補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網膜PI3K/AKt通路Bcl-2及Bad的影響

張靜 李翔 汪偉 劉紅佶 李祥玉 李華宏 王泰 田夢瑤 楊鳳嬌

補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網膜PI3K/AKt通路Bcl-2及Bad的影響

張靜1,2李翔1汪偉3劉紅佶4李祥玉4李華宏4王泰4田夢瑤4楊鳳嬌4

目的觀察補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網膜Bcl-2及Bad的干預作用,探討其作用機理。方法選取30只SD大鼠,隨機分為對照組、給藥組及模型組,每組各10只。采用烙閉鞏膜上靜脈方法制作慢性高眼壓大鼠動物模型,每組連續灌胃8周后處死大鼠,觀察補腎活血法對EIOP大鼠眼壓、視網膜神經節細胞超微結構和視網膜Bcl-2、Bad 表達的影響。結果SD大鼠造模后即刻直至造模后8周與造模前眼壓相比均升高,有統計學差異(均P<0.01),造模后8周眼壓與造模后即刻相比,給藥組有降低趨勢,差異有統計學意義(P<0.01),模型組差異無統計學意義(P>0.05)；造模后8周,給藥組Bcl-2陽性表達最高,與對照組和模型組相比,差異有統計學意義(均P<0.01),模型組Bcl-2表達多于對照組,差異具有統計學意義(P<0.01),模型組Bad陽性表達最高,與給藥組和對照組相比,差異有統計學意義(均P<0.01),給藥組的Bad的表達多于對照組,差異具有統計學意義(均P<0.01)。給藥組RGCs超微結構較模型組明顯改善。結論補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)能保護SD大鼠慢性EIOP模型視功能,主要表現為:上調Bcl-2的表達、下調Bad的表達、降低眼壓及改善RGCs超微結構。

青光眼； 補腎活血中藥； 視網膜； 大鼠慢性高眼壓模型； 視神經保護； Bad； Bcl-2

青光眼(glaucoma)為繼白內障后的世界第二大不可逆的致盲性眼病。其以病理性的眼壓升高,進行性的視神經(optic nerve,ON)損害和特征性視野缺損為特點[1]。青光眼的發病機制較復雜,諸多危險因素都可以導致青光眼的產生,而最危險的因素就是病理性眼壓(intraocular pressure,IOP)升高[2],所以青光眼的主要治療措施就是將眼壓控制到靶眼壓。但隨著對青光眼認識的不斷深入,發現部分青光眼患者即使將眼壓控制在正常范圍內(10～21mmHg),也會發生進行性視野缺損和視力喪失,因此,青光眼視神經損傷的發病機制和視神經保護成為近年來研究的熱點。

本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法誘導產生高眼壓維持穩定、持續時間較長的慢性高眼壓動物模型[3],通過觀察補腎活血中藥(杞菊地黃丸和復方丹參片合用)對EIOP大鼠眼壓及B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-xl/bcl-2相關死亡啟動子(Bcl-associated death protein,Bad)的表達的影響,探討其保護視功能的作用機理,為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

標準1級SD大鼠30只,雌雄不拘,8～12周齡,體重約150～200g,等價飼料飼養,大鼠及飼料均由成都中醫藥大學實驗動物中心提供。飼養室溫20～25℃,空氣流通,相對濕度55%～75%,12小時光照維持,晝夜循環。自由攝食飲水。納入標準:①無外眼疾病；②雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常；③無歪頸。

1.2 藥品與試劑

復方丹參片(批號7122426)、杞菊地黃丸(批號7072153)均購于北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠。Bcl-2抗體(批號BA0412),Bad抗體(批號BA0530)均購于武漢博士德公司。

