大腸桿菌高密度發酵產木聚糖酶發酵條件優化

劉國鋒

（1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500）

大腸桿菌高密度發酵產木聚糖酶發酵條件優化

劉國鋒1，2

（1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500）

該試驗對木聚糖酶工業大生產條件下的接種量、pH值、培養溫度、溶氧、誘導時間、比生長速率進行了單因素優化試驗。在此單因素試驗基礎上，選取對酶活影響較大的比生長速率、溶氧和pH 3個因素進行了正交試驗優化。結果表明，優化后的發酵條件為接種量10%，發酵過程中溶氧值30%，生長期控制pH值為7.0，生長期培養溫度37℃，生長期比生長速率為0.12 h-1，誘導期pH值為6.8，誘導期培養溫度為35℃，誘導期比生長速率為0.14 h-1，在對數生長中期（OD600nm=30）時流加誘導培養基。優化后，放罐木聚糖酶活力最高可達149 000 IU/mL。該研究提升了大生產條件下的木聚糖酶活力，為木聚糖酶的工業化生產提供了指導。

大腸桿菌；木聚糖酶；發酵條件；優化

木聚糖水解酶是一種復雜的復合酶系統，廣泛分布于自然界的細菌和真菌中。報道的木聚糖酶的來源主要有細菌、真菌、放線菌、酵母、藻類以及動物瘤胃中的細菌[1]。國內研究產木聚糖酶最多的菌株是木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）等。 目前，已從20余種細菌、16種真菌、3種酵母以及8種放線菌中分離出相應的木聚糖酶[2]。木聚糖的酶法降解在食品工業、飼料工業、制藥工業等眾多行業中有著十分誘人的應用前景，尤其是近兩年在造紙工業中成功運用木聚糖酶進行預漂白處理，使得木聚糖酶的廠家成為了一個熱點，并取得了一系列重要的進展。

高密度發酵技術能提高菌體的發酵密度，最終提高產物的比生產率（單位體積單位時間內產物的產量），不僅可以增加放罐體積、強化下游分離提取，還可以縮短生產周期、減少設備投資從而降低生產成本，能極大地提高產品在市場上的競爭力。這一目的的實現，除了重組菌本身的表達性質外，還必須給㈣重組菌生長和產物表達的最適環境條件，包括適宜的培養基組成、合適的培養溫度、pH、比生長速率、適宜的溶解氧以及營養物的合理流加等。

目前，國內外的研究主要側重于木聚糖酶酶學性質、木聚糖酶生產菌株構建、木聚糖酶應用等方面的研究。KHANDEPARKER R等[3]通過分子改造構建雙功能木聚糖酶，發現同時具備木聚糖酶和纖維素酶活性的木聚糖酶應用前景巨大。SHEI J C等[4]從黑曲霉中分離出了一種內切木聚糖酶，該酶對纖維素、羧甲基纖維素、幾丁質等都有水解作用。木聚糖酶為誘導酶，除了受基因工程菌的構建特性因素影響外，影響木聚糖酶發酵的因素通常有碳源、氮源、pH、溫度和通氣量等[5-6]，但是關于木聚糖酶規模化應用方面的研究較少。此外木聚糖酶產生菌分泌的代謝酶，包括蛋白酶和糖苷轉移酶類，都會影響到木聚糖酶的產率，在確立木聚糖酶培養時間時必須要考慮到存在于培養基中的這些酶類的影響[7]。

為了解決木聚糖酶工業化生產中的實際問題，本研究采用碳氮源優化后的培養基，著重研究大生產中接種量、pH值、培養溫度、溶氧、誘導時間、比生長速率等培養條件對菌體生長及木聚糖酶酶活的影響，以期為木聚糖酶的工業化生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

