HPV16-E6-DNA對宮頸癌預后價值分析

程瑩星， 黃 勇

(安徽省合肥市第二人民醫院腫瘤科, 安徽 合肥 230011)

HPV16-E6-DNA對宮頸癌預后價值分析

程瑩星， 黃 勇

(安徽省合肥市第二人民醫院腫瘤科, 安徽 合肥230011)

目的探究HPV16-E6-DNA對宮頸癌預后預測價值。方法回顧性分析本院2014年1月至2017年3月收治的72例宮頸癌患者臨床資料，抽血化驗，采用熒光定量(PCR)技術測定HPV16-E6-DNA病毒載量，按照其檢測結果將患者分成兩組，即低載量組與高載量組，采用熒光定量(RT-PCR)測定宮頸癌患者組織中的HPV16-E6-DNA病毒載量，利用Kaplan-Meier計算方式計算兩組生存率，選用Cox回歸分析法分析影響患者5年生存率的因素。結果HPV16-E6-DNA病毒載量在宮頸癌患者組織表達水平與患者年齡、FIGO分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)；低載量組患者1、3、5年生存率分別為95.66%、89.31%、74.30%；高載量患者1、3、5年生存率分別是89.10%、62.61%、51.36%，低載量患者的生存率顯著高于高載量組(P<0.05)；Cox回歸分析結果顯示，HPV16-E6-DNA病毒載量以及淋巴結轉移均是影響宮頸癌患者預后的重要因素(P<0.05)，有統計學意義。結論HPV16-E6-DNA病毒對宮頸癌患者預后具有重要預測價值，是宮頸癌根治術后預后監測的重要因子，作為宮頸癌根治術后影響生存率的危險獨立因素。

宮頸癌； HPV16-E6-DNA； 病毒載量

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，隨著人們生活習慣的改變，該病發病率呈年輕化趨勢，該病常見病因有高危型HPV感染、多個性伴侶、分娩次數及其他生物學因素等有關，主要以陰道流血、白帶異常、尿頻尿急等臨床表現。據統計發現[1,2]，該病約占生殖系統惡心腫瘤的首位，嚴重危及女性患者的生命健康。目前研究較多的高危型人乳頭瘤病毒DNA(high-risk human papillom avirus，HR-HPV)的表達、病理分型、腫瘤直徑、年齡、組織分化、深肌層浸潤、淋巴結轉移、宮旁浸潤、手術切緣陽性等[3]。由于檢測技術、地域、樣本量差異、人群等差異，故各大醫院檢測結果不一致，存在較多的爭論。鑒于此，本次研究對72例宮頸癌患者進行分析，觀察HPV16-E6-DNA對宮頸癌預后預測價值，為患者預后的判斷及診治提供倫理依據，現報道如下。

1 資料和方法

1.1一般資料：回顧2014年1月至2017年3月我院婦科腫瘤手術切除的宮頸癌標本135例，通過細胞學及病理學確診為HPV16陽性患者72例。納入標準：①患者均為第一次手術，且手術前均未進行放化治療等；②臨床分期按照2009《國際婦科聯盟(FIGO)》標準[4]；③隨訪資料完整；④腫瘤直徑測量根據婦科檢查，結合MR檢查結果確定，腫瘤直徑<4cm34例，≥4cm38例。深肌層浸潤為顯微鏡下可見宮頸外1/2肌層受到腫瘤侵犯。HPV16-E6-DNA病毒拷貝數根據實驗室結果分組。72例患者中鱗癌35例、腺癌37例，組織分化程度：低分化25例、中分化17例、高分化30例，最小年齡27歲，最大年齡78歲，平均年齡(55.23±5.14)歲。

1.2檢測儀器與方法：抽血化驗，選用Qiagen DNA試劑盒(德國)提取凍存病變組織中的DNA，具體操作步驟應根據試劑盒說明書進行，DNA溶液放置冰箱冷藏(-80℃)。選用實時熒光定量(PCR)儀檢測HPV16-E6-DNA載量。HPV16-E6基因的質粒構成：選用南京金斯瑞神曲科技公司提供的合成HPV16-E6基因，將其復制在pcDNA3.1-myc-HisA載體上。HPV16-E6-DNA含量檢測：選用標準曲線實時熒光定量(PCR)技術，按照試劑盒說明書進行DNA小量制作與純化，并計算拷貝數，檢測標準品與待測樣品的HPV16-E6基因，獲得DNA含量，每一個樣品反復檢測3次，取平均值。

拷貝數=[質量(g)×6.023×1023]÷(324.5×2×質粒DNA長度)×100。基因拷貝數(copy/ng DNA )=[基因含量(copy/μL)] /[DNA含量(μg/μL)]