1.3 造模方法

SD大鼠購回后,適應性喂養3天,進行眼壓測量,正常眼壓區間估計,取平均眼壓在9～18mmHg者,隨機分為對照組、模型組、給藥組,模型組和給藥組進行單眼(右眼)造模,左眼不做處理。方法如下:大鼠稱重及固定后,用3%戊巴比妥鈉按1.5ml/kg體重行左下腹腔注射全身麻醉,同時術眼予0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液角結膜表面麻醉,于10點至2點鐘位距角鞏膜緣1～2mm剪開上方球結膜,分離筋膜,暴露角鞏膜緣后3～4mm近赤道部10點、12點和1點處3支上鞏膜靜脈并烙閉,整復球結膜,術眼涂金霉素眼膏,待大鼠蘇醒后放回籠內,0.25%氯霉素眼液滴眼,2次/日,連續6天。對照組右眼眼科手術止血器不開開關而不起烙閉作用,其余操作相同。因為灌胃等原因動物死亡4只。

1.4 分組與給藥方法

對照組、模型組大鼠給予每天3ml生理鹽水灌胃。將復方丹參片合杞菊地黃丸磨成粉狀,加入生理鹽水,每60片(18g)配置成100ml懸混液,濃度為0.18g/ml,給藥組混懸液灌胃1.8g/kg.d。實驗中,根據大鼠體重選取混懸液劑量。每只大鼠每天灌胃總量均3ml,所需混懸液劑量不足3ml的用生理鹽水補足。每天下午17:00灌胃1次,連續灌胃8周。每2周稱體重1次,依據體重調給藥量。

1.5 眼壓檢測

每日固定時間13:00～16:00測量眼壓,采用TONO-PEN筆試眼壓計,分別測量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后二周、造模后四周、造模后六周、造模后八周右眼的IOP。

1.6 免疫組化檢測

以頸椎脫臼法于造模8周后處死大鼠,立即取出眼球后,暴露視神經并保留足夠長的視神經,勿牽拉及損傷視神經,自球后1mm剪斷視神經,立即將其放入FAA液中固定48小時,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚4um,干燥后備用。免疫組織化學染色,詳細操作步驟如下:取已切好的石蠟切片,常規脫蠟至水。3%雙氧水室溫孵育10 min。蒸餾水沖洗,PBS浸泡 5min。甩去多余液體,切片上滴加10%山羊血清封閉液,室溫孵育10min,傾去血清,不洗,滴加稀釋的Bcl-2抗體、Bad抗體(均為1:100),放入冰箱內4℃下孵育過夜。次日取出,PBS沖洗3次,每次5min。滴加生物素標記二抗工作液,濕盒內37℃水浴箱孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min。滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),濕盒內37℃水浴箱孵育20min,PBS沖洗3次,每次5min。配置DAB顯色液,在顯微鏡下掌握顯色程度。蘇木素復染,自來水沖洗4min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察染色結果及拍片。 陰性對照:用PBS替代一抗,其余步驟同上。結果判定:隨機選取高倍鏡(×200)下6個視野進行觀察,Bcl-2、Bad陽性表達為棕黃色染色,共36個視野,用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量,求取每張切片6個視野的染色面積總和、積分光密度總和、平均黑度。

1.7 電鏡下RGCs超微結構觀察

各組隨機選定1只大鼠,處死后立即剝離眼球,3%戊二醛浸泡預固定,1%四氧化鋨再固定,丙酮逐級脫水,環氧樹脂Epon812包埋,半薄切片光學定位,超薄切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色,日立H-600IV型透射電鏡下觀察RGCs細胞形態、核、胞膜及細胞器等,在四川大學華西醫學院病理電鏡室完成。

1.8 統計方法

2 結果

2.1 慢性EIOP大鼠IOP

各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(見表1):

由表1可見:造模前對照組、給藥組及模型組IOP無明顯差異(為P>0.05)；造模后即刻,對照組上升不明顯,前后比較無統計學差異(P>0.05),給藥組、模型組上升明顯,差異有統計學意義(P<0.01),且與對照組差異明顯,具有統計學意義(P<0.01)；造模后八周,給藥組及模型組與造模前相比,差異有統計學意義(P<0.01)；給藥組造模后八周與造模后即刻相比,差異有統計學意義(P<0.01),模型組造模后八周與造模后即刻相比,無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組造模前、造模后即刻及造模后8周眼壓比較(單位:mmHg)

