“腎主骨”機理研究
——左歸丸對Hepcidin、Fpn1及OPG/RANKL mRNA表達的影響?

吳佳瑩，李岳澤，劉 紅，李 艷，潘靜華，趙宏艷，王少君，汪文來，張治國，鞠大宏△，劉梅潔△

(1. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700； 2. 中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700)

【實驗研究】

“腎主骨”機理研究
——左歸丸對Hepcidin、Fpn1及OPG/RANKL mRNA表達的影響?

吳佳瑩1，李岳澤1，劉 紅2，李 艷2，潘靜華2，趙宏艷2，王少君2，汪文來1，張治國1，鞠大宏2△，劉梅潔2△

(1. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700； 2. 中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700)

目的： 從Hepcidin對其下游OPG/RANKL通路調節的角度，初步探討左歸丸對骨質疏松癥的作用機理，并為進一步揭示“腎主骨”理論的科學內涵提供實驗依據。 方法： 60只雌性SD大鼠按隨機數字表法分為空白對照組12只，假手術組12只，造模組36只共3組，造模組大鼠實行雙側卵巢切除術以制作骨質疏松癥模型。造模結束后再將造模組大鼠隨機分為OVX組、E2組、左歸丸組，每組各12只，開始給予相應藥物。給藥3個月后，檢測大鼠脛骨骨量(TBV%)、骨吸收(TRS%)和骨形成(TFS%、OSW、MAR、mAR)情況；采用原位雜交法檢測各組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA及脛骨骨髓中Fpn1、OPG及RANKL mRNA的表達。 結果： OVX組大鼠脛骨TBV%較假手術組顯著降低，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR較假手術組均有顯著增高；與OVX組比較，左歸丸組的TBV%顯著增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR水平明顯低于OVX組。與假手術組比較，OVX組大鼠肝臟中Hepcidin的mRNA表達強度均明顯降低，大鼠脛骨骨髓中Fpn1和RANKL mRNA表達強度則明顯增強，OPG mRNA的表達強度明顯降低。與OVX組比較，左歸丸組的大鼠肝組織中Hepcidin mRNA表達強度明顯增高，脛骨骨髓中OPG mRNA表達強度明顯增高，Fpn1和RANKL mRNA表達強度則明顯下調。結論： 左歸丸可通過提高Hepcidin水平，增加與受體Fpn1的結合，進而對下游OPG/RANKL信號通路起到一定的調節作用，使OPG表達上調而下調RANKL的表達，從而降低破骨細胞活性，減少骨量丟失，這是其能夠治療骨質疏松癥的機理之一。

左歸丸；骨質疏松癥；鐵調素；膜轉鐵蛋白；腎主骨

鐵調素(Hepcidin)是糾正體內“鐵過載”的關鍵物質。多項研究已證實，鐵過載是骨質疏松癥發生的危險因素。而Hepcidin與受體膜轉鐵蛋白(Fpn)結合，可調節鐵離子水平，維持機體鐵穩態，進而對骨代謝產生影響。OPG/RANKL則是非常重要的骨代謝調控通路，是體內細胞因子發揮作用、調節骨代謝的最終環節。我們前期工作證實，左歸丸可以治療去卵巢大鼠骨質疏松癥。本研究在前期工作基礎上[1]，從Hepcidin對其下游OPG/RANKL通路調節的角度，初步探討左歸丸對骨質疏松癥的作用機理，為進一步揭示“腎主骨”理論的科學內涵提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

60只雌性SPF級SD大鼠，體質量(240±20) g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心(許可證編號SCXK-(軍)2012-0004)，飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所清潔級實驗動物室(實驗動物室許可證號SYXK(京)2010-0032)。

1.2 藥物

戊酸雌二醇片1 mg/片(批號175A)，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司產品，使用時用純凈水配制成混懸液，濃度為0.018 mg/ml。左歸丸藥液常規水煎制，含藥量為0.968 g生藥/ml。藥物組成：熟地24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，鹿角膠12 g，菟絲子12 g，龜甲膠12 g，川牛膝9 g。中藥材均經中國中醫科學院中藥研究所胡世林研究員鑒定。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉：德國MERCK公司(批號20131206)，鹽酸四環素：北京索萊寶科技有限公司(批號1104B047)，Hepcidin原位雜交檢測試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號02161TW7032741507TEC)，Fpn1原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號02162TW7032741807TEC)，OPG原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號011590223-259060FJ)，RANKL原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號006381129-79060FJ)。

1.4 儀器

2040切片機：德國Reicheit-Jung公司， FINESSE ME+全自動石蠟切片機：美國Thermo公司，CRYOTOME FSE冰凍切片機：美國Thermo公司，Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統：德國Leica公司，DM6000B顯微鏡：德國Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 動物模型制作及分組給藥 60只SPF級雌性SD大鼠，按隨機數字表法分為造模組36只，空白對照組12只，假手術組12只3組。對造模組大鼠施以雙側卵巢切除(OVX)手術，制作骨質疏松癥模型。假手術組大鼠僅切除卵巢周圍脂肪組織，不摘除卵巢。造模完成后，將造模組大鼠隨機分成OVX組、E2組、左歸丸組。左歸丸組大鼠灌胃給予左歸丸水煎液，E2組大鼠灌胃給予戊酸雌二醇混懸液，空白對照組、假手術組和OVX組大鼠灌服等體積的純凈水，每日1次，每周給藥6 d，休息1 d，連續給藥3個月。