生產菌株[8]：重組大腸桿菌（Escherichia coli）：尤特爾生化有限公司。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖：河北健民淀粉糖業有限公司；乳糖、甘油：武漢萊恩化工有限責任公司；硫酸銨：中國石油化工股份有限公司巴陵分公司；磷酸二氫鉀：武漢無機鹽化工有限公司；氯化鈉：湖南省湘衡鹽化有限責任公司；蛋白胨：山東梁山蛋白胨生物制品有限公司；無水磷酸氫二鈉：云南昆陽磷肥廠有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

種子培養基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸膏10.0 g/L、NaCl 5.0g/L；聚丙二醇（polypropyleneglycol，PPG）-20000.01mL，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖18.0 g/L、酵母浸膏3.0 g/L、檸檬酸3.0 g/L、硫酸銨3.5 g/L、PPG-2000 0.05 mL、MgSO4·7H2O 1 g/L、磷酸二氫鉀12.0 g/L、氯化鈣0.2 g/L和微量鹽貯液，pH值自然，121℃滅菌30 min。微量鹽貯液組成如下：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）8.4 mg/L，檸檬酸鐵100.0 mg/L，Zn（CH3COO）2·2H2O 13.0 mg/L，CoCl2·6H2O 2.5 mg/L，MnCl2·4H2O 15.0 mg/L，CuCl2·2H2O 1.5 mg/L，硼酸 3.0 mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.5 mg/L。培養基滅菌條件為：115℃滅菌20 min。

補料培養基：甘油500.0 g/L、MgSO4·7H2O 10.0 g/L、氯化鈣1.0 g/L，pH值自然，121℃滅菌30 min。

誘導培養基：甘油100.0g/L、MgSO4·7H2O2.0g/L、乳糖240.0 g/L、氯化鈣0.2g/L，pH值自然，121℃滅菌30min。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備；2 m3304不銹鋼種子罐、20 m3304不銹鋼發酵罐：岳陽龍輝檢修安裝有限公司；755S紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；Phs-3CP pH儀：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養條件

小罐種子培養采用2 m3種子罐，初始培養基體積1 m3，接種搖瓶種子3 000 mL，接種時加入維生素B1和卡那霉素，培養溫度37℃，通氣量1.2 m3/min，罐壓0.03 MPa，待空氣量加足后開啟攪拌，攪拌轉速200 r/min培養8 h，將其作為種子液。

發酵采用20 m3發酵罐，初始培養基體積10 m3，調整好培養溫度后接種小罐種子，接種前通過小罐接種口加入維生素B1和卡那霉素，通入空氣，待空氣量加足后開啟攪拌，用20%氨水調節pH值。待還原糖降至0.3 g/100 mL，指數流加生長培養基。至一定OD600nm值時，指數流加誘導培養基。至OD600nm值比最高時下降5～10個單位后停止發酵。

1.3.2 分析檢測

細胞密度的測定：取適量菌液，用分光光度計測定適當稀釋至吸光度值0.2～0.4后，其波長在600 nm處的吸光度值（OD600nm）。

木聚糖酶酶活的定義：在50℃，pH 6.50中性條件下，每分鐘從質量濃度為5 mg/mL的燕麥木聚糖溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個活力單位（IU/mL）。采用高效液相色譜法測定木糖含量，色譜條件如下：Aglient HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）；檢測器：示差檢測器（refractiveindexdetector，RID）溫度控制在55℃；柱溫65℃；流動相5mmol/L硫酸溶液；流速：0.6mL/min；進樣量：10μL。

1.3.3 發酵條件優化

接種量的確定：分別以3%、6%、8%、10%、12%的接種量接種于發酵罐培養基中，37℃培養，通入空氣培養8 h，定時取樣測OD600nm值和酶活。

溶氧量的確定：發酵過程中，分別將溶氧控制在10%、15%、20%、25%、30%，37℃培養，其他條件不變，發酵培養52 h后測OD600nm值和酶活。

誘導時機的確定：分別在對數生長的前期、中期及后期指數流加誘導培養基（具體優化方法見結果討論），37℃，其他條件不變，發酵培養52 h測OD600nm值和酶活。

pH值的確定：在OD600nm值至30時指數流加誘導培養基，誘導期分別將pH值控制在6.4、6.6、6.8、7.0，37 ℃培養，其他條件不變，發酵培養52 h后測OD600nm值和酶活。