注：與造模前相比,△P<0.01；與對照組相比,▲P<0.01；與造模后即刻相比,☆P<0.01

2.2 補腎活血中藥對EIOP大鼠視網膜Bcl-2表達的影響(見表2、圖1-3)

由表2可見:檢測指標為總面積、積分光密度及平均黑度,如上表所示各項指標中以給藥組Bcl-2表達最多,給藥組的總面積、積分光密度與對照組與模型組相比,差異具有統計學意義(P<0.01)；模型組總面積、積分光密度多于對照組,差異具有統計學意義(P<0.01)；給藥組平均黑度與模型組相比,差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 Bcl-2在視網膜的表達

注：與對照組相比,▲P<0.01；與給藥組相比,★P<0.01

2.3 補腎活血中藥對EIOP大鼠視神經Bad表達的影響(見表3,圖4-6)

由表3可見:檢測指標為總面積、積分光密度及平均黑度,如上表所示各項指標中以模型組Bad表達最多,其總面積,積分光密度與對照組及給藥組相比,差異具有統計學意義(P<0.01)；給藥組的總面積、積分光密度多于對照組,差異具有統計學意義(P<0.01)；給藥組平均黑度與模型組相比,差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 杞菊地黃丸和復方丹參片對慢性EIOP大鼠RGCs超微結構的影響(圖7-9)

正常大鼠RGCs細胞核(N)呈圓形或卵圓形,核膜清晰,染色質均勻,細胞器豐富、線粒體(Mi)內質網(ER)形態正常(圖7)。造模后RGCs損傷明顯,表現為細胞核(N)呈圓形或卵圓形,輪廓極不規則,核膜清晰可見,核內染色質固縮,胞漿空泡化,核糖體明顯減少,殘存線粒體(Mi)高度膨脹、破裂,部分內質網(ER)擴張,呈空泡狀(圖8)。而給予補精益視片后大鼠RGCs損害較模型組輕,其部分細胞核(N)呈圓形或卵圓形,形態欠規則,核膜清晰可見,核內染色質呈聚集趨勢,線粒體(Mi)輕度腫脹、變形,部分內質網(ER)擴張,胞漿中細胞器種類、數量均有減少,分布較稀疏(圖9)。

圖1 對照組Bcl-2染色(200×) 圖2 模型組Bcl-2染色(200×) 圖3 給藥組Bcl-2染色(200×)

