一氧化氮在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展

姚曉宇 綜述，劉風(fēng)玲審閱

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊050000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是目前常見的消化道惡性腫瘤之一。據(jù)2017年公布的數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均居所有腫瘤的第3位[1]。CRC發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素包括散發(fā)性CRC家族史、發(fā)病年齡較早、缺乏體力活動(dòng)、飲食改變、久坐的生活方式以及腫瘤發(fā)生前的慢性炎癥等。其中，炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn disease，CD）被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的高危因素[2]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是神經(jīng)元釋放的血管活性因子，也可由胃腸、腦、心、肝、腎等臟器的組織細(xì)胞產(chǎn)生，可以松弛血管平滑肌抑制其細(xì)胞增殖，改善血管緊張度，調(diào)節(jié)血流，抑制血小板的聚集和白細(xì)胞的激活，達(dá)到舒張血管的作用[3]。有研究證實(shí)，NO作為一種炎性介質(zhì)，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮重要作用[4]。其可能的作用機(jī)制包括DNA直接損傷、DNA合成抑制以及抑制限速酶核糖核苷酸還原酶[5]。本文將總結(jié)NO作為結(jié)直腸腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)研究進(jìn)展，以期為結(jié)直腸癌的診斷、治療提供新思路。

1 NO與炎癥

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子如病原體、受損細(xì)胞或其他有害刺激物所發(fā)生的防御反應(yīng)，并且是涉及免疫細(xì)胞、血管和分子介質(zhì)的保護(hù)性應(yīng)答。Hofseth和Ying[6]通過研究證實(shí)慢性炎癥引起活化的炎性介質(zhì)產(chǎn)生，可釋放活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、溶解酶和細(xì)胞因子，這些炎性介質(zhì)通過破壞DNA或鄰近的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞來加劇炎性反應(yīng)。慢性炎癥還可以促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞增殖，破壞DNA修復(fù)途徑和細(xì)胞微環(huán)境，抑制細(xì)胞凋亡，并通過免疫抑制促進(jìn)血管生成[7]。最重要的是，慢性炎癥在分子水平上產(chǎn)生自由基和醛類發(fā)揮重要作用，該過程同時(shí)伴有有害的基因突變，腫瘤相關(guān)關(guān)鍵蛋白和炎性代謝物包括細(xì)胞因子、生長因子和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factorkappa B，NF-κB）的翻譯后修飾，控制癌基因（抑癌基因和致癌基因）的表達(dá)和炎癥關(guān)鍵酶[即誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）]的改變。

文獻(xiàn)證據(jù)表明，與CRC有關(guān)的炎性介質(zhì)包括NF-κB、Toll樣受體、ROS、RNS、COX、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、促炎和抗炎細(xì)胞因子、抗氧化酶、激酶、生長因子、腫瘤抑制蛋白p53、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）等[6]。NO是CRC發(fā)病機(jī)制中的重要生物標(biāo)志物之一，其在調(diào)節(jié)從結(jié)直腸腺瘤到結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移癌的發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[8]。Cross和Wilson[9]研究證實(shí)，iNOS表達(dá)的增加與抑制NO的產(chǎn)生導(dǎo)致CRC的改善。炎癥促進(jìn)NO產(chǎn)生的分子機(jī)制包括氧化性DNA損傷，基因突變以及炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、缺氧誘導(dǎo)型干擾素-α、NF-κB和腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等的生成增多，誘導(dǎo)iNOS，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[10]。另外，NO可以為浸潤腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞提供生物活性分子，通過促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和促進(jìn)其他致癌途徑如基因組不穩(wěn)定性、能量代謝重編程和免疫逃逸的發(fā)生來增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

