低溫海水硝化細菌富集培養過程及影響因素

劉洋　梁滬蓮　劉意康　閆坤朋　顧錦釗　宋志文

摘 要：多數硝化細菌的適宜溫度是28 ℃左右，低于15 ℃硝化活性會基本喪失。為解決這一問題，通過構建低溫海水硝化細菌富集培養裝置，在11～14 ℃、pH值7.0～7.8、溶解氧4.0～4.5 mg/L條件下，經過150 d富集培養得到AOB硝化強度為21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB硝化強度為93 mg（NO-2-N）/（L·d）的富集培養物。對富集培養物研究表明，當溫度為15 ℃時，pH值為8.0、初始氨氮濃度為30 mg/L條件下氨氧化活性較強；當溫度為15 ℃時，pH值為7.0、初始亞硝氮濃度為80 mg/L的條件下亞硝酸鹽氧化活性較強。

關鍵詞：硝化細菌；低溫富集培養；pH；底物濃度

硝化細菌為化能自養，生長緩慢，對環境因素變化敏感[1-2]。其中溫度對硝化細菌的活性影響較為明顯，多數硝化細菌的適宜溫度為28 ℃左右，當溫度低于15 ℃時硝化作用急劇下降甚至停止[3]。在冬季海水養殖中，多數硝化細菌無法耐受其低溫環境，活性被極大抑制，對養殖狀況不利[4]。自然界中耐低溫的硝化細菌數量和種類較少，因此低溫海水環境中硝化細菌的馴化和富集培養顯得尤為重要。

目前，對于硝化細菌的富集培養、分離純化與篩選方面的特性研究與應用較為廣泛[5-6]，其中也不乏對低溫環境硝化細菌富集、篩選與多樣性方面的研究[7-9]，然而目前大多是針對淡水低溫環境硝化細菌的富集培養，對海水低溫條件下的應用實踐（如工廠化冷水魚養殖系統）可能效果甚微。因此，本研究構建一種低溫海水型硝化細菌富集培養方法，研究了低溫海水環境中不同條件對硝化細菌活性的影響，確定其適宜的生長環境，同時探究了無機氮鹽去除率與底物濃度的關系，為低溫海水硝化細菌富集培養條件的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用海沙取自冬季青島某海水浴場3～5 cm淺層海沙；氨氧化細菌（AOB）培養液由氯化銨（AR）、碳酸氫鈉（AR）、人工海水配制而成；亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）培養液由亞硝酸鈉（AR）、碳酸氫鈉（AR）、人工海水配制而成。

1.2 試驗方法

1.2.1 富集培養方法 培養裝置見圖1。海沙經適當處理后分別加入2個燒杯，燒杯有效體積為5 L，兩燒杯內加入海沙體積各1 L。分別向燒杯中加入事先配好的人工海水各4 L，鹽度為30‰。將燒杯置于水箱，水缸液面略低于燒杯液面，燒杯中配備攪拌和曝氣裝置。使用冷水循環機將水溫控制在11～14 ℃，使用攪拌器進行充分混合，控制溶解氧含量在4.0～4.5 mg/L。定期加入碳酸氫鈉溶液以調節pH。初期分別向AOB和NOB燒杯中加入氯化銨和亞硝酸鈉，使培養基中氨氮和亞硝酸鹽氮濃度達到10 mg/L。每隔24 h檢測燒杯中氨氮和亞硝酸鹽氮濃度，當濃度達到較低水平時分別補充至10 mg/L，當硝化速率提高時，分別將培養基中氨氮和亞硝氮濃度提高至30 mg/L和100 mg/L。培養過程中每隔24 h測定氨氮和亞硝酸鹽氮濃度。

圖1 培養裝置示意圖

1.2.2 影響因素研究方法 試驗通過控制溫度、DO等相同條件，選取pH與底物濃度作為環境變量以探究培養所得低溫AOB和NOB菌種的適宜生長環境。

1.2.3 水質監測方法 氨氮和亞硝酸鹽氮分別采用納氏試劑分光光度法和N-（1-萘基）乙二胺光度法測定[10]；溶解氧使用哈希溶解氧儀（HACH-HQ30d）測定；pH使用哈希便攜式pH計（HACH-HQ30d）測定。

2 過程與步驟

2.1.1 菌種富集與篩選分離 菌種富集過程在1.2.1的基礎上進行，當富集培養物硝化強度達到一定水平不再升高時，將AOB和NOB培養基靜置2 h后分別加入一定量硅藻土材料（主要成分為SiO2，孔隙度大、吸收性強、化學性質穩定、成本低廉）便于硝化細菌吸附。為篩選和純化所得菌種，加入硅藻土一段時間后需再次將培養基靜置沉淀并分離出海沙，然后再次向AOB和NOB培養基中各添加一定量硅藻土。

