雙氫青蒿素含藥血清抗血管生成活性的研究?

王 武，盛慶壽

(1.海南省中醫院肝病科，海口 570203; 2.廣西醫科大學研究生院，南寧 530021；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院肝病科，南寧 530011)

【方藥研究】

雙氫青蒿素含藥血清抗血管生成活性的研究?

王 武1，盛慶壽2△

(1.海南省中醫院肝病科，海口 570203; 2.廣西醫科大學研究生院，南寧 530021；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院肝病科，南寧 530011)

目的：研究不同劑量組雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移抑制作用和作用機制。方法：制備空白對照組、雙氫青蒿素15 mg/kg組、30 mg/kg組和60 mg/kg組4個劑量組含藥血清，以貝伐單抗為對照藥作用于人臍靜脈內皮細胞，噻唑藍法檢測細胞增殖，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，RT-qPCR法檢測細胞VEGF表達，放射配體受體結合分析法檢測細胞VEGFR最大結合容量和解離常數。結果：相對于空白對照組，雙氫青蒿素30 mg/kg組和60 mg/kg組可明顯抑制人臍靜脈內皮細胞增殖且能降低細胞的遷移能力；RT-qPCR結果顯示，這2個劑量組的VEGF表達出現明顯降低；VEGFR最大結合容量出現明顯降低，解離常數明顯升高，結果均具有顯著性意義。結論：30 mg/kg劑量以上的雙氫青蒿素含藥血清可顯著抑制人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移，作用機制可能與抑制血管內皮生長因子表達并阻斷其與受體的結合相關。

雙氫青蒿素；人臍靜脈內皮細胞；增殖；遷移；血管內皮生長因子

青蒿素是我國科研人員首次從黃花蒿中提取的有效抗瘧成分，為一種生物堿蓓半萜內酯化合物，當前合成了多種青蒿素衍生物包括雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等。臨床上廣泛用于各類瘧疾的治療，具有低毒、高效、廉價的優點。近年研究發現，除外其抗瘧活性，青蒿素類藥物在抗腫瘤方面發現具有巨大價值[1-2]。筆者在前期研究中也發現，雙氫青蒿素可抑制原發性肝癌大鼠的腫瘤生長，改善肝功能，延長大鼠生存時間[3]。體外實驗則發現，雙氫青蒿素可抑制肝癌細胞增殖活性，對細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達也表現出明顯抑制作用[4]，提示雙氫青蒿素的抗肝癌機制可能與其抑制腫瘤血管生成作用有關。為進一步驗證雙氫青蒿素的抗血管生成作用，本研究設計了雙氫青蒿素含藥血清對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的活性抑制實驗，并進一步檢測細胞的VEGF表達和VEGF/VEGFR結合力變化，為雙氫青蒿素的抗肝癌機制提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

圖1顯示，雙氫青蒿素由廣西中醫藥大學基礎醫學院農慧博士饋贈，粉劑，質量分數99.5%，批號070711，鑒定人林海,雙氫青蒿素在溶液中以α和β 2種異構體存在，形成α峰和β峰)。使用時以5%羧甲基纖維素鈉按所需濃度混勻，4 ℃保存；貝伐珠單抗注射液100 mg/4ml/支，美國羅氏公司(商品名：安維汀，批號N3539)。

圖1 雙氫青蒿素樣品液相圖譜注：1. α峰；2. β峰

1.2 細胞與動物

人臍靜脈內皮細胞(自中國科學院細胞庫購買)、SPF級雄性SD大鼠20只，6周齡，體質量均≥200 g，購于廣西醫科大學實驗動物中心(許可證號SCXK桂2003-0003)。大鼠飼養于廣西中醫藥大學實驗動物中心(SPF級)，飼養環境12 h采光，12 h黑暗，恒溫24 ℃，相對濕度50%～60%。實驗過程嚴格遵守動物實驗室有關條例。

