飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚消化酶、免疫酶以及抗氧化酶的影響

付旭　崔前進　陳冰　楊博學　周婧　陳明康　韓雨哲

摘 要：為研究不同的飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚（Labidochromis caeruleus）的消化、免疫以及抗氧化酶的影響，選取狀態良好的淡黑鑷麗魚120尾隨機平均分成5個實驗梯度，用脂肪含量分別為7.44%、9.86%、1091%、15.25%和23.69%的飼料進行飼養試驗，各3組平行，按脂肪水平從低到高分別用Z1、Z2、Z3、Z4和Z5表示。試驗周期68 d。結果表明：隨著飼料中脂肪水平的增加，脂肪酶Z4顯著高于其他組（P<0.05）；胃蛋白酶活力和淀粉酶活力出現先增后降再增加的趨勢（P<0.05）；乳酸脫氫酶活力Z4顯著低于其他各組（P<0.05）；酸性磷酸酶活力Z2顯著高于其他各組（P<0.05）；堿性磷酸酶活力Z5顯著低于其他組（P<0.05）；過氧化氫酶活力Z3顯著高于其他各組（P<0.05）；丙二醛呈現先增后降再增加趨勢（P<0.05）；其他抗氧化能力指標無明顯差異（P>0.05）。試驗表明飼料中脂肪水平小于10.91%時隨著脂肪水平的升高對淡黑鑷麗魚的消化、免疫以及抗氧化有促進增強作用，但脂肪水平高于10.91%會對淡黑鑷麗魚的消化、免疫以及抗氧化能力起到抑制的作用，并且會影響魚體的健康狀況。

關鍵詞：淡黑鑷麗魚（Labidochromis caeruleus）；脂肪水平；消化酶；免疫酶；抗氧化酶

脂肪對于魚類生長發育非常重要，是魚類主要的能量來源，維持了魚類的生命活動[1]。魚類攝入脂肪的多少會影響體內多種酶的變化[2-3]。攝入過量的脂肪會積累在魚類的肝臟、腸壁以及腹腔等部位，導致魚類的代謝處于紊亂，影響魚類的抵抗能力以及活力[4]。攝入適當的脂肪還會有助于魚類對脂溶性物質的吸收[5]。在飼料中適當的脂肪含量會提高免疫力，但過量的脂肪也會產生負面的影響，比如會提升魚體的氧化反應，從而激發魚體的抗氧化機制，過高的脂肪也會增加魚類患上脂肪肝的幾率從而造成不同程度的肝損傷[6]。

淡黑鑷麗魚（Labidochromis caeruleus）屬鱸形目、隆頭魚亞目、慈鯛科、鑷麗魚屬，屬于馬拉維湖慈鯛巖棲類小型慈鯛，成年個體11±1.0 cm，呈橙黃色，背鰭近邊緣處有一條黑色條紋。可適應人工飼料。淡黑鑷麗魚的觀賞價值取決于體型是否標準和體色的鮮艷程度。

目前，對淡黑鑷麗魚的研究較少，主要集中于形態學等方面。本試驗將以淡黑鑷麗魚為研究對象，探討飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚消化、抗氧化以及免疫能力的影響，為開發淡黑鑷麗魚配合飼料提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚及飼養管理

本試驗的試驗用魚由當地養殖場自行繁育。體質量為（1.70±0.5）g。體長為（47.29±4.5）mm，取狀態良好的淡黑鑷麗魚120尾隨機平均分成5個試驗梯度各3組平行進行飼養試驗，每個平行組8尾魚，于控溫循環水系統（匯新鈦公司提供）中進行整個試驗過程，水體積30 L，循環水流量3 L/min。每組隨機布置于此系統中，每20日再次將每個組別隨機布置，并徹底清理魚缸。水溫25±1.0 ℃，每日投喂兩次分別于8：00和16：00，投喂至試驗魚不攝食為止。投喂后1 h進行吸底，同時清理糞便收集殘餌，每日18：00換水20%，每日控制均勻光照12 h。保持氧氣充足。試驗周期共68 d。

