含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵的影響

張宇錄，高鵬飛，于紀洋，丁玉萍*，劉 悅，夏志瑤

（1.佳木斯大學 生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵的影響

張宇錄1，高鵬飛1，于紀洋2，丁玉萍1*，劉 悅1，夏志瑤1

（1.佳木斯大學 生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以東北高寒地區產的山葡萄釀造的山葡萄酒為研究對象，探究山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵過程中含糖量對其pH值、總酸、蘋果酸-乳酸轉化程度、總糖的影響。山葡萄酒中的葡萄糖含量對其pH值的升高、總酸的降低及蘋果酸乳酸轉化程度均有影響。在4個梯度葡萄糖含量的山葡萄酒中，含糖量為10.67 g/L的山葡萄酒其pH升高值（0.18）、總酸度降低值（6.05 g/L）最大，蘋果酸乳酸轉化程度最高。

山葡萄酒；含糖量；蘋果酸-乳酸發酵

山葡萄是我國東北地區的主要釀酒葡萄品種，其含水量較低，干物質較多，但總酸含量較高[1-2]。山葡萄經發酵后釀出的山葡萄酒干浸出物高，口感醇厚，果香濃郁，色澤艷麗[3-5]；但其較高的總酸使山葡萄酒品嘗起來比較酸澀，適口性差[8-10]。本試驗含糖量設置的四個梯度分別代表干型、半干型、半甜型和甜型四種類型的山葡萄酒，探究含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵的影響。

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fementation，MLF）是葡萄經主發酵后，在后發酵過程中乳酸菌將蘋果酸轉化為乳酸和二氧化碳的過程[12]，屬于生物降酸。采取MLF的目的是降酸，改變葡萄酒香氣構成，提高產品穩定性及品質[13]。MLF不同于化學降酸和物理降酸。MLF分解的是葡萄酒中口感酸澀生⒉的蘋果酸，生成口味柔和的乳酸[14-16]。二元酸在轉化為一元酸的過程中，葡萄酒的酸度降低，口感變得柔和，乳香特征凸顯，顏色也發生改變[17]。MLF是高檔干紅葡萄酒必要的二次發酵工藝，一部分厚重型干白葡萄酒也采取該工藝[18-19]。

目前，關于含糖量與蘋果酸-乳酸發酵關系以及影響方面研究國內外報導尚少。本試驗通過研究含糖量對蘋果酸-乳酸發酵的影響，探究山葡萄酒發酵過程中最適的含糖量，從而使山葡萄酒口感圓潤、醇厚、酸澀感降低。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 山葡萄酒及菌株

佳木斯大學生命科學學院發酵工程實驗室保存的自釀山葡萄酒（pH 2.92±0.05，總酸度13.16g/L，酒精度12.5%vol，還原糖含量為4.67 g/L）。

乳酸菌Lactoenos450PreAC：購買于煙臺帝伯仕自釀機有限公司；葡萄糖（食品級）：廣州恩軒朗邦化工產品有限公司；葡萄酒專用活性干酵母：宜昌安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、蘋果酸鈉、檸檬酸三銨、碳酸鉀（均為食品級）、吐溫-80、蘋果酸、乳酸、正丁醇、冰乙酸、溴酚藍（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司

1.1.3 活化培養基

山葡萄汁200 mL、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖30 g、硫酸鎂0.56 g、蘋果酸鈉20 g、吐溫-80 1 g、胰蛋白胨15 g、檸檬酸三銨2 g，依次溶解，混合均勻，蒸餾水定容至1 L，調pH至4.6，121℃滅菌20 min。

1.1.4 紙層析液

展開劑：正丁醇∶冰乙酸∶蒸餾水為2∶1∶1。 顯色劑：1 L展開劑中加入0.6 g溴酚藍。將試劑混合均勻后，倒入試劑瓶中，密封儲存備用[14]。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75SII高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊事業有限公司醫療設備廠；150G恒溫振蕩培養箱：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TDZ4-WS低速臺式離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；CJ-78-1A磁力加熱攪拌器：上海躍進醫療器械廠；PHS-3C型精密酸度計：杭州雷磁分析儀器公司。1.3方法