2.2.2 pH對硝化強度的影響 各取等量4份AOB和NOB培養液200 mL于8個500 mL搖瓶中（搖瓶經高溫滅菌處理），在15 ℃、溶解氧45～5 mg/L、避光條件下，分別投加氯化銨和亞硝酸鈉使氨氮和亞硝酸鹽氮底物濃度為20 mg/L和40 mg/L，調節pH分別為6.5、7、7.5、8，每隔6 h檢測氨氮和亞硝酸鹽氮濃度，測定不同pH條件下氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率。

2.2.3 底物濃度對降解效率的影響 各取等量4份AOB和NOB培養液200 mL于8個500 mL搖瓶中（搖瓶經高溫滅菌處理），在15 ℃、溶解氧4.5～5 mg/L、pH值7～7.5、避光條件下，分別投加氯化銨使初始氨氮濃度分別為10、20、30、40 mg/L，分別投加亞硝酸鈉使亞硝酸鹽氮初始濃度分別為40、80、120、160 mg/L，每隔6 h檢測氨氮和亞硝酸鹽氮濃度，確定不同底物濃度條件下氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率。

3 結果與分析

3.1 硝化細菌富集培養過程

AOB和NOB富集培養過程中硝化強度變化見圖2、圖3，可以看出，初期海沙中AOB和NOB硝化強度極低，富集培養10 d后，AOB硝化強度為1.5 mg（NH3-N）/（L·d），NOB為0.5 mg（NO-2-N）/（L·d），隨后10～30 d，由于只添加無機氮鹽，培養基中有機物含量較低使得異養菌數量減少，與此同時，以無機氮鹽為主要營養來源的化能自養型AOB和NOB得以迅速繁殖，硝化強度得以提高，富集培養30 d時AOB為4 mg（NH3-N）/（L·d），NOB為4.5 mg（NO-2-N）/（L·d）。富集培養30～60 d時 ，由于海沙晶粒表面光滑少孔，對AOB和NOB的吸附能力有限，硝化細菌沒有足夠的附著場所進行生長繁殖和正常的生理活動，使得硝化強度在該段時間內趨于平緩。分別向AOB和NOB培養容器內各添加200 g硅藻土，由于硅藻土疏松多孔、比表面積大的特質使得游離的硝化細菌得以附著，硝化強度在60～90 d這段時間內有了明顯升高，硝化強度AOB由5 mg（NH3-N）/（L·d）升高至13 mg（NH3-N）/（L·d），NOB由12 mg（NO-2-N）/（L·d）升高至39 mg（NO-2-N）/（L·d）。為分離純化培養的硝化細菌，停止攪拌和曝氣，將培養基靜置一段時間后取走最初放入的海沙，此時，由于帶走一部分海沙上附著的硝化細菌使得原先的硝化強度有了一定程度的減弱。AOB硝化強度在培養120 d時降至9 mg（NH3-N）/（L·d），NOB在培養110 d時降至29 mg（NO-2-N）/（L·d）。隨后再次向培養容器中分別添加硅藻土200 g，硝化強度隨之增強，AOB為21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB為93 mg（NO-2-N）/（L·d）。經過150 d低溫馴化后AOB平均硝化強度由1.5 mg（NH3-N）/（L·d）提升至21 mg（NH3-N）/（L·d），為培養初期的14倍，NOB平均硝化強度由0.5 mg（NO-2-N）/（L·d）提升至93 mg（NO-2-N）/（L·d），為培養初期的186倍。endprint

圖2 AOB富集培養過程中硝化強度變化

圖3 NOB富集培養過程中硝化強度變化

3.2 pH對細菌硝化強度的影響

3.2.1 pH對AOB硝化強度的影響 pH對AOB的氨氮降解效果影響見圖4。由圖可以看出，對于AOB在pH為7.5到8.0范圍內氨氮降解速率高于pH在6.5到7.0之間，且當pH為8.0時氨氧化活性最高，為0.677 mg（NH3-N）/（L·h）。分別為pH在6.5、7、7.5時的1.22、119和1.03倍。分析原因可能是水溶液中NH3-N與NH+4-N存在電離平衡，NH3-N是氨氧化細菌的真正硝化基質，升高一定的pH可增加溶液中NH3-N占比從而提高基質有效性，促進氨氧化反應的進行。

圖4 pH對AOB硝化強度的影響

3.2.2 pH對NOB硝化強度的影響 pH對NOB的亞硝氮降解效果影響見圖5。由圖可以看出，對于NOB在pH為6.5到7.0范圍內亞硝氮降解速率高于pH在7.5到8.0之間，且當pH為7.0時亞硝酸鹽氧化活性最高，為1.33 mg（NO-2-N）/（L·h）。分別為pH在6.5、7.5、80時的1.04、1.07和1.24倍。分析原因可能是水溶液中HNO2-N與NO-2-N存在電離平衡，HNO2-N是亞硝酸鹽氧化細菌的真正硝化基質，降低一定的pH可增加溶液中HNO2-N占比從而提高基質有效性，促進亞硝酸鹽氧化反應的進行。

