茜草，茜草炭對血瘀大鼠肺組織中SOD、MDA、NO、NOS的影響

王侃

摘要：目的通過SOD、MDA、NO、NOS指標評價茜草、茜草炭對急性血瘀大鼠肺組織的影響。方法以SD大鼠為研究對象，測定其SOD、MDA、NO、NOS四項指標觀察茜草生、茜草炭對血瘀大鼠肺組織的影響。結果模型組比空白組MDA上升，SOD下降，有統計學意義。茜草組與模型組比較MDA下降，SOD活性上升。茜草炭與模型組比較MDA上升，SOD無統計學意義。模型組與空白組比較NO、TNOS、cNOS含量均減少，且有統計學意義。茜草組與模型組比較NO、TNOS、cNOS含量均增加。茜草炭組NO含量有一定的減少，TNOS、iNOS含量有一定程度的增加，但其程度不如生品。

關鍵詞：茜草；茜草炭；肺組織

茜草系茜草科植物茜草（Rubiacordifolia L.）的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》[1]。其味苦，性寒，無毒。主寒濕風，痹，黃疸，補中，止血，內崩，下血，膀胱不足，踒跌，蠱毒。久服益精氣輕身。可以絳染。一名地血，一名茹藘，一名茅蒐，一名蒨。生喬山川古。二月、三月采根，曝干。畏鼠姑[2]。

現臨床茜草常用于治療慢性肺出血，咳嗽出血。急性血瘀模型大鼠肺部出血癥狀明顯[3]，所以本實驗復制大鼠急性血瘀模型。用以評價茜草生品、炭品對急性血瘀大鼠凝血機制的異同。

由前期肺組織顯微觀察可知急性血瘀的模型大鼠肺組織損傷嚴重，給藥組對肺組織修復的側重點不同，炭品主要減輕出血癥狀，生品主要修復肺組織結構，減少炎癥細胞。為了探討急性血瘀大鼠是否是由于氧化-抗氧化系統平衡失調引起的肺部損傷及進一步探討茜草、茜草炭在治療血瘀癥時的差異。設計實驗從大鼠肺組織的MDA/SOD水平及NO，NOS水平來探討茜草的生熟異用。

1 材料

1.1動物

SD大鼠50只，雌性，體重200-240g，購自浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 藥品與試劑

SOD、MDA、NO、NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所），枸櫞酸鈉（天津市科密歐化學試劑開發中心，批號：20051005），鹽酸腎上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號：1009041）。云南白藥（云南白藥集團股份有限公司生產，批號：20090116），藥材均購自于安徽銅陵藥材有限公司。

1.3 儀器

Anke-LXJ-11B 離心機（上海安壽科學儀器廠）、酶標儀（美國Bio-Tek公司）

1.4供試液的制備

空白對照組0.5%CMC-Na溶液。

陽性對照組（云南白藥組）因云南白藥臨床用量為2g，實驗動物按臨床用量20倍給藥，即0.227g/kg。實驗前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將云南白藥混勻并稀釋至所需濃度。

茜草生品組購于安徽銅陵（批號100326），經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根及根莖。參照其臨床用量10g，實驗動物按臨床用量20倍給藥，即5g生藥/kg。取適量茜草生品，適當粉碎后過200目篩。取適量粉末，加入0.5%CMC-Na研磨均勻，并配制成所需濃度。

茜草炭則是將所購生品按2010年版《中國藥典》一部茜草炭炮制方法炒至表面焦褐色，內部焦黃色的自制炭品。參照其臨床用量10g，實驗動物按臨床用量20倍給藥，即5g生藥/kg。取適量茜草生品，適當粉碎后過200目篩。取適量粉末，加入0.5%CMC-Na 研磨均勻，并配制成所需濃度。

1.5數據統計和處理方法

采用SPSS16.0統計軟件進行檢驗，實驗數據以x±s表示。方差齊時選擇t檢驗結果，方差不齊時選擇校正t檢驗結果，以此比較模型組與各給藥組之間的顯著性差異。

2實驗方法

2.1樣品制備

取大鼠50只，雌性，體重220（±20）g，隨機分為7組，分別為空白組，模型組，云南白藥組0.27g/kg、茜草生品組5g/kg、茜草炭品組5g/kg，每組10只。正常組與模型組ig0.5%羧甲基纖維素鈉溶液2mL·100g-1，其余組ig等體積的相應藥物，每日1次，連續7d。第6d給藥后禁食，除空白組外，其余組背部sc鹽酸腎上腺素1mL·kg-1，共2次，中間間隔4h，并在第1次sc4h后將大鼠浸入0～2℃冰水冰浴5min，復制急性血瘀大鼠模型[1]，正常組sc等體積的生理鹽水。將其處死，進行解剖取下肺，按照重量/體積比例加入9倍的0.9%生理鹽水制成肺組織勻漿，低溫低速離心10 min（3000r/min），取上清液，-20℃保存待測生化指標。

2.2肺組織SOD、MDA、NO、NOS合酶的含量測定[4]

2.2.1組織蛋白含量

測定原理：蛋白質具有-NH3+基團，當考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標準或樣品中，考馬斯亮蘭上的陰離子與蛋白-NH3+結合，用酶標儀測定其含量。