1.2 試驗飼料的制備

試驗飼料的原料于上海生物工程有限公司。飼料經過研磨、過篩、攪拌器充分混勻，用小型顆粒飼料制粒機壓制而成，60 ℃烘箱烘干至含水量18%，于-20 ℃冰箱真空密封避光保存。以大豆油（金龍魚品牌）為脂肪源，以魚粉、豆粕等為蛋白源，以淀粉等為糖源。添加的大豆油含量分別為0、30、60、92、170 g/kg，共五組。試驗飼料的基本成分以及配比質量見表1。

維生素E 4 000 IU、維生素K3 1 000 mg、維生素B1 2 000 mg、維生素B2 1 500 mg、維生素B6 1 000 mg、維生素B12 5 mg、煙酸1 000 mg、維生素C 5 000 mg、泛酸鈣5 000 mg、葉酸100 mg、肌醇10 000 mg、載體葡萄糖及水≤ 10%；礦物質混合物為0025 mg/g 預混料提供（mg/kg）： 氯化鈉107.79、七水硫酸鎂380.02、二水磷酸氫鈉241.91、磷酸二氫鉀665.20、二水磷酸鈣376.70、檸檬酸鐵82.38、乳酸鈣907.10、氫氧化鋁0.52、七水硫酸鋅9.90、硫酸銅0.28、七水硫酸錳2.22、碘酸鈣0.42、一水硫酸鈷2.77。

1.3 試驗取樣以及方法

試驗期間觀察魚的生長發育、攝食情況、死亡狀況。試驗結束后停食24 h，每個平行組隨機取6尾魚。紗布擦干體表水分，至于冰袋上用滅菌的解剖工具進行解剖，取其完整的肝臟和腸道。將每個平行組所取全部魚的肝臟做混樣用于測免疫酶、抗氧化酶，腸道做混樣用于測消化酶，置于對應組別的離心管內置于液氮中，后置于-80 ℃冰箱中短暫儲存，樣品置于滅菌的玻璃勻漿器中，置于碎冰中，加入預冷的生理鹽水充分勻漿制成20%的勻漿液，于4 ℃、2 500 r離心機離心10 min取上清。再稀釋成每種不同種酶測試的最適濃度。勻漿液在8 h內測試完畢。

1.4 指標測定與計算

采用試劑盒（南京建成生物有限公司）進行測定，針對胃蛋白酶（PRS）、脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）、總氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和總抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）和溶菌酶（LZM）、谷草轉氨酶（AST/GOT）和谷丙轉氨酶（ALT/GPT）進行測定并對結果進行分析。

1.5 數據統計方法

所得數據均采用平均值±標準誤表示，并采用spss 20.0分析軟件進行方差齊次檢驗和單因素方差分析（One-Way ANOVA）并進行Duncan氏多重比較，差異顯著水平為P<0.05。endprint

2 結果

2.1 飼料水平對淡黑鑷麗魚消化能力的影響

表2為淡黑鑷麗魚消化酶活力受飼料脂肪水平的影響。三種酶在不同脂肪濃度的作用下差異顯著。LPS的活性隨飼料中脂肪水平的增加呈先增后降趨勢。并于Z4達到最高值，Z4與Z5之間存在顯著差異（P<0.05），Z4與Z5分別與其他三組無顯著差異（P>0.05）。PRS隨脂肪水平的增高呈先增后降再增的趨勢，Z1、Z2與其余三組無顯著差異（P>0.05），Z3與Z4、Z5兩組有顯著差異（P<0.05）。AMS隨脂肪水平的增高呈先增后降的趨勢，于Z2達到最高值。其中Z4與Z1、Z2、Z3三組有顯著差異（P<0.05），Z2與Z3、Z4、Z5三組存在顯著差異（P<0.05），Z1與Z4、Z5兩組存在顯著差異（P<0.05）。