表3 Bad在視網膜的表達

注：與對照組相比,▲P<0.01,△P<0.05；與給藥組相比,★P<0.01

圖4 對照組Bad染色 圖5 模型組Bad染色 圖6 給藥組Bad染色

3 討論

青光眼是眼科常見的不可逆的致盲性眼病。青光眼的致病特點就是視野缺損和視神經損傷,發病隱匿,病因復雜,發病機制至今尚未完全明了,已往青光眼的治療主要是通過藥物或者手術方式將眼內壓控制在適當范圍,而部分青光眼患者即使經藥物或手術降低了眼壓,但RGCs的凋亡、視神經的損傷仍繼續發展,甚至導致視力喪失[4],因此在控制眼壓的同時,阻斷或降低RGCs的凋亡和增加RGCs的存活能力,已成為青光眼治療的研究方向[5-6]。國外已有實驗證明PI3K/Akt信號通路在RGCs的凋亡過程中起到抑制作用[7],但具體作用機理仍然不清楚近年來,PI3K/Akt信號通路(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,phosphatidylinositol 3-kinase pathway/protein kinase B,PI-3K/Akt)已成為凋亡基因調控熱點,PI3K/Akt信號通路促進神經元存活的作用已經得到許多研究的證實[ 8-10 ]。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶,普遍存在于機體內各類細胞中,Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K的活化物質,主要負責由PI3K始動的生物信息的傳導,生長因子等胞外因子通過與其相應的酪氨酸激酶受體結合后,引導PI3K移動至附近的漿膜,活化的PI3K催化產生PI一3,4-P2和PIP3,后者誘導無活性的Akt和磷脂酰肌醇依賴的激酶一l(PI)K一1)轉位至漿膜內表面,從而實現Akt的激活,發揮抗凋亡作用,激活后的Akt通過直接磷酸化凋亡機器組件或間接改變編碼凋亡機器組件的基因表達水平,來控制凋亡過程,如:通過磷酸化抑制前凋亡蛋白Bad的活性；Bad引起細胞凋亡,與Bcl-2和Bcl-xL在線粒體外膜處結合形成異源二聚體有關。D’Agata等[11]對正常的剛剛出生、生后15d及成年大鼠眼組織研究結果證明,大鼠脈絡膜叢上皮細胞、神經節細胞中均有Bad表達。吳紅色等[12]研究發現,大鼠視神經鉗夾傷后3d,Bad開始高水平表達,5d達到高峰,7d開始下降,Bad高水平表達促進了RGCs繼發性的死亡,直到傷后14d Bad表達水平明顯下降,使RGCs數目維持于穩定狀態。Burne等[13]的研究顯示切斷軸索后,bcl-2轉基因的表達保護了視網膜神經節細胞免于凋亡。因此說Bad作為細胞凋亡基因的代表,Bcl-2作為細胞生存基因的代表,兩者之間表達水平的平衡結果,決定了細胞是生存還是凋亡。楊柳等[14]發現高表達的Bcl-2能夠促進小鼠視神經損傷后的再生,并且再生的神經軸突在4d后長入腦內的靶組織。

圖7 透射電鏡觀察 對照組RGCs(×12000)。細胞核(N)呈圓形或卵圓形,核膜清晰,染色質均勻,細胞器豐富、線粒體(Mi)、內質網(ER)形態正常 圖8 透射電鏡觀察 模型組RGCs(×20000)。細胞核(N)呈圓形或卵圓形,輪廓極不規則,核膜清晰可見,核內染色質固縮,胞漿空泡化,核糖體明顯減少,殘存線粒體(Mi)高度膨脹、破裂,部分內質網(ER)擴張,呈空泡狀 圖9 透射電鏡觀察 給藥組RGCs(×20000)。部分細胞核(N)呈圓形或卵圓形,形態欠規則,核膜清晰可見,核內染色質呈聚集趨勢,線粒體(Mi)輕度腫脹、變形,部分內質網(ER)擴張,胞漿中細胞器種類、數量均有減少,分布較稀疏

青光眼是一類以特異性視神經損害和視野缺損為共同特征的眼病,類似中醫“五風內障”及“青盲”,屬瞳神疾病,五風內障(青光眼)基本病機為氣血失和、玄府閉阻的中醫理論以及病久則肝腎兩虧,神光衰微甚至泯滅、不睹三光而成“青盲”(青光眼視功能損害而視神經萎縮)的病理過程,提出肝腎虛損、脈絡瘀滯是青光眼視神經病理改變的主要病機,滋養肝腎、活血通絡是防治青光眼視神經損害的基本方法,故本實驗選取杞菊地黃丸和復方丹參片合用共奏滋補肝腎、活血化瘀之功,通過動物實驗,來進一步闡述補腎活血中藥在青光眼治療方面的作用機制,拓展臨床思路。我們的前期研顯示[15-17]杞菊地黃丸合復方丹參片可以抑制EIOP大鼠視網膜神經纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和視網膜神經節細胞層(retinal ganglion cells layer,RGCL)變薄,改善RGCs超微結構,防止RGCs和RNFL損害,有助于多焦視網膜電圖(multifocal electroretinogram,mfERG)總波及1、2、3、4環P1波反應密度、總波P1波峰潛時、2環及3環N1波反應密度,3環、4環N1波峰潛時的恢復,上調RGCs抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促進基因Bax[18],并可修復初級視皮質(primary visual cortex,PVC)及外側膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)的損傷,提高EIOP大鼠PVC及LGN的BDNF表達[19-22]。臨床觀察[23]也發現杞菊地黃丸與復方丹參片治療眼壓控制后青光眼視功能的臨床療效良好。