圖1 各組大鼠脛骨骨小梁分布情況 (甲苯胺藍染色)

各組大鼠于對骨組織進行熒光標記[2]：處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環素30 mg/kg體質量。給藥結束后，取左側脛骨制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態計量學指標的檢測；制作肝組織石蠟切片，檢測肝臟Hepcidin mRNA；取右側脛骨脫鈣，制作冰凍切片，檢測大鼠脛骨骨髓中Fpn1、OPG、RANKL 的mRNA表達。

1.5.2 指標檢測 (1)骨組織形態計量學指標檢測[3-6]：取大鼠左側脛骨進行塑料包埋，使用2040切片機縱向切取5 μm不脫鈣骨切片制作2張，一張用甲苯胺藍染色，另一張直接進行熒光觀察。采用Leica Qwin V3圖像分析系統，對不脫鈣骨切片進行骨組織形態計量分析：①骨量檢測：測量骨小梁面積占被測骨髓腔總面積的百分比，即骨小梁面積百分比(TBV%)，這是衡量骨量水平的主要標志；②骨吸收情況檢測：測量不規則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，即骨小梁吸收表面百分比(TRS%)，據此判斷破骨細胞的活性；③骨形成情況檢測：骨小梁形成表面百分比(TFS%)：有成骨細胞被覆的類骨質表面占骨小梁表面的百分比；④類骨質平均寬度(OSW)：皮質內表面有成骨細胞被覆的類骨質平均寬度，反映皮質骨的成骨細胞活性；⑤骨小梁礦化率(MAR)：指骨小梁表面熒光雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數，可反映骨小梁礦化速度；⑥骨皮質礦化率(mAR)：皮質內表面熒光雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數，可反映皮質骨礦化速度。

(2)Hepcidin、Fpn1、OPG及RANKL mRNA表達的檢測：采用原位雜交法分別檢測各組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA及脛骨骨髓中Fpn1、OPG及RANKL mRNA的表達。結果判斷，陽性反應細胞呈棕黃色，用Leica-Qwin圖像分析系統進行檢測。隨機檢測5個高倍視野(×400)，計算每個視野內的積分光密度(IOD)，求其平均值作為mRNA表達強度。

2 結果

2.1 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠骨組織形態計量學指標的影響

2.1.1 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠脛骨TBV%的影響 圖1表1顯示，OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術組。E2組、左歸丸組大鼠脛骨TBV%較OVX組顯著增高，但仍顯著低于假手術組。

2.1.2 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠脛骨TRS %和TFS %的影響 表2顯示，與假手術組比較，OVX組大鼠脛骨TRS %和TFS %均顯著增高。E2組和左歸丸組的大鼠脛骨TRS %和TFS %均顯著低于OVX組，且E2組大鼠脛骨TFS %與假手術組比較差異無統計學意義；但左歸丸組大鼠的脛骨TRS %和TFS %以及E2組大鼠的TRS %仍明顯高于假手術組。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

注：與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較：△P<0.05，△△P<0.01(下同)

表2 各組大鼠脛骨TRS %和TFS %的變化

2.1.3 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠脛骨OSW、MAR和mAR的影響 表3顯示，OVX組大鼠的脛骨OSW、MAR、mAR均顯著高于假手術組。與OVX組比較，E2組和左歸丸組的大鼠脛骨OSW、MAR、mAR均顯著降低；E2組的上述指標與假手術組比較差異無統計學意義，但左歸丸組的OSW、MAR、mAR仍顯著高于假手術組。

表3 各組大鼠脛骨OSW、MAR、mAR的變化

2.2 Hepcidin、Fpn1、OPG及RANKL mRNA表達的檢測

2.2.1 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠肝組織中Hepcidin mRNA表達的影響 表4顯示，與假手術組比較，OVX組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA表達IOD顯著降低；與OVX組比較，E2組和左歸丸組的肝組織中Hepcidin mRNA表達IOD則明顯升高，但仍顯著低于假手術組。

表4 各組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA的變化

2.2.2 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達的影響 表5顯示，與假手術組比較，OVX組大鼠的脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達IOD顯著增高；與OVX組比較，E2、左歸丸組的Fpn1 mRNA表達IOD顯著降低，但仍明顯高于假手術組。

表5 各組大鼠脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達的變化

2.2.3 左歸丸對卵巢切除所致骨質疏松大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL mRNA表達的影響 表6顯示，與假手術組比較，OVX組大鼠的脛骨骨髓中OPG mRNA表達IOD顯著降低；與OVX組比較，E2組、左歸丸組的OPG mRNA表達陽性密度明顯增高，且E2組OPG mRNA表達IOD與假手術組比較差異無統計學意義；左歸丸組OPG mRNA表達IOD仍明顯低于假手術組。