2.2 飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚免疫能力的影響

表3為淡黑鑷麗魚免疫酶活力受飼料脂肪水平的影響，其中各個組別中的LZM活性無顯著差異（P>0.05）。LDH的活性隨脂肪水平的增加先增后降，Z4顯著低于Z1、Z2、Z3三組（P<005）。ACP活力隨脂肪水平增加呈現出先增后降再趨于平緩的趨勢，Z2顯著高于Z1、Z3和Z5（P<0.05）。AKP活力Z1與其他組之間無顯著差異（P>0.05），Z5顯著低于除Z1外的其他組（P<0.05）。

2.3 脂肪水平對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響

表4為淡黑鑷麗魚抗氧化能力受飼料脂肪水平的影響，分別為總抗氧化能力、總氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和丙二醛，其中T-AOC、T-SOD和GSH-PX在不同脂肪水平下不表現出顯著差異（P>0.05），但總體趨勢為先增后降。CAT隨脂肪水平的不斷升高呈現出先升高后降低的趨勢，于Z3處出現最高值，并且顯著高于Z1、Z5兩組（P<0.05）。MDA則呈先升后降再顯著上升的趨勢，其中Z3顯著高于Z1（P<0.05），Z2、Z4分別與Z1、Z3兩組沒有顯著差異（P>0.05），而Z5則顯著高于其他組二至三倍（P<0.05）。

3 討論

3.1 飼料水平對淡黑鑷麗魚消化能力的影響

魚類消化酶的活性受很多因素影響，如魚類的品種、食性、環境以及外源攝入的營養飼料等[7]。消化酶可催化體內化學變化維持正常的生命活動，反映魚類對飼料的利用率及生長發育狀況，故消化酶的研究對幫助提高魚類的飼料轉化率以及促進魚類的生長發育起重要作用[8]。本試驗證實在飼料中適當的脂肪含量有助于提高淡黑鑷麗魚的胃蛋白酶和淀粉酶的活性，但過高的脂肪含量會抑制胃蛋白酶和淀粉酶的活性。魚類體內脂肪酶的活力受攝入的外源脂肪含量的多少影響。當在一定范圍內攝入脂肪越多脂肪酶的活力就越強，以便可以消化吸收更多的脂肪來提供所需的能量，但當脂肪攝入量過高時，由于脂肪積累過多會導致魚類患有營養性脂肪肝，并對魚體產生毒素，還會導致肌肉滲出性損失和肌肉營養不良，不僅影響魚的生長發育還會對魚體造成損傷，并且影響肝臟分泌各種活性酶[9]。本試驗中在飼料脂肪水平極低時，為了提供足夠的能量而需要消化碳水化合物和蛋白質，使得胃蛋白酶和淀粉酶活力增加；當飼料脂肪水平繼續增加時，由于提供了充足的能量使得不需要蛋白質和碳水化合物來提供能量，從而抑制蛋白酶和淀粉酶的活力[10]。但隨著脂肪含量的繼續升高，蛋白酶活力又開始增加，由于足夠脂肪的消化保證了必須脂肪酸的比例和種類的平衡以及充足的能量節約了蛋白質可以開始更好的參與魚體的生長發育從而蛋白酶的活力再次升高[11]。直至最高脂肪濃度組由于積累過多脂肪造成脂肪肝從而導致肝臟無法正常工作，而導致脂肪酶活力顯著降低使得脂肪無法被利用，為了維持魚體正常的代謝所需的能量，只能利用蛋白質和碳水化合物，使得蛋白酶和淀粉酶的活力從原來的基礎再次升高，但由于損傷的肝胰臟是魚類淀粉酶主要的分泌器官，腸道只能分泌少量淀粉酶，所以淀粉酶活力雖然升高也無法達到之前的峰值。