1.3 試劑

引物合成(VEGF上游引物：5’-CATGTACGAACCGCCAG-3’，下游引物: 5’-TTGGCTGTTTGGTCATTGGC-3’，由上海拜力生物公司合成)；逆轉錄試劑盒(美國invitrogen 公司，批號31245)；SYBR Green試劑盒(美國羅氏公司，批號Z587690)；重組人VEGF165(美國PeproTech公司，批號GZ654565)；125IVEGF試劑盒(美國perkinelmer公司，批號1000551)；內皮細胞培養基(美國Scien Cell公司，批號3145905)。

1.4 儀器

酶標儀(美國伯樂公司 680型)，熒光定量PCR儀(ABI7500型)，液體閃爍測量儀(西安262廠，FJ-2105p)。

1.5 方法

1.5.1 雙氫青蒿素含藥血清制備 將20只SD大鼠隨機分為空白對照組和雙氫青蒿素15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg劑量組4組各5只，雙氫青蒿素各劑量組的大鼠分別按照相應藥物濃度灌胃。空白對照組給予等體積生理鹽水，連續7 d，于末次灌胃2 h后腹主動脈取血，離心分離血清，滅活、過濾除菌后置于-80 ℃冰箱備用。

1.5.2 人臍靜脈內皮細胞體外培養和藥物干預 HUVEC在含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中培養，分空白對照組、陽性對照組、雙氫青蒿素15 mg/kg、30 mg/kg和60 mg/kg劑量組。貼壁后換成5%血清培養4 h，雙氫青蒿素各組換用10%雙氫青蒿素含藥血清，空白對照組和陽性對照組換用10%小牛血清，陽性對照組另加入10 mg/L濃度貝伐單抗溶液繼續培養。

1.5.3 MTT(噻唑藍)法檢測細胞增殖 細胞接種于96孔板中，接種濃度2×104個/ml，每孔加入100 μL，設5個復孔，余步驟同上。分別培養24、48、72 h后，每孔加入5 μL MTT，搖勻后再孵育4 h；吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜 200 μL，振蕩器震蕩10 min；酶標儀設置490 nm波長，檢測吸光度(A值)，以計算細胞抑制率。抑制率=[(對照組A490-空白A490)-(藥物處理組A490-空白組A490)]/(對照組A490-空白A490)。

1.5.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 6孔板先以記號筆在底部做“井”字形標記。細胞接種于6孔板中，接種濃度1.2×106個/ml，每孔加入2 ml。細胞密度達到80%時，以200 μL槍頭在標記處做直線劃痕；分別更換含貝伐單抗和各劑量雙氫青蒿素的培養液后，繼續培養至24 h；分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度變化并拍照記錄。

1.5.5 RT-qPCR法檢測細胞的血管內皮生長因子mRNA表達 細胞接種于6孔板中，接種濃度1.2×106個/ml，每孔加入2 ml，設5個復孔，余步驟同上。培養48 h后PBS洗滌2次，以TRIZOL法提取總RNA，PCR擴增采用SYBR Green法。反應條件：預變性95 ℃ 3min(1循環)，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s(40循環)。擴增結束獲取溶解曲線和擴增曲線進行定量分析，得到ΔΔCT值(comparative ct method od quantitation)，應用2-ΔΔCT法進行數據統計分析。

1.5.6 放射配體受體結合分析法檢測細胞的血管內皮生長因子受體最大結合容量和解離常數 參考文獻[5]，取藥物干預后的各組細胞，以結合緩沖液將細胞密度調整至6×105個/ml,分別添加150 μm細胞懸液至1～24號檢測管后PBS浸泡過夜。采用復管法，1～16號管分別按50、80、100、150、200、350、500、700 pmol/L加入VEGF165；17～24號管分別按50、100、350、700 pmol/L加入VEGF165后，再加入100倍量的非標記VEGF，記為非特異結合管。各管中加入結合緩沖液至總體積300 μm，置于4 ℃冰箱，孵育3 h。加入1 ml pbs終止反應，離心棄上清，再以PBS洗3次，置入γ計數器中檢測放射性。以總結合減去對應濃度點非特異性結合得出特異性結合的cpm值，再經BRA數據分析軟件處理后獲得受體最大結合容量(Bmax)和解離常數(Kd)。Bmax為配體與受體最大結合容量，目的基因表達增強時可檢測到更高Bmax值；Kd值提示受體配體親和力，Kd值越小表示最大效應所需配體濃度越低則親和力越大，最后繪制飽和曲線并進行scatchard繪圖。

