透明質酸發酵過程的動力學模型

丁 永，趙郁聰*

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 輕工科學與工程學院，陜西 西安 710021）

透明質酸發酵過程的動力學模型

丁 永1，趙郁聰2*

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學 輕工科學與工程學院，陜西 西安 710021）

構建透明質酸發酵動力學模型可反⒊發酵過程中菌體生長量、基質消耗量及透明質酸產量之間的變化規律。采用獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）進行搖瓶發酵，利用MATLAB軟件對透明質酸含量、還原糖殘量、菌體量的實驗數據進行了非線性規劃，建立了透明質酸生成動力學的模型。對擬合值與實驗值進行比較，發現其吻合度較好，相對誤差＜5%。本模型適用于培養基初糖質量濃度＜30 g/L的分批發酵，為透明質酸的產業化生產放大、發酵過程的工藝設計和管理控制提供科學的依據。

透明質酸；獸疫鏈球菌；發酵動力學

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以β-1,3-糖苷鍵和β-1,4-糖苷鍵連接而成的二糖單位重復構成的直鏈粘多糖[1]。廣泛存在于高等動物的結締組織和微生物莢膜中。HA的生理功能多種多樣，如其良好的粘彈性在關節腔中可起到潤滑和保護的作用；可使細胞之間黏合在一起，保證了正常的細胞代謝及組織保水作用，并保護細胞不受病原菌的侵害，在皮膚中起到保持水分的作用，使皮膚具有良好的彈性和韌性。近年來用HA治療骨關節疾病以及HA對疼痛和炎癥的緩解作用，預防術后粘連和對軟組織修復的顯著效果[2]。透明質酸-納米銀復合凝膠在臨床創傷包縛材料領Ⅱ有潛在的應用價值[3]，透明質酸在癌癥轉移控制藥物及新⒈藥物載體設計有廣泛應用[4]。

傳統獲得HA的方法是動物組織提取法，但該方法存在原料不足、工藝復雜、純度低、生產成本昂貴等缺點。1983年日本資生堂成功開發出微生物發酵法生產的HA，從此克服了組織提取法的諸多缺點，成為現下國外主流的生產方法[5]。目前國內的HA生產廠家大多還采取組織提取法，但收率低、提純難、成本高、質量差、難以大規模生產，無法滿足國內市場的需求，還需從國外大量進口。本研究通過對獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC-39920生產透明質酸的發酵動力學進行研究，旨在為透明質酸的放大實驗、發酵過程的工藝設計和管理控制提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）：陜西科技大學食品與生物工程學院誘變保藏（原始菌株編號：ATCC-39920，來源于美國國家菌種保藏中心），實驗室保藏號Sz560。

1.1.2 培養基

斜面培養基：葡萄糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，滅菌前調整pH7.0、121℃滅菌20min；血瓊脂平板（70 mm血平板）：華美生物有限公司；

種子培養基：葡萄糖20 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏10 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，K2HPO41.5g/L，滅菌前調整pH7.0、121℃滅菌20min，冷卻至溫度低于50℃，無菌條件下加入1%優級小牛血清；

搖瓶發酵培養基：葡萄糖30 g/L，酵母浸粉20 g/L，小牛血清1%，MgSO42.0 g/L，KH2PO41.6 g/L，FeSO40.005 g/L。調pH 7.0、121℃滅菌20 min備用。

1.1.3 材料

氫氧化鈉、葡萄糖（均分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（均生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、標準透明質酸（均為分析純）：美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

RDX-280型不銹鋼電熱手提式滅菌消毒器：上海申安醫療器械廠；Q/BKYY10-91型隔水式電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療儀器廠；HQL300柜式恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；TDH-1恒溫空氣搖床：江蘇太倉儀器廠；J2-Mc高速冷凍離心機、DU640紫外-可見分光光度計：美國Beckman公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取10 mL液體培養基于試管中，滅菌后加入1%的小牛血清，菌種用接種環挑取一環接種于試管中，置于37℃靜置培養24～36 h；重復操作活化兩次。

1.3.2 種子培養

用接種環從斜面上挑取一環菌體，接于裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中培養，200 r/min、37℃培養12～24 h。

1.3.3 發酵培養

將培養好的種子接入裝有50 mL發酵液的500 mL三角瓶中，接種量為5%，200 r/min、37℃培養14 h。1.3.4取樣檢測

每2 h取一次樣品，在10 000 r/min條件下離心10 min，離心后分離上清液與沉淀分別置于4℃冰箱中保存，待檢測備用并作好記錄[6]。

1.3.5 計算公式

在平衡生長條件下，微生物細胞的生長速率rX的計算公式為：

式中：X為微生物細胞濃度，g/L；μ為微生物比生長速率，h-1。

由表４可以看出，解釋變量與解釋變量和，以及解釋變量和之間都存在高度線性相關性．盡管方程整體線性回歸擬合很好，但變量的參數t值并不顯著，表明模型確實存在嚴重的多重共線性．