2.2.2 SOD活血測定：

測試原理：通過黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶的反應產生超氧化陰離子自由基（O2-），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現出紫紅色，通過酶標儀測其吸光度。通過公式計算出SOD活性。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測定方法測定。測定結果見表1

計算公式：

2.2.3 MDA活性測定

測試原理：過氧化脂降解產物中的MDA可以硫代巴比妥酸縮合，形成紅色的產物，經酶標儀在532nm下測定。通過公式計算出MDA活性。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測定方法測定。測定結果見表1。endprint

計算公式：

2.2.4 NO含量的測定

測試原理：NO化學性質活潑，在體內迅速代謝轉變為NO2-和NO3-，而NO2-又進一步轉化為NO3-。利用硝酸還原酶特異性的將NO3-還原成NO2-，根據顯色原理通過酶標儀測定吸光度以測定濃度。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測定方法測定。測定結果見表2。

計算公式：

2.2.5 NOS活性測定

測定原理：NOS可以催化L-Arg和分子氧反應生成NO，NO與親和性物質反應生成在530nm下顯色的化合物，用酶標儀測定NOS活力。

試劑配制及操作步驟：所有試劑均按照試劑盒說明書配制，方法按照說明書上都提供組織樣本的測定方法測定。測定結果見表2。

計算公式：

2.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行檢驗，實驗數據以x±s表示。方差齊時選擇t檢驗結果，方差不齊時選擇校正t檢驗結果，以此比較模型組與各給藥組之間的顯著性差異。

3實驗結果

3.1 大鼠肺組織中MDA、SOD的變化。

結果顯示模型組比空白組MDA上升，SOD下降，有統計學意義。茜草組與模型組比較MDA下降，SOD活性上升。茜草炭與模型組比較MDA上升，SOD無統計學意義。

注：與模型組比較，*p<0.05

3.2 大鼠肺組織中NOS、NO的變化

模型組與空白組比較NO、TNOS、cNOS含量均減少，且有統計學意義。茜草組與模型組比較NO、TNOS、cNOS含量均增加。茜草炭組NO含量有一定的減少，TNOS、iNOS含量有一定程度的增加，但其程度不如生品。結果見表2。

注：與模型組比較，*p<0.05，

4討論

丙二醛（MDA）是機體通過酶系統與非酶系統產生的自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸所產生的一種脂質過氧化物。SOD是一種體內能夠清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護機體免受氧化損傷的一種酶。一氧化氮是（NO）在血液系統起著信使因子的作用。NO能夠維持血管張力的恒定與調節血壓穩定作用。當血液系統紊亂時NO的含量將會異常。體內NOS有結構型NOS（cNOS）和誘導型NOS（iNOS）2種。cNOS先天性存在，生成NO數量較少，產生迅速。iNOS在生理情況下基因不表達，當受到某些細胞因子、病原微生物或腫瘤細胞刺激后，即被激活，大量產生iNOS，且持續時間長。其中cNOS催化的NO肺組織粘膜有保護作用，而iNOS催化的NO機體有殺傷毒性及促炎作用[5]。

急性血瘀導致了肺組織發生了病變，模型組中SOD活性下降，MDA含量增加。說明氧自由基通過脂質過氧化反應參與了急性血瘀的發病過程。而茜草組急性血瘀大鼠肺組織中MDA含量降低，SOD活性升高，說明其能夠通過清除氧自由基，減少過氧化脂質生成。從而治療急性血瘀引起的肺組織損傷。模型組中NO含量降低，可能是由于組織中含氧水平較高，NO可和O2-反應生成生成ONOO-，對機體有毒害作用。而茜草組NO含量增加對血管起到擴張保護作用，從而化瘀。而由于茜草炭的肺組織中SOD處于較低水平，而MDA含量增加，推測此時機體類的氧含量仍處于較高水平，使得茜草炭品組NO含量降低。模型組與空白組相比誘導型iNOS含量增加，iNOS含量的增加可能是導致肺組織炎癥細胞浸潤的原因之一。茜草給藥組結構型cNOS含量增加，對肺組織粘膜有保護作用。

所以筆者認為茜草生品、炭品對機體的作用的機制有很大差異，并不能一味的認為當出血增多時茜草炭品便可替代生品應用于臨床。

參考文獻

[1]葉定江，原思通.中藥炮制學辭典[M].上海：上海科學技術出版社，2005.283-284

[2]宋·盧多遜.李昉等.開寶本草[M].安徽：安徽科學技術出版社，1998.178

[3]孔祥鵬.陳佩東.丁安偉.蒲黃與蒲黃炭對血瘀大鼠血液流變性及凝血時間的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（6）：143-145

[4]胡志偉.陳漪.張凱倫.曲格列酮對凝血酶誘導的內皮細胞誘導型一氧化氮合酶和吸附分子表達的抑制作用[J].中國循環雜志，2007，22（2）：142-145

[5]劉彤.吳亞光.邵軍.一氧化氮和內皮素在肝臟在灌注損傷和缺血預處理中的作用研究[J].醫學信息手術學分冊，2007，20（1）：53-55endprint