1.3.1 樣品處理方法

1.3.2 菌種活化與接種

（1）菌種活化：將保存的菌種按10%的接種量接種到活化培養基中，于25℃恒溫箱培養96 h，取出備用。

（2）接種：按10%的接種量接種活化后的菌懸液于離心管中，4000r/min離心10min，棄去上清液，然后加無菌水洗滌，于4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，重復洗滌3次。用待接種酒液將酒類酒球菌沉淀稀釋后接入發酵瓶中。

1.3.3 試驗設計

表1 試驗山葡萄酒酒樣參數Table 1 Parameters of tested wild grape wine samples

取5個500 mL試劑瓶，分別編號為0、1、2、3和4號，每瓶裝干紅山葡萄酒400 mL，按照表1分別加入葡萄糖，原酒不接種，其余四組按“1.3.2（2）”接種方法接入乳酸菌，混合均勻，然后分裝于10 mL帶蓋的試管中，置于室溫（20～22℃）條件下避光培養。每隔3 d對其pH值和總酸度進行測量，每隔5 d對其含糖量和蘋果酸乳酸轉化程度進行測量。每個指標取三支試管的酒樣進行測量，結果取平均值。

1.3.4 檢測方法

pH值的檢測：采用精密酸度計測定；總酸度的檢測：采用酸堿滴定的方法測定[4]；蘋果酸-乳酸轉化量的檢測：采用紙層析法測定[5]；總糖的檢測：采用3,5-二硝基水楊酸法測定[7]。

2 結果與分析

2.1 含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵過程中pH值的影響

測不同含糖量山葡萄酒在蘋果酸-乳酸發酵過程中pH值，結果如圖1所示。

圖1 含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵過程中pH值的影響Fig.1 Effect of sugar content on wild grape wine pH in the process of malolactic fermentation

由圖1可知，4組山葡萄酒在MLF過程中pH值的總體變化規律均是先升高后降低，4組葡萄酒從第1天到第3天pH值升高的速度較快，從第3天開始緩慢升高，到第24天達到最大值，各組pH升高值為2組（0.18）＞1組（0.15）＞3組（0.14）＞4組（0.11）＞原酒（0.07），此后，隨著發酵的進行，4組葡萄酒的pH值均開始下降。故含糖量約為10.67 g/L時，pH值升高最大，含糖量過高、過低都不利于山葡萄酒MLF過程中pH值的升高；發酵時間也不宜過長，應在20 d左右，否則，會使pH值再下降。

2.2 含糖量對山葡萄酒MLF過程中總酸度的影響

測不同含糖量山葡萄酒在蘋果酸-乳酸發酵過程中的總酸度，結果如圖2所示。

由圖2可知，不同含糖量的山葡萄酒在MLF過程中總酸度變化趨勢均為緩慢降低。總酸度在MLF過程中下降值由高到低依次為2組（6.05 g/L）＞1組（5.86 g/L）＞3組（5.18 g/L）＞4組（4.30 g/L）＞原酒（0.32 g/L），2號山葡萄酒的總酸度降低的最多，4號山葡萄酒的總酸度降低的最少，兩者的總酸度相差1.75 g/L。故含糖量對山葡萄酒在MLF過程中總酸度降低有影響，總酸降低值與蘋果酸-乳酸轉化程度有關，與含糖量也有關系。含糖量過高，影響MLF過程中酸度下降，含糖量為10.67 g/L時，山葡萄酒的總酸度降低的最多。

圖2 含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵過程中總酸度的影響Fig．2 Effect of sugar content on total acidity of wild grape wine in the process of malolactic fermentation

2.3 含糖量對山葡萄酒MLF過程中蘋果酸-乳酸轉化的影響

不同含糖量山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵1 d、10 d和20 d蘋果酸-乳酸轉化紙層析結果如圖3所示。

圖3 發酵第1天（a）、第10天（b）和第20天（c）蘋果酸-乳酸轉化紙層析圖Fig．3 Malolactic conversion chromatogram of the 1 d （a），10 d （b）and 20 d （c）of fermentation

由圖3a可知，山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵第1天，不同含糖量的4個酒樣均未出現乳酸斑點，蘋果酸斑點均很清晰明顯，說明蘋果酸含量較多，沒有轉化乳酸。