1.3.6 測定方法

菌體生長量的測定：按照參考文獻[7]的方法測定。還原糖濃度測定：采用DNS法[6]。透明質酸濃度檢測方法：采用CTAB濁度法[8]。

2 結果與分析

2.1 獸疫鏈球菌菌落和菌體特征

圖1 發酵菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphology of fermentation strains

2.1.1 菌落形態由圖1可知，菌落形態為圓形、表面干燥、褶皺、邊緣粗糙、顏色為乳白色并有凸起。

2.1.2 菌體發酵過程形態變化

圖2 不同發酵階段的菌體形態Fig.2 Mycelial morphology of different fermentation phases

由圖2可知，隨著發酵時間的延長，菌體數量逐漸增加，并且由最初的單個菌體變成之后的多個個體相連的長鏈形式，培養初期菌體莢膜比較明顯，從9 h之后莢膜明顯的消失，其主要原因可能是菌體進入穩定期后透明質酸釋放到周圍環境中，莢膜也隨之消失。

2.2 獸疫鏈球菌發酵動力學研究[9]

圖3 獸疫鏈球菌發酵過程曲線Fig.3 Fermentation curve ofStreptococcus zooepidemicus

由圖3可知，在0～1 h期間，菌體處于適應期，菌體數量沒有顯著增加，葡萄糖的消耗也很小；在2～5 h期間，菌體處于對數生長期，菌體體積及數量急劇增加，葡萄糖殘量急劇下降；在6 h以后的時間段里，菌體進入穩定期及衰退期，殘糖量變化基本不變了。透明質酸含量曲線為鐘形曲線，中間會有一個峰值。在前期，隨著菌體量的增加，HA含量逐漸增加；在8～12 h期間，含量達到最大值，此時期菌體正好進入穩定期，莢膜中的HA基本都已釋放到培養基中去，隨后的時間段里，HA分子降解，分子量降低，HA含量降低。由此可知，透明質酸主要是在穩定期產生。

2.2.1 菌體生長動力學模型的建立[10-12]

在獸疫鏈球菌發酵生產透明質酸的過程中，產物包括透明質酸、乳酸、乙酸等，乙酸的濃度相當低，已忽略不計。在發酵過程中，葡萄糖為唯一限制性底物，乳酸為唯一限制性產物。由圖3可知，HA和乳酸的生成與菌體的生長相偶聯，但當乳酸積累到一定濃度時，HA的合成速度明顯變慢，說明乳酸對HA的合成具有強烈的抑制作用。同時，乳酸的產生對細胞繼續合成乳酸也會產生抑制作用[13]。所以結合Andrew和Hinshelwood模型，發現下面的動力學模型能較好的擬合：

式中：μmax為菌體最大比生長速率，h-1；KS為底物半飽和常數，g/L；Ki為底物抑制常數，g/L；K1為乳酸對菌體生長的抑制常數；PLA為乳酸濃度，g/L。

2.2.2 底物消耗動力學模型

發酵過程中底物的消耗主要用于以下3個方面：一是用于菌體細胞生長；二是合成代謝產物；三是用于維持細胞生長代謝所需的基本能量。底物的消耗與微生物菌體生長及代謝產物的形成有著密切的關系。以此，建立動力學模型為：

式中：YX/S為細胞生成得率系數，即細胞生成速率與底物消耗速率之比；YP/S為產物形成得率系數，即產物形成速率與底物消耗速率之比；mS為維持細胞結構和生命活動所需能量的細胞維持系數，g/（g·s）。

2.2.3 透明質酸產物生成動力學模型

由圖3可知，透明質酸的發酵為生長偶聯型過程，可以用下面的動力學模型對其進行模擬：

式中：PHA為HA的質量濃度，g/L；PLA為乳酸的質量濃度，g/L；αHA為HA的偶聯常數；K2為乳酸對HA合成的抑制常數。

2.3 模型參數求解

根據測定結果，應用MATLAB軟件對其進行非線性規劃，求得模型參數。

表1 動力學模型參數模擬值Table 1 Simulation values of kinetics model parameters

由此，得到本實驗的發酵動力學模型：

（1）菌體生長動力學模型為：

（2）底物消耗動力學模型為：

（3）透明質酸生成動力學模型為：

2.4 發酵動力學模型的擬合值與實驗值的比較[14-15]

模型建立后，其適用性還有待通過進一步的發酵結果對模型進行驗證。結果見圖4。

由圖4可知，菌體生長曲線為典型的S型曲線。0～4h為適應期；4～16 h為對數生長期，HA含量峰值就出現在此時期；16 h之后為穩定期，菌體數量變化不大，HA的含量也不再增加。

