阿克蘇核桃生產(chǎn)園鏈格孢菌核桃葉枯病診斷研究

[摘 要] 本文選取新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣、阿克蘇市、阿瓦提縣主要核桃生產(chǎn)園為調(diào)查對象，采集一些新鮮的核桃葉枯病病株，并對核桃葉病株進行分離物的純化提取。結(jié)果表明，在分離后的菌落組織塊中生長出一種真菌，也就是鏈格孢菌；采用單孢分離法進行分離物的純化，并對分離物進行致病性檢測，發(fā)現(xiàn)接種后的核桃葉可以出現(xiàn)自然的核桃葉枯病癥狀，從形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)角度來看，能夠確定阿克蘇地區(qū)核桃生產(chǎn)園中的核桃葉枯病病原菌是鏈格孢菌。

[關(guān)鍵詞] 核桃生產(chǎn)園；核桃葉枯病；鏈格孢菌；阿克蘇地區(qū)

[中圖分類號] S436.64 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-7909（2017）26-70-2

核桃產(chǎn)業(yè)是新疆阿克蘇地區(qū)重要的果蔬產(chǎn)業(yè)之一，在新疆全境范圍內(nèi)核桃的種植面積可以達(dá)到30萬hm2，每年核桃產(chǎn)量25萬t，這些核桃會面向全國進行銷售。作為地方經(jīng)濟發(fā)展重要的產(chǎn)業(yè)支柱，核桃的產(chǎn)量影響重大。而近年來隨著核桃種植面積的不斷擴大，加上氣候和核桃品種的影響，核桃葉枯病的病害影響十分嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅著核桃的產(chǎn)量和成果質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2016年阿克蘇地區(qū)核桃生產(chǎn)園中的鏈格孢菌核桃葉枯病病株為研究對象，同時，準(zhǔn)備好鏈格孢菌核桃葉枯病診斷所需要用到的PDA培養(yǎng)基、我妻氏WA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基[1]。

1.2 方法

針對核桃枯葉病進行試驗診斷，需要采用組織分離法來對一些具有鏈格孢菌核桃枯葉病典型病癥的新鮮病株進行分離，然后靜靜地等待分離好的菌株生長3 d，使用尖端菌絲挑取的方式來對提取物進行純化，通過單孢分離的方式可以提高純化的精度，從而獲得純培養(yǎng)菌種。接下來，把純培養(yǎng)菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，進行72 h的活化培養(yǎng)，使其配置形成一個106～108/mL濃度的孢子懸浮液，進而完成對分離物的致病性檢測，采取無傷接種和針刺傷兩種處理方式，每種處理方式需要重復(fù)進行3次，并且以無菌水作為對照物。完成接種后，需要對培養(yǎng)基覆蓋滅菌濕脫脂棉，用塑料袋套好，使其可以保濕至少48 h，放置在28 ℃的人工保濕箱中進行培養(yǎng)。每天需要觀察并記錄下接種位置的變化情況，至少記錄5 d，再對接種以后出現(xiàn)核桃葉枯病的發(fā)病葉片展開病原菌的再分離操作，完成對分離物的純化和鑒定[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與單孢純化結(jié)果

選取阿克蘇地區(qū)溫宿縣、阿克蘇市、阿瓦提縣3個地區(qū)的核桃生產(chǎn)園，在核桃生產(chǎn)園中采集出現(xiàn)了典型鏈格孢菌核桃葉枯病癥狀的帶病病株進行組織分離，共切取了200塊組織，而且經(jīng)過5 d培養(yǎng)后，有136塊組織塊上生長出了一種真菌，即為鏈格孢菌，表1是此次核桃葉枯病實驗病原菌分離的結(jié)果[3]。從分離后得到的菌株生長情況來看，在菌落生長的最初階段，菌落的顏色是白色的，然后菌落的邊緣逐漸變成灰白色，而菌落中間的顏色開始呈現(xiàn)出灰黑色，并且菌落呈絮狀，開始蔓延生長。從我妻氏WA培養(yǎng)平板上展開的單孢純化，純化分離的試驗結(jié)果如圖1所示。