注：6.023×1023表示1摩爾物質的分子數；324.5表示堿基的平均相對分子質量。

1.3觀察指標：從患者出院后開始跟蹤隨訪，前2年每半年隨訪一次，以后每年隨訪一次，隨訪方式為來院或電話隨訪。本次隨訪共72例，隨訪過程中2例中斷，隨訪率97.22%。分析HPV16-E6-DNA載量與臨床特征的關系、病毒載量對生存的影響及宮頸癌患者生存影響因素。

1.4統計學分析：全部數據初步以EpiData3.1軟件校正，選用SPSS17.0統計學軟件處理；“n(%)”形式表示計數資料，以χ2檢驗；采用多因素COX比例風險回歸模型分析宮頸癌患者年齡，HPV16-E6-DNA病毒載量、FIGO分期、淋巴結是否轉移等對宮頸癌患者預后影響。對于等級資料，采用秩和檢驗。檢驗水準：P<0.05。

2 結 果

2.1HPV16-E6-DNA載量與臨床特征的關系：表1結果顯示，FIGO分期、年齡、淋巴結轉移及宮旁浸潤情況與載量有關(P<0.05)；其中組織分化程度、病灶類型、腫瘤直徑、肌層浸潤等與載量無關(P>0.05)。

2.2HPV16-E6-DNA病毒載量對生存率影響：低載量組1、3、5年生存率分別是95.66%、89.31%、74.30%；高載量患者1、3、5年生存率分別是89.10%、62.61%、51.36%，低載量患者的生存率顯著優于高載量組(P<0.05)。

2.3分析宮頸癌患者生存狀況的影響因素:表2結果顯示，HPV16-E6-DNA載量與盆腔淋巴結轉移是宮頸癌患者預后的重要因素(P<0.05)。

表1 HPV16-E6-DNA載量與臨床特征的關系n(%)

表2 分析宮頸癌患者生存狀況的影響因素

3 討 論

HPV屬于乳多空病毒科A成員之一，是一組沒有被包裹的較小DNA病毒，有種屬特異性和嗜上皮性。1971年由Mazumder D等[5]第一次提出宮頸癌是由HPV感染所致。目前多項研究已證明HPV感染均可導致宮頸癌或其他盆腔惡性腫瘤。文章結果顯示，宮頸癌患者組織中的HR-HPV E6蛋白陽性表達率與患者年齡、FIGO分期、組織類型、宮旁浸潤相關(P<0.05)。但和組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結轉移等無關。據文獻報道顯示[6]，高危型HPV感染患者均為>40歲女性，不能自行緩解，與CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌有關。這與本研究結果一致。文章研究結果顯示，宮頸鱗癌均為HPV16感染，而宮頸腺癌均為HPV18感染相關。本研究中的HPV E6蛋白在鱗癌的表達高于腺癌等其他類型。但關于HPV感染對宮頸癌浸潤能力的文獻報道過少。文章結果顯示，與HPV感染有關的高級鱗狀上皮內病變、惡性腫瘤中的E6/ E7蛋白表達水平較高，說明這兩種蛋白的水平直接影響宮頸病變進展，并與細胞惡化程度有關。據報道顯示[7]，特定的HPV16- E6變異將有很高的宮頸癌風險。各項研究證明端粒酶的激活與宮頸異常增生與宮頸癌的發生和發展相關。原因可能與HPV16- E6能提升端粒酶的逆轉錄酶(HTERT)mRNA的水平，從而激活端粒酶，這是CIN向宮頸癌發展的重要過程，其陽性表達率會隨著宮頸癌的病變程度而不斷升高等有關，且與宮頸癌的分期呈正相關[8]。

有學者指出[9]，高危型HPV在整合宮頸上皮細胞后，能促進宮頸上皮細胞表達水平，導致腫瘤鄰近的組織形成新生血管與淋巴管，加快宮頸癌的擴散，在上述因素共同作用下促進病毒復制與繁殖，讓處于整合狀態的病毒癌基因的細胞不斷增生。這與本次的HPV16- E6蛋白及宮旁浸潤一致。說明高危型HPV- E6蛋白在促進宮頸癌上皮癌變期間占據重要角色，HPV16在宮頸癌的侵襲與轉移均有協助作用。

HR-HPV感染是誘發宮頸癌的主要因素。據流行病學資料顯示[10]，99.6%的宮頸癌患者均感染HR-HPV，基因型為HPV16，約占60%左右，HR-HPV E6/ E7癌基因和宮頸癌的發生與發展有密切關系。HR-HPV E6癌蛋白是病毒生命周期的重要蛋白，在宮頸癌病變過程中起主要作用，而且和病毒復制、細胞凋亡、宿主細胞周期的調控、細胞增生、細胞惡性轉變等相關，在各種作用機制下影響宮頸癌的進展。本次研究通過提取宮頸癌患者組織中的DNA，采用熒光定量(PCR)技術測定HR-HPV E6-DNA病毒載量，分析其與宮頸癌病理學特征的關系及對患者預后的預測價值。結果顯示，HR-HPV E6-DNA在宮頸癌組織中的表達與美國陰道鏡和宮頸病理協會(ASC-CP)中HPV高危亞型，特別是16和18亞型感染在宮頸病變中占據主導作用。