本研究通過觀察補腎活血中藥對大鼠慢性高眼壓模型視網膜PI3K/AKt通路凋亡相關因子Bcl-2及Bad的干預作用及對EIOP大鼠視網膜RGCs超微結構的影響,進一步探討補腎活血中藥對青光眼視功能保護的作用機理。結果發現補腎活血中藥(杞菊地黃丸合復方丹參片)用于SD大鼠慢性EIOP模型,能降低眼壓,上調Bcl-2的表達及下調Bad的表達、改善RGCs超微結構來抑制細胞凋亡,最終發揮對慢性高眼壓大鼠視網膜的保護作用。杞菊地黃丸為經典古方,為滋補肝腎明目的代表方劑,復方丹參片活血化瘀通絡,兩者均為《中國藥典》載入藥品、非處方用藥,可作為臨床青光眼視神經保護藥物推廣應用。

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EffectsoftraditionalChinesemedicineofBuShenHuoXueonritinalBcl-2andBadofPI3K/AKtpathwayinratmodelofelevatedintraocularpressure

ZHANGJing1,2,LIXiang1,WANGWei3,LIUHong-ji4,LiXiang-yu4,LIHua-hong4,WANGTai4,TIANMeng-yao4,YANGFeng-jiao4

(1.DepartmentofOphthalmology,TheTeachingHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072;2.YanglingDemonstrationZoneHospital,Xianyang,Shanxi,712100 ;3.TraditionalChineseMedicineHospitalAffiliatedtoSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan,646000;4.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo observe the effect of traditional Chinese medicine (TCM) of BuShenHuoXue on retinal BCL-2 and Bad in SD rat model of chronic elevated intraocular pressure,and explore it’s initial mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into 3 groups:control group,model group and treatment group,10 rats in each group.The model of chronic EIOP was established by unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels.After given TCM of BuShenHuoXue or normal saline for 8 weeks,the rats were put to death.The effect of intraocular pressure(IOP),expression of retinal BCL-2 and Bad,ultrastructure of RGCs were observed.ResultsCompared with pre-operation,IOP in treatment group and model group at model building until postoperation 8 weeks were increased(allP<0.01).There was obviously reduce in treatment group between postoperation 8 weeks and models building (P<0.01),While model group was not statistically significant(P>0.05).8 weeks after-modeling,the Immunohistochemical detection of retina showed that the treatment group’s expression on Bcl-2 was the highest,compared with the control group and modle group,there were statistically differences(allP<0.01),model group’s expression on Bad was the highest,compared with the treatment group and control group,there were statistically differences(allP<0.01).The ultrastructure of RGCs in the treatment group was significantly improved compared with model group.ConclusionTCM of BuShenHuoXue (QijuDihuang pills and DaShen tablets)can protect the visual function on the rat model of chronic EIOP.It mainly manifested as follows:up-regulated the expression of retinal Bcl-2,dwonregulated the expression of retinal Bad,reduced IOP slightly and improved the ultrastructure of RGCs.

Glaucoma; TCM of BuShenHuoXue(QijuDihuang pills and DaShen tablets); Retina; The rat model of chronic elevated intraocular pressure; Visual function protection; Bcl-2; Bad

國家自然科學基金(81373695/H2713);成都中醫大學科技發展基金(030018024)

1.610072,四川成都,成都中醫藥大學附屬醫院；2.712100,陜西咸陽,楊凌示范區醫院；3.646000,四川瀘州,西南醫科大學附屬中醫醫院；4.610075,四川成都,成都中醫藥大學

李翔,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.006

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