2 NO與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡也稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞自我破壞的過程，在生物的發(fā)生、分化以及穩(wěn)態(tài)平衡中具有重要的作用[11]。細(xì)胞凋亡的機(jī)制極為復(fù)雜，除了涉及如凋亡因子、受體、適配蛋白、啟動(dòng)蛋白、效應(yīng)蛋白、抑制蛋白等多種蛋白的相互作用外，還涉及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）。Mori[12]報(bào)道，NO引起ER應(yīng)激，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CAAT/enhancer binding proteins homologous protein，CAAT/CHOP）表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。Kuschak等[13]的研究表明，COX-2在腸上皮細(xì)胞中的過表達(dá)導(dǎo)致其表型改變，其可能通過改變乙酰氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9）、乙酰氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）和聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）的活性來激活不同的分子通路如 p53、Fas、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和激活凋亡細(xì)胞表面特定的感應(yīng)器即死亡受體，將DNA降解為核小體片段，來發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而增強(qiáng)CRC腫瘤細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移的能力。Brüne等[14]報(bào)道了NO促凋亡途徑與復(fù)雜的信號(hào)通路并存，其通過線粒體依賴途徑、抑癌基因p53的參與、細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá)以及S-亞硝基化阻斷半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，也有研究證實(shí)了NO在增加Fas表達(dá)中的作用，而Fas表達(dá)的增加也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。關(guān)于細(xì)胞色素C釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，目前有一種假說是B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白形成通道，調(diào)控細(xì)胞色素C釋放。Yazbeck等[16]證實(shí)NO可以通過釋放細(xì)胞色素C和線粒體中的其他因子產(chǎn)生環(huán)磷 酸 鳥 苷（cyclicguanosinemonophosphate，cGMP），從而影響B(tài)cl-2蛋白家族的許多成員包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)。NO作為促凋亡調(diào)節(jié)劑，將線粒體中的細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)中，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，上調(diào)p53以及凋亡相關(guān)蛋白（包括Bcl-2家族）的表達(dá)。Mori[12]證實(shí)過量的NO引起細(xì)胞凋亡，而低濃度的NO可以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。低濃度的NO可以通過抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放、神經(jīng)酰胺產(chǎn)生和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化來發(fā)揮抗凋亡作用，其抗凋亡機(jī)制可分為cGMP依賴性機(jī)制和非cGMP依賴性機(jī)制兩種[15]。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，Park等[17]證實(shí)通過NO供體S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（S-Nitroso-N-acetylpenicillamine，SNAP）或轉(zhuǎn)染神經(jīng)元NOS產(chǎn)生的NO，通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放、caspase 3和caspase 9的激活以及DNA的片段化，促進(jìn)6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamin，6-OHDA）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。Snyder等[18]證實(shí)NO能夠抑制線粒體電子傳遞鏈，導(dǎo)致超氧化物的產(chǎn)生和過氧化亞硝酸鹽形成的增加，同時(shí)清除ROS或過亞硝酸鹽。

3 NO與血管生成

腫瘤生長具有明確的血管依賴性，腫瘤通過新生血管從宿主獲取營養(yǎng)成分，又經(jīng)過血管向宿主輸送腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤灶的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力[19]。可見，血管生成在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)，NO通過調(diào)節(jié)各種基因和轉(zhuǎn)錄因子使平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生cGMP，同時(shí)抑制血管收縮肽內(nèi)皮素-1和去甲腎上腺素從交感神經(jīng)末端釋放，通過血管張力（舒張血管）、血管重塑（抑制平滑肌細(xì)胞增殖）和血管細(xì)胞間相互作用（抑制血小板黏附和聚集、抑制單核細(xì)胞黏附）等各種機(jī)制達(dá)到促進(jìn)血管調(diào)節(jié)的目的。Bing等[20]證實(shí)，血管內(nèi)皮生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和類花生酸物質(zhì)（eicosanoids）可以調(diào)節(jié)血管生成，而成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）在血管生成的早期階段及異常血管表型的誘導(dǎo)中起主要作用。NO介導(dǎo)許多血管生成因子的功能，如VEGF、1-磷酸鞘氨醇、血管生成素、雌激素，通過與磷脂酶鈣調(diào)蛋白結(jié)合和磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）誘導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）磷酸化激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）[21]。NO可刺激表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)通路以及抑癌基因p53和VEGF，這些介質(zhì)是通過內(nèi)皮細(xì)胞中CD93蛋白表皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）樣域上調(diào)eNOS而加劇血管生成的。NO的不斷生成可以選擇在突變型p53細(xì)胞中進(jìn)行，并通過上調(diào)VEGF來促進(jìn)腫瘤血管生成。此外，NO可通過EGFR/PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)p53、PARP和DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）來調(diào)控腫瘤DNA的修復(fù)機(jī)制。iNOS通過激活受體酪氨酸激酶和蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)VEGF表達(dá)，調(diào)控微血管密度、腫瘤血管生成，及腫瘤的侵襲、生長和進(jìn)展，在誘導(dǎo)血管和淋巴管生成中發(fā)揮巨大作用。iNOS上調(diào)導(dǎo)致NO表達(dá)也在增加，伴隨調(diào)節(jié)血管的COX-2、血管生成素樣蛋白（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）的表達(dá)以及整聯(lián)蛋白/JAK/STAT3途徑的通透性增加。COX-2通路和5-脂加氧酶（5-lipoxygenase，5-LOX）通路可能代表一種整合系統(tǒng)，COX-2/5-LOX從正常黏膜、腺瘤到結(jié)腸癌的表達(dá)具有遞增趨勢，COX-2/5-LOX參與了結(jié)直腸癌的形成過程，并在從結(jié)腸腺瘤進(jìn)展至結(jié)腸癌的發(fā)展過程中起到了一定的促進(jìn)作用，且參與了結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[22-23]。Tavolari等[24]證實(shí)了5-LOX及其產(chǎn)物，特別是白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）在結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮巨大作用，而COX-2的出現(xiàn)使5-LOX的表達(dá)和活性在結(jié)腸癌腫瘤大小、浸潤深度和血管浸潤組織的發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)上調(diào)。另有一項(xiàng)結(jié)腸癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究表明，使用COX-2/5-LOX抑制劑后，可使COX-2/5-LOX mRNA、蛋白及下游產(chǎn)物PGE2/LTB4的表達(dá)減少，當(dāng)單一使用較高的COX-2抑制劑后，可增加5-LOX分流，減弱COX-2抑制對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)性影響[25]。