2 結果

2.1 雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞抑制率的影響

表1顯示，經藥物干預后同空白對照組比較，雙氫青蒿素15 mg/kg組和30 mg/kg組的樣本細胞增殖明顯受到抑制(P<0.01，P<0.01)，且隨藥物干預時間的延長其抑制率也逐步提高，雙氫青蒿素15 mg/kg組的抑制作用則不明顯(P>0.05)。

表1 雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞增殖抑制率的影響

注：與空白對照組比較：**P<0.01

2.2 雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞遷移能力的影響

圖2顯示，劃痕實驗結果顯示，經藥物干預24 h后，相對于空白對照組，雙氫青蒿素30 mg/kg組、60 mg/kg組和陽性對照組的劃痕寬度明顯增寬，提示藥物對細胞的遷移能力起到明顯的抑制作用；雙氫青蒿素低劑量組的劃痕寬度相對于空白對照組變化不大。

圖2 雙氫青蒿素干預后細胞遷移能力變化

2.3 雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞血管內皮生長因子mRNA表達的影響

表2顯示，雙氫青蒿素各個劑量組和陽性對照組的VEGF表達均顯著低于正常組(P<0.05)，表明藥物對VEGF表達確實起到抑制作用。

2.4 雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞血管內皮生長因子受體最大結合容量和解離常數的影響

表2圖3、4顯示,雙氫青蒿素30 mg/kg組、60 mg/kg組和陽性對照組的Bmax值較空白對照組明顯降低(P<0.01)，提示這3組樣本的VEGF表達出現明顯抑制，雙氫青蒿素15 mg/kg組的Bmax表達則沒有明顯變化(P>0.05)；4組樣本的Kd值較空白對照組均明顯升高(P<0.05)，提示經藥物處理后細胞的VEGF/VEGFR結合親和力下降。取雙氫青蒿素60 mg/kg劑量組繪制飽和曲線和scatchard 繪圖，飽和曲線可見特異性結合(specific binding,SB)和總結合(total binding,TB)呈典型的飽和趨勢，而非特異性結合(non-specific binding,NSB)則無飽和趨勢為直線圖。

表2 雙氫青蒿素對人臍靜脈內皮細胞VEGF mRNA表達和Bmax、Kd值的影響

注：與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖3 雙氫青蒿素60 mg/kg組的飽和曲線

圖4 雙氫青蒿素60 mg/kg組的scatchard分析

3 討論

腫瘤的血管生成一直被認為是腫瘤快速增長、浸潤、轉移的基礎[6]，通過抑制腫瘤血管生成而實現抑瘤活性也是當前多種抗癌靶向藥物的抑瘤機制[7]。血管生成過程中，內皮細胞活性是血管新生活躍的最關鍵因素，觀察血管內皮細胞藥物干預后的活性變化，對評估其抗血管生成作用有著重要意義。HUVEC具備人新生血管內皮的特點，并兼具原代獲取容易、體外培養代謝穩定等優點[8]，是科研最常用的血管內皮細胞。有研究發現，青蒿琥酯對HUVEC的遷移和小管形成可起到抑制作用[9]，作用機制與青蒿琥酯誘導的鐵依賴性活性氧產生、線粒體凋亡通路[10]以及增大細胞內Ca2+濃度[11]有關，這些研究提示青蒿素類藥物可能存在抗血管生成作用。