比生長速率的確定：根據前期試驗摸索，生長期細胞比生長速率為0.12 h-1有利于菌體生長和產物積累，而誘導期的比生長速率需要進行優化。誘導時設定不同的細胞比生長速率補料進行優化，37℃培養，其他條件不變，發酵培養52h后測OD600nm值和酶活。

因發酵設備的限制，無法連續改變補料體積，故采用每1 h改變補料體積的階梯式的補料方式。設定比生長速率（μset），根據下列公式計算流加率：

式中：F為流加率，L/h；X（t0）為補料開始前細胞干質量，g/L；V（t0）為補料開始前發酵液體積，L；SF為補料培養基葡萄糖的質量濃度，g/L；m為保持系數0.025，（g·g/h）[9]；Yx/s為產出系數，即每克葡萄糖產生細胞干質量，g/g。

每克葡萄糖產生細胞干質量計算公式如下：

式中：ODb為補料開始前的發酵液的OD600nm值；OD0為發酵開始時的OD600nm值；0.54為1 OD600nm值相當于1 L發酵液中含有的細胞干質量為0.573 g；Vm為發酵合成培養基的初始體積，L；Vi為發酵種子液的體積，L；Vs為取樣體積，L；S為合成培養基中含有的葡萄糖的總量，g。

溫度優化：在OD600nm值至30時指數流加誘導培養基，誘導期分別將培養溫度控制在34℃、35℃、36℃、37℃、38℃，其他條件不變發酵培養52 h后測OD600nm和酶活。

1.3.4 數據分析

所有實驗均為3個平行實驗，所得數據為3個平行實驗平均值。

2 結果與分析

2.1 接種量對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響

接種量的大小決定菌種在發酵罐中的生長速度。采用低接種量，會使菌種生長緩慢，發酵周期延長。接種量大，有利于對基質的利用，縮短生長延滯期，并使生長菌迅速占領整個培養環境，但過度接種量會使菌體生長過快，影響后期的生長，在一定范圍內增加接種量有利于菌體生長。不同接種量對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響結果見圖1。

圖1 不同的接種量對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響Fig.1 Effects of different inoculum on xylanase production by E.colifermentation

由圖1可知，除3%和6%的接種量外，其余接種量菌體濃度差距不大。接種量為10%時木聚糖酶酶活最高，3%接種量酶活最低。考慮到在大規模發酵過程中，接種量過小菌體增值緩慢和接種量過大對菌體生長和酶轉化得率會產生一定抑制作用[10]，并出于種子罐和發酵罐消毒滅菌時操作方便及生產成本考慮，確定10%為最佳接種量。

2.2 溶氧對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響

在微生物培養時，必須不斷地向培養液提供足夠的氧，以滿足微生物生長代謝的需要。由于微生物的新陳代謝與氧氣呼吸有關，調節通氣和攪拌可影響發酵周期時間的長短和代謝產物生成的高低。

大腸桿菌菌體在高密度培養時，耗氧劇增，發酵罐內溶氧水平逐漸下降。當培養液內的溶解度降低到臨界濃度以下，此時再加大補料速度，將會導致菌體呼吸停止或厭氧發酵，并可能造成菌體自溶。在其他工藝參數不變的基礎上，考察不同水平的溶氧對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響，在發酵培養52 h后測酶活，結果見圖2。

圖2 不同的溶氧量對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響Fig.2 Effects of different dissolved oxygen contents on xylanase production byE.colifermentation

由圖2可知，生產中溶氧＜20%時，菌體生長明顯受到抑制，酶活水平降低，溶氧＞25%酶活增長不顯著。在高密度發酵末期，發酵罐的溶氧成為限制菌體生長的制約因素[11-12]。受設備⒉件因素制約，發酵后期溶氧最大只能達到31%，未能繼續通過提高溶氧值來研究對發酵的影響。從生產成本上考慮，過度增加溶氧會增大生長能耗，提高了生產成本。因此，選用25%溶氧對發酵生產有利。