2.2 分離物致病性檢測與再分離結(jié)果

在對分離物的致病性進行檢測時，需要針對分離物代表來進行健康核桃葉片的接種，從檢測結(jié)果可以觀察出，完成接種7 d后，有葉枯病病傷的葉片開始發(fā)病，而采用無傷接種方式進行接種的葉片則沒有發(fā)病；接種后15 d，被進行刺傷接種的核桃葉葉片的發(fā)病率基本已經(jīng)達(dá)到100%，而無傷接種的葉片發(fā)病率是75%。這種分離物致病性檢測的結(jié)果表明，不管是刺傷接種還是無傷接種，核桃葉片的發(fā)病癥狀均與核桃生產(chǎn)園中的核桃葉片的自然發(fā)病情況是一樣的；此時對照組中的核桃葉片，不論是進行有傷接種還是無傷接種，均沒有發(fā)病[4]。

因此，需要針對已經(jīng)發(fā)病了的核桃葉片進行再分離檢測，切取120塊組織，然后經(jīng)過3 d的培養(yǎng)，其中有98塊生長出了鏈格孢真菌，再分離的成功率為81.67%。

2.3 核桃葉枯病的病原菌鑒定

在進行核桃葉枯病的病原菌鑒定工作時，需要選擇3個比較有代表性的菌株展開形態(tài)學(xué)上的鑒定試驗，分別是WS2-1菌株、AKS2-2菌株和XH2-3菌株，然后觀察菌株在PSA和PCA培養(yǎng)皿上的鏈格孢菌菌落在形態(tài)學(xué)上是否存在差異。在鑒定過程中，需要將PCA培養(yǎng)基放在26 ℃的環(huán)境下，12 h是黑暗狀態(tài)，12 h需要進行光照，培養(yǎng)5 d后可以發(fā)現(xiàn)，在菌落培養(yǎng)的初期階段，菌落的顏色是白色的，當(dāng)菌株得到光照以后，菌落的顏色就會慢慢地轉(zhuǎn)變成為暗灰色或暗青褐色，此時菌落的邊緣部分仍然是白色的，形狀是圓形，菌落的邊緣劃分比較整齊，但菌落的背光面部分將呈現(xiàn)出暗褐色[5]。

從菌株的產(chǎn)孢表型狀態(tài)來看，是具有短分支的孢子鏈，培養(yǎng)基中會氣生出菌絲，菌絲的顏色會由淡褐色逐漸轉(zhuǎn)化為褐色，菌絲間有隔，而且多有分枝。從分生孢子的性狀來看，孢子梗是分隔的，沒有分枝，顏色也會由淡褐色逐漸轉(zhuǎn)化為褐色，并呈現(xiàn)出合軸式延伸，延伸后的大小為（30.0 μm×4.0 μm）～（78.0 μm×5.8 μm）[6]。分生后的孢子可以是單生的，也可能是短鏈生的，短鏈生的孢子會經(jīng)常出現(xiàn)分枝的鏈，使得孢子呈現(xiàn)出倒棍棒形或是卵形、橢圓形，甚至是倒梨形，顏色由淡褐色逐漸轉(zhuǎn)為褐色，孢子的表面非常光滑，有3～8個橫隔，有1～4個縱隔、斜隔和隔膜，但在分隔的地方會有一些縊縮，此時孢身會略微縮小，孢身的大小為（11.0 μm×4.8 μm）～（31.8 μm×13.0 μm）。短喙呈圓柱形，顏色會由淡褐色逐漸轉(zhuǎn)化為無色，尺寸也會慢慢縮小，為14.0 μm×（1.2～5.0）μm。因此，根據(jù)病原菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性，可以判斷核桃葉枯病的病原菌是鏈格孢菌。