結果顯示，HR-HPV E6-DNA病毒載量與宮頸癌患者年齡有關，但我國對此類研究報道較少，為此需要深入探討。嚴鳴等[11]研究證實，HR-HPV E6-DNA病毒載量與宮頸癌FIGO分期有顯著性的關系，分期越晚的DNA中的病毒載量顯著高于早期宮頸癌患者，這與本次研究結果相符。曾四元等[12]對134例宮頸癌患者的外周靜脈血，利用PCR測定高危型HPV DNA病毒載量，結果提示淋巴結轉移組的病毒載量顯著高于沒有淋巴結轉移組，結果顯示，HPV DNA病毒載量和淋巴結轉移關系密切，這與本次研究結果一致。

Kaplan-Meier生存率分析結果顯示，宮頸癌預后因素與年齡有關，這與文獻報道結果不符。其原因可能與以下情況有關，由于年輕患者更加注重每年一次的婦科體檢，加之年輕患者身體條件較好等。據文獻報道結果顯示，FIGO分期、肌層浸潤、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結轉移均是影響宮頸癌患者預后的關鍵因素，尤其是淋巴結轉移最為突出，這與本研究結果一致。據調查發現[13]，淋巴轉移在大部分實驗中都是一個獨立的危險因素，這與本次研究多因素分析結果相符，但淋巴結轉移不會影響臨床分期，因此對淋巴結轉移的早期宮頸癌患者在治療過程中應更加重視，加強隨訪，同時建議患者進行仔細檢查或是積極診治，避免加重病情進一步惡化。本研究得知HR-HPV E6-DNA病毒載量作為宮頸癌預后的關鍵因素。有學者認為HPV16- E6蛋白屬于宮頸上皮惡變的催化劑，在增生失控期間引起異常的VEGF-C，進而促進宮頸癌浸潤轉移的惡性循環，它在宮頸癌發病機制中有主導作用。鑒于此，HPV16- E6在分子水平上進行病情監測、制定治療措施、評估預后均有重要價值。Kaplan-Meier生存率分析顯示，HR-HPV E6-DNA低載量組患者1、3、5年生存率分別為95.66%、89.31%、74.30%；而高載量患者1、3、5年生存率分別是89.10%、62.61%、51.36%，高載量組的生產率明顯低于低載量組(P<0.05)。

綜合上述，由于本次研究數量較少、還需進行前瞻性隨機對照試驗，為探尋對臨床有著指導意義的預后因素。HR-HPV E6-DNA病毒載量用于宮頸癌患者預后評估，為指導治療發揮積極作用。

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ThePrognosticValueofHPV16-E6-DNAforCervicalCancer

CHENGYingxing,HUANGYong

(HefeiSecondPeople'sHospital,AnhuiHefei230011,China)

Objective: To explore the prognostic value of HPV16-E6-DNA in cervical cancer.MethodsA retrospective analysis of our hospital in January 2014 ～2017 year in March 72 cases of cervical cancer patients with clinical data, blood tests, using fluorescence quantitative (PCR) technique for detection of HPV16-E6-DNA virus load, according to the test results of the patients were divided into two groups, namely low load and high load group, using fluorescence quantitative (RT-PCR) determination of cervix cancer tissue HPV16-E6-DNA viral load, using Kaplan-Meier to calculate the survival rates of the two groups, using the factor Cox regression analysis in patients with 5-year-survival rates.ResultsThe expression levels of HPV16-E6-DNA viral load in patients with cervical cancer were related to age, FIGO stage and lymph node metastasis (P<0.05); The 1, 3 and 5 year survival rates of the patients in the low load group were 95.66%, 89.31% and 74.30% respectively; The 1, 3 and 5 year survival rates of the patients in the high load group were 89.10%, 62.61% and 51.36% respectively; The survival rate of patients in the low load group was significantly higher than that of high load group, the difference was statistically significant (P<0.05); Cox regression analysis showed that HPV16-E6-DNA viral load and lymph node metastasis were the important factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer (P<0.05).ConclusionHPV16-E6-DNA virus is an important predictor of the prognosis of cervical cancer patients. It is an important factor in the prognosis of cervical cancer after radical resection. It is also an independent factor in the survival rate of cervical cancer after radical operation.

Cervical cancer; Patients; HPV16-E6-DNA; Viral load

1006-6233(2017)12-1944-05

安徽省自然科學基金項目編號，(編號2016J019)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.12.003