孔板內接種，待細胞融合近80%時,按照每孔2.0 μg pCMV6-XL4-SCN3A野生型或突變型質粒及15 μL PolyFect Transfection Reagent的比例進行轉染。步驟為：按上述比例混合的質粒加入不含抗生素和血清的DMEM 100 μL中，再加入轉染試劑15 μL 輕輕混勻，室溫靜置8 min；吸走培養板內舊液，更換新的含血清和抗生素的培養液，輕輕吸取轉染復合物從各個方向均勻滴入板內，小心放入培養箱內繼續培養。轉染24 h后進行RNA提取。(2)基因水平的表達：參照Thermo Scientific GeneJET RNA Purification Kit說明書步驟提取RNA，測濃度后取2 μL電泳觀察RNA條帶，條帶清楚者進行逆轉錄反應，逆轉錄參照RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行，反應產物放置-20 ℃保存。以上述步驟得到的cDNA產物為模板，設計目的基因片段和內參基因片段引物(表1)，擴增相應的片段(目的基因和內參基因片段采用獨立的PCR體系擴增，但加入cDNA量相同)，PCR產物各取4 μL用2%凝膠電泳，條帶符合預期大小的送華大基因進一步測序驗證序列是否正確。

表1目的基因和內參基因片段引物

引物SCN3A基因內參GAPDH基因正向5'CGGAAGTCAGAAAGAGAAGG3'5'CTGGTAAAGTGGATATTGTTG3'反向5'CAAATAGTGATGGCAAGATC3'5'GAAATCCCATCACCATCTTC3'

2 結 果

2.1突變質粒的成功構建

2.1.1 原始質粒與突變質粒的酶切鑒定 pCMV6-XL4-SCN3A質粒大小為13.7 kb(圖1A)。EcoR I和Xho I雙酶將質粒切為三個片段 ：2.6 kb、3.6 kb和7.5 kb(圖1B)。突變質粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S大小不變，上述雙酶切位點沒有破壞，仍能將質粒切為相應大小三個片段的可能為突變成功的質粒，進一步驗證需要測序證實。

圖1 pCMV6-XL4-SCN3A質粒模式圖 A：及酶切圖；B：Marker(DL 500～12000)

2.1.2 原始質粒與突變質粒的測序圖 原始質粒編碼區全長測序證實未出現突變。突變質粒目標位點(c.905A>G)突變成功，其它編碼區全長證實未出現意外突變。質粒突變前后測序峰圖對照如下(圖2)。

2.2基因表達水平的鑒定提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳顯示完整的三條RNA電泳帶(5S、18S、28S)。紫外分光光度計測定RNA的260 nm/280 nm吸光度值比為1.8～2.0，濃度為1～2 μg/μL。經逆轉錄獲得cDNA產物。以野生型和突變型質粒的cDNA為模板擴增目的片段，電泳圖譜均在約270 bp處出現條帶，與預期271 bp大小相符，提示質粒在基因水平上成功表達，片段送測序證實為目的片段序列。各條帶右側為約160 bp的條帶，是內參GAPDH片段，與預期158 bp大小相符(圖3)。由此表明野生型和突變型質粒在基因水平上都得到了表達。

3 討 論

SCN3A基因與癲癇相關的報道至今仍然較少，而其致癲癇的機制仍然是探索性的[10]，但是目前報道與癲癇相關的5例SCN3A基因突變都進行了電生理功能研究[6-7]。本文作者在1例癲癇病人中新發現了SCN3A-N302S突變，采用定點誘導突變的方法成功構建了含有突變點的質粒pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，隨后將野生型及突變型質粒轉染到HEK293細胞中進行異源表達，在基因水平上得到了驗證，提示了SCN3A基因體外表達的細胞模型成功構建。質粒定點誘變的基礎為PCR技術，為了保證外源性DNA能夠擴增、繁殖，形成大量拷貝，必須與載體連接進入受體細胞后形成一個復制子，即形成能夠在細胞內進行自我復制的遺傳因子。載體是基因克隆中的一個重要組成部分，缺乏載體的幫助，外源DNA很難進入到受體細胞內，即使能夠進入往往也不能復制和表達，因為這些外源性DNA一般不帶有復制控制系統。本文用到的質粒載體，全長4 707 bp，帶有巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子等。其中SV40啟動子可以使基因在多種哺乳細胞中表達，使外源基因穩定表達成為可能，并且對外源基因的插入片斷的長度沒有太多限制。pCMV6-XL4載體內插入了長度為8 994 bp的SCN3AmRNA全長，獲得的質粒大小在10 Kb以上，擴增的難度加大、堿基錯配率提高、成功率下降，Stratagene試劑盒使用了高保真酶進行擴增，高度保證了擴增的忠實性，使得一步法構建質粒操作過程變為可能。為了減少堿基的錯配率，反應的循環次數和常規相比明顯減少，但是延伸的時間明顯延長(延伸14 min，18個循環)。電轉化是利用高壓電擊細胞，使細胞壁和細胞膜瞬間被擊穿，形成能通過外源物質的跨膜通道，外源DNA 分子通過該通道進入細胞內[11]。對于大分子質粒，PCR產物經透析后進行電轉化極大地提高了轉化效率，為基因成功克隆提供了保障。

圖2 測序峰圖對照 A： 野生型； B：突變型c.905A>G

圖3 HEK293細胞SCN3AmRNA條帶及基因表達 A：RNA電泳條帶； B:野生型和突變型基因目的片段及各自對應的內參片段

綜上所述，應用基因定點誘變技術，成功的將含有野生型的SCN3A基因的質粒pCMV6-XL4-SCN3A誘變為突變型的pCMV6-XL4-SCN3A-N302S，為進一步的基因突變功能研究，如膜片鉗電生理功能研究奠定了基礎。

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ConstructionofSCN3AgenemutantexpressionvectoranditsexpressioninHEK293cells

CHEN Yongjun,QIU Guozhen,TANG Bin,et al

(DepartmentofNeurology,NanhuaHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo construct the mutant N302S (c.905A>G) of plasmid pCMV6-XL4-SCN3A containing the SCN3A gene mRNA fragment in vitro,and provide experimental basis for further functional studies.MethodsThe primers with mutation sites were designed and the mutant plasmids were constructed by site-directed mutagenesis using wild-type plasmids as templates.The recombinant plasmid was transiently transfected into HEK293 cells,and the expression of the target gene was verified by RT-PCR after 24 hours.ResultsRecombinant plasmid digestion and sequencing confirmed that the mutation was successful.The expression of the target gene was detected by RT-PCR after transfection of recombinant SCN3A eukaryotic expression plasmid into HEK293 cell line.ConclusionThe SCN3A gene mutant eukaryotic expression vector pCMV6-XL4-SCN3A-N302S was successfully constructed and expressed in HEK293 cells at the gene level.

SCN3A; plasmid; expression; RT-PCR

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.006

2016-10-11；

2016-12-30

湖南省教育廳立項課題資助(15C1206)及衡陽市科技局課題資助(2015KJ59).

R349

A

蔣湘蓮)