圖4 菌體生長動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.4 Comparison of fitted values of kinetics model and experimental values of biomass

圖5 透明質酸含量動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.5 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of hyaluronic acid production

圖6 底物消耗動力學模型擬合值與實驗值的比較Fig.6 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of substrate consumption

圖7 乳酸生成動力學模型擬合值與實驗值比較Fig.7 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of lactic acid production

由圖5～圖7可知，所建模型能較好地反應出獸疫鏈球菌發酵產透明質酸的過程，底物的消耗，乳酸生成的擬合值與實驗值吻合度好，相對誤差＜5%。

3 結論

本實驗基于大量的發酵數據，通過計算機軟件對透明質酸發酵動力學模型進行了非線性規劃，建立了透明質酸發酵動力學的模型。除少量實驗數據偏差較大之外，擬合值與實驗值較吻合，達到了實驗的目的。

菌體生長動力學模型顯示菌體生長受到兩方面的抑制因素，一項為底物抑制，另一項為產物乳酸的抑制。透明質酸生成動力學模型可知在乳酸產量較低時，透明質酸的量與生物量呈正比例關系；當乳酸量與透明質酸量積累到一定濃度時，HA的合成速度明顯變慢，說明HA的合成與菌體的生長相偶聯并受到乳酸的抑制作用。

[1]凌沛學，張天民.透明質酸[M].北京：中國輕工業出版社，2007：1-25.

[2]李宏宙.透明質酸鈉、復方倍他米松聯合應用對骨性關節炎的臨床效果和病理特征分析[D].天津：天津醫科大學，2014.

[3]張 飛.基于透明質酸粘多糖的功能性材料及其應用研究[D].上海：上海交通大學，2014.

[4]張容鵠，張劍韻，崔瑩瑩，等.高分子量透明質酸產生菌選育及發酵條件優化[J].中國釀造，2008，27（19）：17-21.

[5]MEYER K,PALMER J W.The polysaccharide of the vitreous humor[J].J Biol Chem,1934,107（3）:629-634.

[6]陳 堅，堵國成，劉 龍.發酵工程實驗技術[M].北京：化學工業出版社，2013：37-44.

[7]羅瑞明.發酵法生產透明質酸的工藝研究[J].寧夏農學院學報，2002，23（1）：33-36.

[8]劉屹然，陳海林，李宗偉，等.發酵液中透明質酸含量測定方法的比較研究[J].河南師范大學學報，2006，34（1）：102-105.

[9]羅瑞明，李亞蕾，徐桂華，等.以獸疫鏈球菌NUF-036分批發酵生產透明質酸的工藝研究及動力學模型的建立[J].寧夏大學學報，2004，25（4）：368-373.

[10]鄒芳勤.雙歧桿菌抑制因素研究和動力學模型的建立[D].無錫：江南大學，2004.

[11]姜菲菲.葡萄糖酸鈉高產菌的篩選及其發酵動力學研究[D].濟南：山東輕工業學院，2010.

[12]于 雷.細菌發酵法生產透明質酸的研究[D].長春：吉林大學，2003.

[13]HUANG W H,CHEN S J,CHEN T L.Modeling the microbial production of hyaluronic acid[J].J Chin Inst Chem Eng,2007,38（3）:355-359.

[14]湯 斌，許鐘源，李 松，等.匍枝根霉纖維素酶發酵條件優化及分批發酵動力學模型的構建[J].食品與發酵工業，2014，40（1）：85-90.

[15]張建國，陳曉明，賀新生.靈芝胞外多糖分批發酵動力學模型[J].生物工程報，2007，23（6）：1065-1070.

Kinetic model of the hyaluronic acid fermentation process

DING Yong1,ZHAO Yucong2*
（1.School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China;2.School of Light Industry,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China）

The construction of hyaluronic acid fermentation kinetics model can reflect the change rules between the biomass variation,substrate consumption and hyaluronic acid production in the fermentation process.The hyaluronic acid was fermented in shake flask byStreptococcus zooepidemicus,the hyaluronic acid content,reducing sugar residue content and bacterial amount were conducted with nonlinear programme,and the kinetic model of hyaluronic acid production was established by MATLAB software.The fitted value was coincided with the experimental value,and the relative error was less than 5%.The model was applicable to the batch fermentation in the medium with initial glucose concentration less than 30 g/L,and it could provide scientific basis for the industrial production amplification of hyaluronic acid,fermentation technology design and operation management.

hyaluronic acid;Streptococcus zooepidemicus;fermentation kinetics

TQ929.2

0254-5071（2017）12-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.026

2017-10-04

陜西省教育廳專項科研計劃項目（14JK1089）

丁 永（1974-），男，講師，博士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：趙郁聰（1975-），女，副教授，博士研究生，研究方向為發酵工程。