圖5 pH對NOB硝化強度的影響

3.3 底物濃度對降解效果的影響

3.3.1 底物濃度對AOB氨氮去除效果的影響 試驗結果見表1。由表可知，AOB富集培養物對于低濃度氨氮廢水（10 mg/L和20 mg/L）去除效果較好，處理36 h后氨氮去除率達90%以上，而對較高濃度氨氮廢水（30 mg/L和40 mg/L）去除效果較差。AOB對氨氮轉化速率隨底物濃度先升后降，在30 mg/L時速率達到峰值，為0.93 mg（NH3-N）/（L·h），是其余底物濃度轉化速率的2.16、1.35和1.98倍。轉化速率達到峰值后若底物濃度繼續增加，速率下降程度明顯，導致去除效果減弱。分析原因為，底物濃度過高產生的抑制作用和溶解氧條件的限制都會對AOB的生理活性造成負面影響，導致氨氮轉化速率下降，降解效果減弱。

3.3.2 底物濃度對NOB亞硝氮去除效果的影響 試驗結果見表2。由表可知，NOB富集培養物對于低濃度氨氮廢水（40 mg/L和80 mg/L）去除效果較好，處理24 h后亞硝氮去除率達90%以上，而對較高濃度氨氮廢水（80 mg/L和120 mg/L）去除效果較差。NOB對亞硝氮轉化速率隨底物濃度先升后降，在80 mg/L時速率達到峰值，為5.5 mg（NO-2-N）/（L·h），是其余底物濃度轉化速率的1.51、1.86和2.78倍。轉化速率達到峰值后若底物濃度繼續增加，速率下降程度明顯，導致去除效果減弱。分析原因與氨氮同理，底物濃度過高產生的抑制作用和溶解氧條件的限制都會對NOB的生理活性造成負面影響，導致氨氮轉化速率下降，降解效果減弱，且底物抑制對轉化速率影響程度更大。

3.3.3 無機氮濃度對硝化強度的影響 在底物濃度試驗中，發現氨氮和亞硝氮濃度對AOB和NOB的硝化強度具有一定影響，結果見圖6、圖7。由圖可知，隨著無機氮鹽濃度增大，AOB和NOB對氨氮和亞硝氮的降解速率均呈現先增大后減小的規律。分析原因，一方面當無機氮鹽濃度較低時，由于缺乏營養和能量來源，AOB和NOB的生長和活性受到抑制，導致硝化強度較弱；另一方面，隨著無機氮鹽濃度的升高，AOB和NOB獲得足夠的營養來源，硝化強度隨之增強。但當氨氮濃度超過30 mg/L、亞硝氮濃度超過80 mg/L時，由于底物對AOB和NOB活性的抑制使得硝化作用減弱，硝化強度隨之降低。由此可得，當氨氮和亞硝氮濃度分別達到30 mg/L和80 mg/L時可使AOB和NOB硝化強度達到較高水平，為完善富集培養條件和獲得更高效的硝化細菌提供了理論依據。

圖6 不同氨氮濃度下AOB硝化強度變化規律

圖7 不同亞硝氮濃度下NOB硝化強度變化規律

4 結論

經過長時間低溫馴化，AOB平均硝化強度由1.5 mg（NH3-N）/（L·d）提升至21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB平均硝化強度由0.5 mg（NO-2-N）/（L·d）提升至93 mg（NO-2-N）/（L·d），硝化細菌在低溫環境中具有較高活性，添加人工載體（如硅藻土）可增加硝化細菌附著面積，提高了對氨氮和亞硝酸鹽氮的轉化效率。

通過控制溫度、溶解氧以及光照條件等培養因素發現，AOB在pH為8.0、氨氮初始濃度為30 mg/L時硝化強度最高； NOB在pH為7.0、亞硝氮濃度為80 mg/L時硝化強度最高。