2.3 誘導時機對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響

對于許多帶有誘導型啟動子的重組微生物，只有將生長期和產物形成期分開才能獲得最大生產率。在流加培養中，這兩段時期的分離可以通過延遲誘導直至細胞生長已達到高密度來實現。提早誘導造成菌體密度和中性木聚糖酶酶活降低，同時增加了染菌的機會，而誘導較晚，雖可能獲得高菌體密度，但細胞表達時間減少，導致木聚糖酶酶活降低。20m3發酵罐水平大腸桿菌生長曲線見圖3，不同誘導時機對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響見圖4。

圖3 20 m3發酵罐水平大腸桿菌生長曲線Fig.3 Growth curve ofE.coliin the 20 m3fermenter

由圖3可知，對數生長前期的OD600nm值為21，對數生長中期OD600nm值為30，對數生長后期OD600nm值為40，分別在上述3個生長期流加誘導培養基。

圖4 不同的誘導時間對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響Fig.4 Effects of different induction period on xylanase production byE.colifermentation

由圖4可知，生長期時間越長，誘導期時間越短，雖然菌體密度越大，但酶活水平相對不高。生長期時間越短，誘導期時間越長，菌體密度相對較小，酶活水平也不高。因此，在對數生長中期（發酵至第13～15小時，OD600nm值=30）時流加誘導培養基較好。

2.4 pH值對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響

大腸桿菌生長的最適pH值為7.0～7.2，降低pH對控制較低的比生長速率有利，但會延長發酵周期。在發酵罐生長期pH控制在7.0，誘導期采用不同pH值進行培養，不同pH值對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響，結果見圖5。

圖5 不同的誘導期pH對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響Fig.5 Effects of different pH value during induction period on xylanase production byE.colifermentation

由圖5可知，同周期條件下誘導期pH值越高，菌體濃度越高，但pH＞6.8后，盡管菌體濃度提高，酶活反而下降。pH值為7.0時，菌體生長速度快，但過快的生長導致質粒丟失，從而影響酶活水平。pH值6.8時，有利于產物表達。采用pH梯度法，即生長期控制pH為7.0，誘導期pH為6.8，能較好地解決這一問題。

2.5 誘導期比生長速率對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響

比生長速率是每小時單位體積的菌體所增加的菌體量，其對細胞生長和產物形成均有重要作用。在發酵的補料分批發酵中使用指數流加補料培養策略被認為是避免產生有毒代謝物和增加細胞密度的最有效的方法。在同周期條件下，每隔1 h取樣測定OD600nm值，計算菌體的比生長速率，考察在誘導期通過調整補料速度來控制不同比生長速率，進而影響發酵的酶活，結果見圖6。

圖6 不同的比生長速率對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響Fig.6 Effects of different specific growth rate on xylanase production byE.colifermentation

由圖6可知，比生長速率在0.14 h-1以下時，酶活隨比生長速率加快而增加，比生長速率在0.20 h-1以上時，酶活隨比生長速率加快導致質粒被丟失而下降，比生長速率在0.30h-1以上時，菌體生長被抑制。本試驗采取指數補料流加策略進行高密度發酵，設定補料的比生長速率為0.14 h-1，低于產生乙酸的比生長速率，細胞密度呈指數的增長，能有效避免代謝副產物乙酸的產生。因此，發酵生產中將比生長速率控制在0.14～0.20h-1較為合適。有時細胞在低比生長速率下最終獲得重組蛋白的量反而要比高比生長速率的細胞高一些[13]。本研究的試驗結果也證明了上述觀點。

2.6 培養溫度對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響

大腸桿菌發酵最適生長溫度是37℃，但最適木聚糖酶生產溫度需要進一步優化。在重組大腸桿菌的發酵過程中不同發酵階段采用不同溫度，在前期可將溫度調至最適菌體生長的溫度，到誘導階段將溫度調至最適木聚糖酶生產的溫度。本研究在生長期采用37℃培養，誘導期采用不同培養溫度，考察不同的培養溫度對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響，結果見圖7。