與假手術組比較，OVX組大鼠脛骨骨髓中RANKL mRNA表達IOD顯著增高；與OVX組比較，E2組、左歸丸組RANKL mRNA表達的IOD均顯著下降，但仍高于假手術組。

表6 各組大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL mRNA表達的變化

3 討論

腎藏精，精生髓，髓為骨之養，髓充則骨堅有力，髓虛則骨脆易折。《素問·六節藏象論》云：“腎者……其充在骨。”由此可知，骨骼中的骨量多少與“腎”的虛實狀態緊密相關。左歸丸是補精益腎的代表方劑。本研究結果顯示，OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術組，而反映骨吸收情況的指標TRS%、反映骨形成情況的指標TFS%、OSW、MAR、mAR較假手術組均有顯著增高，說明卵巢切除可以導致大鼠骨量顯著降低，同時骨吸收與骨形成均明顯升高，即形成高轉換型骨質疏松癥動物模型；與OVX組比較，左歸丸組的TBV%顯著增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR水平明顯低于OVX組，表明經左歸丸治療后可提高OVX大鼠的骨量，并降低過高的骨轉化率。這與我們以往的研究結果相一致[7-12]。

近年研究發現，鐵調素是維持鐵穩態、糾正 “鐵過載”的關鍵物質，而鐵過載是骨質疏松癥發生的危險因素[13-15]。Hepcidin由肝細胞合成后，通過血液調控鐵的分布與小腸對鐵的吸收。鐵調素水平下降，不能誘導其受體-膜轉鐵蛋白(Fpn)內陷降解，因此鐵離子不斷從細胞內輸出，釋放入血的鐵不斷增加，最終造成鐵過載；由于體內鐵水平的升高，成骨細胞分化受到抑制，功能降低，骨形成減少；同時破骨細胞活性增強、骨吸收增加、骨量減少，可導致骨質疏松癥。本研究檢測各組大鼠肝臟組織中Hepcidin mRNA的表達，以及大鼠脛骨骨髓中Hepcidin受體Fpn1 mRNA的表達，研究結果顯示，與假手術組比較OVX組大鼠肝臟中Hepcidin的mRNA表達強度均明顯降低，大鼠脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達強度則明顯增強。與OVX組比較，左歸丸組的大鼠肝臟Hepcidin mRNA表達強度明顯增高，骨髓中Fpn1表達強度則明顯下調，說明大鼠切除卵巢后，Hepcidin水平降低，其與受體Fpn1的結合受到抑制，而左歸丸可在一定程度上逆轉這一過程。

OPG/RANKL是非常重要的骨代謝調控通路，在破骨細胞生成、發育、激活等一系列過程中起至關重要的作用，是體內細胞因子發揮作用、調節骨代謝的最終環節。RANKL主要參與破骨細胞的分化和激活，OPG是RANKL的天然阻滯受體，可抑制破骨細胞活化，保護骨組織。以往的研究表明[16-18]，左歸丸對骨質疏松癥大鼠體內OPG、RANKL有調節作用。現有研究證實，鐵調素對OPG具有調節作用[19-20]。本研究結果顯示，OVX組大鼠脛骨OB和MSC中OPG mRNA的表達強度較假手術組明顯降低，RANKL mRNA的表達強度則明顯升高；與OVX組比較，左歸丸組的OPG mRNA表達強度明顯增高，RANKL mRNA的表達強度則明顯降低。這一結果說明，左歸丸對OPG/RANKL信號通路具有一定的調節作用，即上調OPG表達，同時下調RANKL的表達，最終使破骨細胞活性降低，骨吸收減少，以達到治療骨質疏松癥的作用。這可能是左歸丸的直接作用，也可能是通過調節Hepcidin水平而實現的。

綜上所述，大鼠去卵巢3個月后可成功復制經典的腎虛型骨質疏松癥模型。在腎虛狀態下，Hepcidin水平降低，骨髓細胞上的Fpn1內陷降解因而被抑制，使鐵離子過多轉運至細胞外，導致鐵過載，從而刺激破骨細胞的活性；其下游的OPG/RANKL信號通路亦被影響，其RANKL表達增加而OPG表達減少，促進破骨細胞的生成、分化和激活，最終導致破骨細胞異常活躍，骨量丟失加劇。而左歸丸一方面可通過提高Hepcidin水平，改善卵巢切除所致的鐵過載，進而對下游的OPG/RANKL信號通路起到一定的調節作用；另一方面，亦可直接作用于OPG/RANKL信號通路，上調OPG表達而下調RANKL的表達，最終使破骨細胞活性降低，減少骨量丟失，這是其能夠治療骨質疏松癥的機理之一。

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R285.5

B

1006-3250(2017)11-1548-04

國家自然科學基金資助項目(81473551)

吳佳瑩(1992-)，山西運城人，醫學碩士，從事中醫藥防治骨質疏松癥的基礎研究。

△通訊作者：鞠大宏(1963-)，遼寧鳳城人，研究員，博士研究生導師，從事中醫痹癥的臨床與基礎研究，Tel:13641386362,E-mail:judahong@126.com。

2017-04-11