5 討論

硝化作用是在一系列酶促反應下進行的，低溫不僅影響細菌細胞膜流動性并且降低菌體內氧化酶活性，從而影響作用效果。本研究控制恒定低溫環境，根據不同培養階段硝化菌作用強度的變化相應增加無機氮鹽濃度以此提高菌群活性，對硝化強度變化進行分析，結合條件因素對其生理活性的影響，表明培養所得AOB和NOB在11～14 ℃低溫環境下仍具有較高生理活性，較之前相關研究在15～18 ℃時富集培養所得硝化菌種更具耐低溫特性[11]，具有較高實際應用價值。試驗發現NOB較AOB的生長具有滯后性且NOB往往晚于AOB進行硝化作用，可能由于NOB世代周期更長，對于環境因素要求較高且難以附著。有研究表明AOB繁殖一代需要6～8 h，而NOB繁殖一代需要16～18 h[12]，試驗結果與該研究規律相似。然而NOB在適應當前環境，生長繁殖狀態穩定后，其對亞硝酸鹽降解效果明顯高于AOB對氨的降解效果，具體原因需要進行更深層次方面的研究。研究pH對培養所得低溫硝化細菌活性的影響，表明AOB較NOB適宜在更高pH環境中生長，分析原因可能為NOB對硝化反應中間產物對其生長環境適應性的改變以及NOB本身生理活動狀態有關。此特征與楊紅艷[13]報道的AOB和NOB在不同pH生長條件的適應性相似（AOB適應pH范圍7.0～8.5，NOB適應pH范圍6.5～7.5）。底物濃度對微生物活性的影響主要表現在對其酶促反應進程的正負相關性的影響，從研究結果可以看出，在底物濃度很低時，硝化反應速度隨底物濃度的增加而加快，兩者呈正比關系。隨著底物濃度的升高，反應速度不再呈正比例加快，反應速度增加的幅度不斷下降。在氨氮和亞硝氮濃度分別達到30 mg/L和80 mg/L時，AOB和NOB硝化強度達到峰值，如果繼續加大底物濃度，反應速度不增反降，此時過高的底物濃度對硝化細菌作用產生抑制，說明硝化菌體內的氧化酶已被底物所飽和[14]，由此可知對于高濃度無機氮廢水導致硝化菌作用強度的減弱與處理耗時的增加同樣降低該環境下的去除率和降解效果。endprint

目前對低溫硝化細菌研究中的菌種大多來自冬季污水處理廠回流污泥，污泥中微生物數量和種類龐雜，有機物含量高，可能會對硝化菌的分離提純和培養產生一定影響。本研究中硝化菌種來自冬季海洋環境，有機物含量少，培養過程中異養菌對硝化菌生長的抑制作用較小，具有一定先天環境條件優勢，培養得到的硝化細菌具有較好的低溫耐受特性和較高的硝化性能。然而本研究培養周期較長，如何短時間內獲得高效耐低溫硝化菌種也將成為后續研究工作的重點方向。

參考文獻：

[1]

陳謙，張新雄，趙海，等.用于水產養殖的微生態制劑的研究和應用進展[J].應用與環境生物學報，2012（03）：524-530.

[2] 王瑋，譚瀟也，孫賢風，等.海洋硝化細菌富集培養過程研究[J].青島理工大學學報，2006（03）：67-70.

[3] Macfarlane G T， Herbert R A. Effect of oxygen tension， salinity， temperature and organic matter concentration on the growth and nitrifying activity of an estuarine strain of Nitrosomonas[J]. Fems Microbiology Letters， 1984， 23（23）：107-111.

[4] 陳中祥，曹廣斌，劉永，等. 低溫工廠化養殖水體氨氮處理微生物的初步研究[J]. 農業工程學報，2005，（08）：132-136.

[5] 王小菊，何春平，王震，等. 高效硝化細菌的篩選及特性研究[J]. 中國環境科學，2013，33（02）：286-292.

[6] 徐敏，牛越，昌晶，等.幾種理化因子對海洋硝化細菌去除氨氮效果的影響[J].微生物學雜志，2007（05）：65-69.

[7] Jiang X， Hao Y， Tian Q， et al. Screening and Application of Nitrifying Bacteria at Low Temperature[J]. Energy Procedia， 2011， 11：2681-2686.

[8] 李曉亮，張良，張培玉，等. 北極海洋沉積物低溫硝化細菌的篩選、多樣性與生長特性[J]. 應用與環境生物學報，2017，23（02）：294-300.

[9] 鄭平，徐向陽，馮孝善. 固定化硝化細菌耐低溫機理的研究[J]. 生物工程學報，1997，（03）：110-114.

[10] 國家環保局.水和廢水監測分析方法（4版）[M].北京：中國環境科學出版社， 2002：210-281.

[11] 顧錦釗.海洋低溫硝化細菌的富集培養過程及影響因素分析[D].青島理工大學，2014.

[12] 崔袁園.低溫硝化細菌的篩選及應用研究[D].哈爾濱工業大學，2006.

[13] 楊紅艷，龍秀娟，李清華.硝化細菌富集培養及處理富營養化水體應用研究[J].環境保護科學，2007，06：50-52.

[14] 樓洪森，楊云龍，方明亮.高效低溫硝化細菌培養方法的研究[J].工業水處理，2013（02）：42-44.endprint