由圖3b可知，酒蘋果酸-乳酸發酵第10天，不同含糖量的4個酒樣均有乳酸斑點出現，每個樣的乳酸斑點和蘋果酸斑點大小、清晰度一樣；比較4個酒樣，2號酒樣的蘋果酸斑點較1號、3號、4號酒樣蘋果酸斑點小，說明2號酒樣酒蘋果酸-乳酸轉化的量較其他3個酒樣多。

由圖3c可知，酒蘋果酸-乳酸發酵第20天，不同含糖量的4個酒樣的乳酸斑點比蘋果酸斑點大，乳酸斑點比蘋果酸斑點更清晰；比較4個酒樣，2號酒樣的蘋果酸斑點較1號、3號、4號酒樣蘋果酸斑點明顯小且淡，即2號酒樣蘋果酸-乳酸轉化最多；還可看出3號、4號含糖量多的兩個酒樣的蘋果酸斑點、乳酸斑點均較1號、2號含糖量少的兩個酒樣大，即3號、4號酒樣的蘋果酸、乳酸含量較1號、2號均多，說明含糖量高一方面抑制蘋果酸-乳酸轉化，另一方面，一部分糖發酵生成了乳酸。

綜上，含糖量過高或過低均不利于蘋果酸-乳酸發酵，不利于山葡萄酒的降酸。即含糖量為10.67 g/L時，蘋果酸-乳酸轉化程度最好。

2.4 含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵過程中總糖的影響

含糖量對山葡萄酒蘋-乳發酵過程中總糖的影響見圖4。由圖4可知，1號、2號、3號和4號山葡萄酒在蘋果酸-乳酸發酵過程中總糖的變化趨勢均為下降。1號總糖降低了0.18g/L，下降了3.85%；2號總糖降低了0.34 g/L，下降了3.19%，3號總糖降低了2.35 g/L，下降了9.52%，4號總糖降低了6.13 g/L，下降了11.21%，原酒總糖降低了0.06 g/L，下降了1.28%。

圖4 含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵過程中總糖含量的影響Fig．4 Effect of sugar content on total sugar contents of wild grape wine in the process of malolactic fermentation

從山葡萄酒蘋果酸-乳酸過程中總糖降低百分率來看，2號最低、4號最高，由高到低依次為4號＞3號＞1號＞2號，1號和2號總糖降低百分率值比較接近。可見，山葡萄酒的含糖量越多，其在蘋果酸乳酸發酵過程中總糖下降百分率越大，但對酒的風味無不良影響。

3 結論

通過含糖量對山葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵影響的研究發現，山葡萄酒的含糖量對蘋果酸-乳酸發酵影響較大。本研究含糖量設置的四個梯度分別代表干型、半干型、半甜型和甜型四種類型的山葡萄酒，含糖量為10.67 g/L的山葡萄酒（即半干型）蘋果酸-乳酸發酵pH升高值、總酸度降低值最大，蘋果酸-乳酸轉化程度最好。

山葡萄酒中含糖量過低的干型山葡萄酒，由于糖分營養不足，會影響MLF菌的生長、繁殖和代謝，從而影響蘋果酸-乳酸轉化。

山葡萄酒中含糖量高和過高的半甜型和甜型山葡萄酒，由于糖分過剩，阻遏蘋果酸-乳酸酶的合成，影響蘋果酸-乳酸轉化；但蘋果酸-乳酸發酵過程中其乳酸含量并不比半干型山葡萄酒少，說明過剩的糖通過乳酸代謝生成了乳酸，所以會影響pH值的升高和總酸的降低。

為了使山葡萄酒更好地進行蘋果酸-乳酸發酵，應控制好主發酵的時間，即嚴格控制蘋果酸-乳酸發酵菌的接種時間，使主發酵結束時含糖量為適量（10 g/L左右），否則會影響蘋果酸-乳酸發酵的啟動及蘋果酸-乳酸轉化程度。

[1]荊紹麗，姜 軍，于江深，等.山葡萄酒生產過程中蘋果酸-乳酸發酵的應用[N].華夏酒報，2010（1）：15-16.

[2]金炳奎，宗成文，曹后男，等.山葡萄SRAP技術體系的建立及其在品種鑒定中的應用[J].吉林農業大學學報，2013，35（2）：198-205.

[3]BOUIX M,GHORBAL S.Rapid assessment ofOenococcus oeniactivity bymeasuring intracellular pH and membrane potential by flow cytometry,and its application to the more effective control of malolactic fermentation[J].Int J Food Microbiol,2015（20）:64-72.