在使用ITS1F-ITS4真菌引物對所用的核桃葉枯病致病菌株進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測時，可以獲得2條500～750 bp的清晰條帶，對條帶進行測序，可以獲得一條長度大約為560 bp的rDNA ITS序列。將測到的序列放到Gen Bank數(shù)據(jù)庫中展開同源性比較，能夠發(fā)現(xiàn)致病菌株B1、b2及Ⅰ-Ⅱ序列同鏈格孢菌的ITS序列的同源性程度可以達(dá)到99%，說明核桃葉枯病的致病病原菌就是鏈格孢菌。

3 討論

鏈格孢菌屬于真菌的一種，會對很多植物造成侵害，除了能夠?qū)е潞颂胰~枯病以外，如玉米大斑病、大蔥紫斑病、白菜黑斑病等，都是因為鏈格孢菌造成的。鏈格孢菌通常會寄生到植物上，然后引起植物病害，進而造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)。不僅如此，有一些鏈格孢菌的小孢子能夠入侵人體和動物體內(nèi)，引發(fā)皮癬、甲癬及額骨髓炎等皮膚疾病，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。

鏈格孢菌在自然的環(huán)境狀態(tài)下，常常會生長于植物的枯老病死部位或是植物衰弱的組織上，并且在基質(zhì)的表面會出現(xiàn)一層不同厚度的暗色霉層。本次研究所選取的阿克蘇地區(qū)核桃生產(chǎn)園中的核桃葉枯病病株，通過對病株進行病原菌診斷后發(fā)現(xiàn)，阿克蘇地區(qū)的核桃葉枯病皆為鏈格孢菌引起的，這與之前在和田地區(qū)所發(fā)現(xiàn)的核桃葉枯病病原菌是一樣的，發(fā)病癥狀也幾乎一致。在核桃葉枯病的發(fā)病初期，會從核桃葉片的邊緣位置開始發(fā)病，然后慢慢向葉子的中間階段靠攏。在發(fā)病初期，病原菌的侵入點周圍會出現(xiàn)褪綠色病斑，病斑近似于圓形，然后核桃葉組織會開始壞死，進而轉(zhuǎn)變成黑褐色枯斑，還會出現(xiàn)同心輪紋。在核桃葉枯病的發(fā)病后期，核桃葉子就已經(jīng)變黃、變枯焦，會在葉子的葉面上出現(xiàn)墨綠色霉層，也就是鏈格孢菌的分生孢子和孢子梗。

有關(guān)記載顯示，世界上最早發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌能夠造成核桃葉枯病病害是在20世紀(jì)意大利的一家果園內(nèi)，這家果園中的核桃葉子表現(xiàn)出了圓形的病斑癥狀，同時帶有壞死斑和帶黑暗色的同心環(huán)組織，隨后病變的壞死部位會繼續(xù)蔓延到整個核桃葉片的一半。而阿克蘇地區(qū)核桃生產(chǎn)園中的鏈格孢菌核桃葉枯病發(fā)病癥狀同意大利果園核桃葉片的發(fā)病癥狀是一致的，說明核桃葉枯病的致病病原菌都是鏈格孢菌。所以，今后阿克蘇地區(qū)在核桃種植中要特別注意對鏈格孢菌核桃葉枯病病害的防治。

參考文獻(xiàn)

[1]朱紅祥，溫黎軍，盧海燕，等.新疆阿克蘇核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題及解決措施[J].果樹實用技術(shù)與信息，2017（4）：38-40.

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[3]劉正興，孫衛(wèi)中，張新浩，等.阿克蘇地區(qū)核桃腐爛病發(fā)生規(guī)律及防控技術(shù)[J].農(nóng)村科技，2015（3）：56.

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[5]朱紅祥.新疆阿克蘇早實核桃初果期樹修剪及肥水管理技術(shù)[J].果樹實用技術(shù)與信息，2014（4）：20.

[6]溫黎軍，朱紅祥.新疆阿克蘇核桃采后無公害處理技術(shù)[J].果樹實用技術(shù)與信息，2014（1）：39-40.