4 NO與結(jié)CRC

在結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制中，“結(jié)腸腺瘤到結(jié)腸癌”的序列進(jìn)展過程被人們公認(rèn)[26-27]。其中花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝通路在結(jié)直腸癌的形成與發(fā)展中起著重要作用[23]。未酯化的花生酸主要有兩類重要的酶代謝：環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）和脂加氧酶（lipoxygenase，LOX）。Janakiram和Rao[28]發(fā)現(xiàn)COX和LOX途徑及持續(xù)存在的炎性細(xì)胞參與促炎性脂質(zhì)介質(zhì)和基因反應(yīng)，產(chǎn)生有利的腫瘤微環(huán)境，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移。其中，NO可以通過為浸潤腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞提供生物活性分子來增加CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，細(xì)胞外基質(zhì)修飾酶如基質(zhì)金屬蛋白酶就是這類生物活性分子中的一種，它的作用是促進(jìn)EMT和促進(jìn)其他致癌途徑如基因組不穩(wěn)定性、能量代謝重編程和免疫逃逸的發(fā)生。COX-2也可作為一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素增加CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。COX-2過氧化物酶活性實(shí)際可以將許多物質(zhì)最終轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)，進(jìn)而能夠激活許多參與細(xì)胞增殖的基因。Ihara等[29]通過研究證實(shí)NO在調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)和活性進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用。COX2也是前列腺素合成的誘導(dǎo)型介質(zhì)，其代謝產(chǎn)物前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）也可增加CRC腫瘤細(xì)胞的增殖活性和轉(zhuǎn)移潛能，促進(jìn)腫瘤血管生成，誘導(dǎo)局部免疫抑制，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。

NO促進(jìn)CRC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用可能涉及的機(jī)制還包括直接的DNA和蛋白質(zhì)損傷或抑制程序性細(xì)胞死亡，從而促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。NO可以通過VEGF-C的參與而上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix matalloproteinases-2，MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix matalloproteinases-9，MMP-9）以及下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）的表達(dá)，從而在促進(jìn)淋巴管生成和擴(kuò)散到淋巴結(jié)中起到重要作用[30]。在CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中，正常上皮細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞[31]。NO還會(huì)損害MMP的調(diào)節(jié)，這對(duì)控制基質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[32]。NO還可以促進(jìn)DNA損傷并抑制DNA修復(fù)機(jī)制，從而發(fā)生DNA鏈斷裂和DNA突變引起遺傳毒性效應(yīng)。在臨床上，楊鋼等[33]通過檢測CRC患者治療前后NO水平變化發(fā)現(xiàn)，血清中TNF-α、NO、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）濃度與CRC密切相關(guān)，對(duì)TNF-α、NO、IL-1β、IL-6濃度進(jìn)行聯(lián)合診斷可作為CRC早期診斷的參考指標(biāo)。田雅軍等[34]通過研究發(fā)現(xiàn)，與健康體檢人群相比，CRC患者血清中NO高表達(dá)，表明其與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，NO檢測可作為判斷CRC發(fā)生、分期及復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)。

既往研究結(jié)果證實(shí)，NO對(duì)于CRC的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。彭金娥和潘敬新[35]則指出，機(jī)體中低濃度的NO促進(jìn)腫瘤內(nèi)部血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管重建以形成新生血管，增加血管通透性和腫瘤內(nèi)血流量，在維持腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中起著重要作用，但是NO濃度升高不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而且還能通過活化巨噬細(xì)胞從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

5 小結(jié)

CRC是全球發(fā)病率較高的疾病之一。NO在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。一方面，已有研究表明，慢性炎癥是CRC發(fā)生發(fā)展的高危因素，在各種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的作用下，NO通過為浸潤腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞提供生物活性分子、抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤血管生成來增加CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。NO在調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)和活性進(jìn)而促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移的過程中也發(fā)揮著重要作用。另一方面，NO通過許多上游信號(hào)和具有遺傳改變的下游效應(yīng)因子之間的串?dāng)_誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抑癌作用。通過對(duì)NO的研究，有可能為CRC的產(chǎn)生以及預(yù)后作用提供有益幫助。