在前期實驗的基礎上，我們將其作用靶點定位于血管內皮生長因子及其受體。血管生成因子是一類由細胞分泌，可促進血管形成的肽類物質，其種類非常多，各種血管生成因子之間相互作用，共同主導新血管生成[12]。VEGF是其中一類作用最直接、特異質最強的血管生成因子，組織血管生成旺盛時可檢測到VEGF表達明顯增強[13]，是評估血管生成的重要檢測指標。VEGF與受體的結合是其發揮生物學特性的基礎，當血管生成被抑制時，不僅表現為VEGF自身表達下降，VEGF與受體的結合也會受到抑制[14]。目前VEGF受體發現有3種，即VEGFR-1(flt-1)、VEGFR-2(KDR/flk-1)和VEGFR-3(flt-4)，三者均屬酪氨酸激酶受體。VEGF通過與VEGFR的特異性結合發生自身磷酸化，并使VEGFR二聚體化而啟動信號傳導，通過促進基質金屬蛋白酶分泌，增強NO合酶表達等途徑，加速血管內皮細胞增殖和分化而調控血管新生[14-15]。故進一步對雙氫青蒿素干預HUVEC后其VEGF表達、VEGF/VEGFR親和力變化進行驗證，也能更好地支持雙氫青蒿素抑制血管生成理論。本次實驗結果顯示，經雙氫青蒿素干預后，RT-qPCR結果顯示，30 mg/kg和60 mg/kg組的雙氫青蒿素對HUVEC的VEGF表達明顯抑制。進一步用RBA法檢測VEGF表達與VEGF/VEGFR結合親和力變化，也發現適宜的雙氫青蒿素劑量不僅可明顯抑制VEGF表達，還能明顯降低VEGF與VEGFR的結合力。結合前期的雙氫青蒿素抗癌實驗提示，雙氫青蒿素的抗血管生成作用或許是其抗癌效應的其中一項機制。

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TheResearchonTheAnti-angiogenicActivityofDihydroartemisininContainedSerum

WANG Wu1, SHENG Qing-shou2△

(1.DepartmentofLiverDisease,HainanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Haikou570203,China；2.Guangximedicaluniversitygraduateschool，Nanning530021,China;3.DepartmentofLiverDisease,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530011,China)

Objective: To study the proliferation and migration ability impact of dihydroartemisinin of different dosage group on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and its mechanism. Methods:Prepared four dosage groups of drug serum, i.e. blank control group, dihydroartemisinin 15mg/kg group, dihydroartemisinin 30 mg/kg group and dihydroartemisinin 60 mg/kg group and then used them to HUVEC. Detected the cell proliferation with MTT method; The scratch test was used to analyze the cell migration ability; detected the VEGF expression with RT-qPCR method and detected VEGF receptors’ Bmax and dissociation constant with RBA method.Results: Compared with blank control group, the dihydroartemisinin 30 mg/kg group and dihydroartemisinin 60 mg/kg group obviously inhibited cell proliferation and reduce the ability of cell to migrate; RT-qPCR results show that the expression of dihydroartemisinin 30 mg/kg group and dihydroartemisinin 60 mg/kg group has significantly decrease; VEGF receptors Bmax in these two groups decreased clearly while the dissociation constant increased obviously. The results all have statistical significance.Conclusion: More than 30 mg/kg dose of dihydroartemisinin can remarkably inhibit HUVEC proliferation and migration ability. The inhibition mechanism may be related with the inhibition of VEGF and its function to block the combination with VEGFR.

Dihydroarteannuin; HUVEC; Proliferation; Migration; VEGF

廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA053115)-雙氫青蒿素介導VEGF/VEGFR信號通路調控肝癌血管生成的分子機制研究;廣西衛生廳課題(Z2013239)-雙氫青蒿素介導肝癌VEGF/VEGFR信號通路研究;八桂學者建設工程專項經費資助項目

王 武(1988-)，男，海南海口人，主治醫師，醫學碩士，從事急慢性肝病的中西醫結合臨床與研究。

△通訊作者：盛慶壽(1976-)，男，江西人，主任醫師，醫學博士，從事慢性肝病的臨床與研究，Tel：13707715487，E-mail:675249679@qq.com。

R289.5

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1006-3250(2017)11-1635-04

2017-03-23