由圖7可知，誘導期溫度升高增加菌體密度，但超過35℃菌體密度增加不明顯，且酶活逐漸下降。一些大腸桿菌重組蛋白在溫和啟動子下的表達量高于強啟動子[14]，低溫誘導的表達量高于高溫誘導[15]就證實了這一觀點。培養溫度升高加快了菌體的生長速率，有可能導致質粒被丟失。大腸桿菌生長速率降低，有利于工藝控制，同時乙酸及其它抑制性副產物的形成也隨之減少。生長期采用37℃培養，誘導期采用35℃培養，有利于中性木聚糖酶的表達。

圖7 不同的誘導期培養溫度對大腸桿菌發酵產木聚糖酶的影響Fig.7 Effects of different culture temperature during induction period on xylanase production byE.colifermentation

2.7 發酵條件優化正交試驗

在單因素的基礎上，以木聚糖酶活為考察指標，選擇對酶活影響較大的比生長速率、溶氧和pH，進行3因素3水平的正交試驗，其結果與分析見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表1可知，各因素對木聚糖酶活力的影響大小為溶氧＞比生長速率＞pH，最優的發酵條件組成為A2B2C3。優化后的發酵條件為接種量為10%，發酵過程中溶氧值為30%，生長期控制pH值為7.0、生長期培養溫度為37℃、生長期比生長速率為0.12 h-1，誘導期pH值為6.8、誘導期培養溫度為35℃、誘導期比生長速率為0.14 h-1，在對數生長中期（OD600nm值=30）時流加誘導培養基。在此發酵條件進行優化后，酶活力可達149 000 IU/mL。一般認為菌體密度高于50 g/L即為高密度發酵，根據材料方法1.3.3的計算方法，獲得的菌體濃度可達65.90 g/L，達到高密度發酵水平。

3 結論

本試驗研究了大生產中接種量、pH值、培養溫度、溶氧、誘導時間、比生長速率等培養條件對菌體生長及木聚糖酶酶活的影響，并在此基礎上選擇比生長速率、溶氧和pH，進行了正交試驗。優化后的發酵條件如下：接種量為10%，發酵過程中溶氧值為30%，生長期控制pH值為7.0、生長期培養溫度為37℃、生長期比生長速率為0.12 h-1，誘導期pH為6.8、誘導期培養溫度為35℃、誘導期比生長速率為0.14 h-1，在對數生長中期（OD600nm值=30）時流加誘導培養基。優化后，放罐酶活力可達149 000 IU/mL。本研究為木聚糖酶的工業化生產奠定了堅實基礎。

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Optimization of high density fermentation conditions ofEscherichia colifor xylanase production

LIU Guofeng1,2
（1.Hunan Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Yueyang 414000,China;2.Shandong Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Zoucheng 273500,China）

The fermentation conditions,such as,inoculum,pH value,culture temperature,dissolved oxygen,induction time and specific growth rate in the production of xylanase industry were optimized by single factor experiments.On the basis of the single factor experiments,the specific growth rate,dissolved oxygen and pH were optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum fermentation conditions were inoculum 10%,dissolved oxygen 30%during fermentation,growing period pH value 7.0,growing period culture temperature 37℃,growing period specific growth rate 0.12 h-1,induction period pH value 6.8,induction period culture temperature 35℃and induction period specific growth rate 0.14 h-1.The induction medium was added in the middle of logarithmic phase （OD600nm=30）.After optimization,the highest xylanase activity could be up to 149 000 IU/ml.The study improved the xylanase activity under the conditions of mass production,which provided guidance for the industrial production of xylanase.

Escherichia coli;xylanase;fermentation conditions;optimization

TS201.3

0254-5071（2017）12-0063-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.013

2017-08-20

科技型中小企業技術創新項目（14C26213701984）

劉國峰（1980-），男，工程師，碩士，研究方向為酶工程。