3.2 飼料脂肪水平對淡黑鑷麗魚免疫酶活力的影響

在謝麗玲[12]對龜殼攀鱸的研究中提出ACP和AKP的活性對魚類的免疫能力的強弱起到影響，并發現ACP和AKP主要由肝臟分泌到血液以及腸道中，ACP和AKP在腸道、肝臟、鰓以及腎臟含量較多，故提出魚類在ACP和AKP的作用下通過腸胃的代謝作用和鰓以及腎臟的解毒作用提高自身的免疫能力和對外界的抗逆性。在柳陽[13]對大西洋鮭的研究和王萍[14]對大鱗副泥鰍的研究中提出了AKP和ACP對消化吸收以及代謝調節起到了重要作用。本試驗AKP和ACP活性均為先增加后降低說明飼料脂肪水平小于15.25%時可以增加魚體的免疫能力以及對營養的消化吸收和新陳代謝功能，但若脂肪攝入過量會導致脂肪累積過多，造成肝臟以及其他器官受損，使得AKP和ACP無法正常產生分泌，從而降低對營養的吸收能力和免疫能力導致魚體的抗逆性減弱，在環境改變時出現死亡現象。LDH作為機體能量代謝中參與糖酵解的重要酶，存在于各組織器官中，主要分布于胞內。在生物體內，LDH主要催化乳酸脫氫成為丙酮酸，從而完成葡萄糖的無氧酵解過程，其基本功能為參與調節NAD和NADH的比率，從而對細胞內一系列生化反應起調控作用[15]。本試驗在飼料脂肪水平超過10.91%時LDH活力表現出顯著下降，說明此時脂肪攝入量過多，導致體內組織損傷，免疫力下降，抗逆性減弱。與李偉[16]對鯽魚的乳酸脫氫酶的研究中提出了魚體在受到細菌入侵、體內出現組織器官的損傷以及受重金屬影響時，肝臟等組織中的LDH活力會降低的結果相同。

3.3 脂肪水平對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響

本試驗中T-AOC、T-SOD、GSH-PX和CAT表現先增后降的趨勢，其主要原因為在一定脂肪含量范圍內，脂肪會對肝臟產生一定的刺激作用，使得肝臟產生更多的抗氧化酶從而增加魚體的抗氧化能力，減少脂質過氧化物對魚體的損傷，但是如果脂肪攝入過高，則脂肪過量沉積于魚的肝臟、消化道以及體腔等部位，發生氧化產生過多的活性氧自由基，破壞細胞膜機構和功能，對魚體肝臟的負荷增加，導致抗氧化能力的減弱[17]。MDA為過氧化反應的主要代謝產物，其含量作為過氧化物積累狀況和氧化應激程度的重要指標[18]。本試驗中MDA的先升高則是隨著攝入脂肪的不斷增加，脂質過氧化物不斷積累產生的結果。Z4組MDA略下降，但抗氧化酶活力沒有升高并出現下降，由于每組飼料中添加200 mg/kg的葉黃素5 g/kg，葉黃素為脂溶性，并且有很強的的抗氧化作用[19]。脂肪含量的增加促進了魚體對葉黃素的吸收和累積，使得自由基在魚體內未發生作用即被葉黃素清除，導致誘導性酶活活力降低，從而產生了飼料脂肪含量升高時MDA和抗氧化能力同時降低的情況。在脂肪攝入極高的Z5組，MDA顯著高于其他組，可能是由于脂肪過多的累積并遠超過體內累積的葉黃素可以控制的范圍，導致脂質過氧化物增加，造成肝臟負荷過重，導致肝功能損傷，使其無法正常分泌抗氧化酶，抗氧化酶活性降低，MDA激增，對魚體造成損傷乃至死亡[20]。endprint

4 結論

本試驗通過研究飼料中不同脂肪水平對淡黑鑷麗魚消化、免疫和抗氧化酶活力的影響得出結論為：淡黑鑷麗魚的飼料中脂肪水平小于9.56%時淡黑鑷麗魚的消化、免疫以及抗氧化能力隨脂肪水平的增加而增強；但飼料中脂肪水平超過9.56%時會對淡黑鑷麗魚體內的酶產生抑制的影響，嚴重時會對魚體造成損傷以致出現死亡情況。

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（收稿日期：2017-09-28）endprint