[4]李艷霞，宣亞文，秦珠紅，等.自動電位滴定法測定紅葡萄酒總酸度[J].周口師范學院學報，2007（2）：73-74.

[5]宋于洋，樊新民，王宗玉，等.葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵層析分析方法的研究[J].石河子大學學報：自然科學版，2003（2）：160-172.

[6]刁春霞，張雪梅，劉 波.干紅葡萄酒中總糖測定方法的改進[J].中國釀造，2009，28（5）：165-166.

[7]劉忠義，歐昌榮，湯海清，等.3,5-二硝基水楊酸法測定葡萄酒中總糖含量的條件優化[J].核農學報，2013，27（11）：1717-1723.

[8]DONG C,ZHANG Z,REN J P,et al.Stress-responsive gene ICE1 from Vitis amurensisincreases cold tolerance in tobacco[J].Plant Physiol Biochem,2013,71:212-217.

[9]FERRER-GALLEGO R,GONCALVES R,RIVAS-GONZALO J C,et al.Interaction of phenolic compounds with bovine serum albumin （BSA）and alpha-amylase and their relationship to astringency perception[J].Food Chem,2012,135（2）:651-658.

[10]RINALDI A,GAMBUTI A,MOIO L.Precipitation of salivary proteins after the interaction with wine:the effect of ethanol,pH,fructose,and mannoproteins[J].J Food Sci,2012,77（4）:485-490.

[11]繆粉英.自制葡萄酒的釀造技術及其保健功效[J].江蘇農業科學，2012，40（10）：249-250.

[12]崔長偉，劉麗媛，王 華，等.山葡萄綜合開發利用研究進展[J].食品科學，2015，36（13）：276-282.

[13]TANIASURI F,LEE P R,LIU S Q.Induction of simultaneous and sequential malolactic fermentation in durian wine[J].Int J Food Microbiol,2016,2:18-22.

[14]GAMBUTI A,RINALDI A,LISANTI M T,et al.Partial dealcoholisation of red wines by membranecontactor technique:influence on colour,phenolic compounds and saliva precipitation index[J].Eur Food Res Technol,2011,233（4）:647-655.

[15]LIU L Y,LI H.Review:research progress in amur grape,Vitis amurensis Rupr[J].Can J Plant Sci,2013,93:565-575.

[16]呂 珍，劉樹文.酒類酒球菌對葡萄酒中相關物質代謝的影響[J].食品科學，2012，33（21）：323-327.

[17]李瑞國，韓 燁，周志江.葡萄酒蘋果酸乳酸發酵研究進展[J].食品研究與開發，2010，31（8）：228-233.

[18]王百姓，馮積社.模糊綜合評價在干紅葡萄酒感官品評中的應用[J].中國食物與營養，2011，17（8）：33-37.

[19]徐 敏，杜金城，丁秀云，等.乳酸菌聯合酵母菌發酵制備一種新型沙棘酒[J].中國釀造，2016，35（1）：174-176.

Effect of sugar content on malolactic fermentation of wild grape wine

ZHANG Yulu1,GAO Pengfei1,YU Jiyang2,DING Yuping1*,LIU Yue1,XIA Zhiyao1
（1.College of Life Science,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2.College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Using the wild grape wine which was made of wild grape in the cold area of northeast as research object,the effect of sugar content on pH,total acid,malolactic conversion extent and total sugar content during malolactic fermentation process was investigated.The glucose content in wild grape wine would affect the pH increasing,total acid content decreasing and malolactic conversion extent.For the contents of glucose in wild grape wine,when the glucose content was 10.67 g/L,the pH value increased the most（0.18）,the total acid decreased the most（6.05 g/L）,and the malolactic conversion rate was the highest.

wild grape wine;glucose content;malolactic fermentation

TS261.4

0254-5071（2017）12-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.021

2017-07-12

黑龍江省教育廳自然科學基金項目（2016-KYYWF-0612）；佳木斯大學校長創新創業基金項目（xzyf2016-29）；佳木斯大學研究生科技創新項目（YZ2016_009）

張宇錄（1995-），女，本科生，研究方向為微生物發酵及生物技術在食品方面的應用。

*通訊作者：丁玉萍（1964-），女，高級工程師，本科，研究方向為微生物發酵及生物技術在食品方面的應用。