miR-199a-3p抑制卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖侵襲能力及其機(jī)制

張麗娟,張旭力,王 娟,王 芳

miR-199a-3p抑制卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖侵襲能力及其機(jī)制

張麗娟,張旭力,王 娟,王 芳

目的探討miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。方法以卵巢癌SK0V3細(xì)胞系為研究對象，將進(jìn)入對數(shù)生長期的細(xì)胞按照生長情況分為miR-199a-3p過表達(dá)組、miR-199a-3p抑制組和對照組，觀察miR-199a-3p過表達(dá)和抑制效率及其對卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖、侵襲及c-Met、MMP-2和CD44蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果與對照組比較，miR-199a-3p過表達(dá)組SK0V3細(xì)胞中miR-199a-3p呈高表達(dá)狀態(tài)，且SK0V3細(xì)胞與細(xì)胞克隆數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)量、c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)水平均降低，而miR-199a-3p抑制組SK0V3細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)下降，SK0V3細(xì)胞與細(xì)胞克隆數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)量、c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論miR-199a-3p可能通過抑制c-Met、MMP-2和CD44蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響卵巢癌SK0V3細(xì)胞的侵襲和遷移，可能成為治療卵巢癌的新方法。

卵巢癌；miR-199a-3p；癌基因；細(xì)胞增殖；腫瘤浸潤

卵巢癌是女性癌癥死亡的第五大原因，5年生存率僅為30%，是最致命的婦科惡性腫瘤之一[1]。在卵巢癌傳播過程中，癌細(xì)胞漂浮在腹膜腔而不進(jìn)入血管，因此，缺氧可能導(dǎo)致癌細(xì)胞獲得更具侵襲性的惡性表型[2]，并通過腹膜表面轉(zhuǎn)移進(jìn)而侵襲其他器官。microRNA(miRNA)是最新發(fā)現(xiàn)的通過降解mRNA或翻譯抑制下調(diào)靶基因表達(dá)的一類非編碼短序列RNA。miRNAs作為癌基因或抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。有研究表明，缺氧可顯著下調(diào)卵巢癌細(xì)胞miR-199a-3p水平[4]。本研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲等方法，進(jìn)一步分析miR-199a-3p的過表達(dá)和抑制對卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，并探討其可能的分子作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下，為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SK0V3細(xì)胞為美國ATCC公司產(chǎn)品，置于RPMI 1640培養(yǎng)基中[10%特級胎牛血清(FBS)、0.1 mg/ml青霉素和1×105U/L硫酸鏈霉素，均來自美國GIBCO公司]，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、濕度95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞達(dá)90%～100%匯合時(shí)，予0.125%胰蛋白酶常規(guī)消化，按1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代。將進(jìn)入對數(shù)生長期的細(xì)胞按照生長情況分為miR-199a-3p過表達(dá)組、miR-199a-3p抑制組和對照組，全部細(xì)胞培養(yǎng)過程均在武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)中心完成。

1.2miRNA前體和抑制劑的轉(zhuǎn)染及鑒定 選取對數(shù)生長期的卵巢癌SK0V3細(xì)胞，以每孔2×105均勻接種于6孔板中，至生長匯合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度為100 nM的miR-199a-3p前體(Life Techonologies公司，批號PM11779)或濃度為200 nM的miR-199a-3p抑制物(Life Techonologies公司，批號AM11779)，用相應(yīng)濃度的熒光素標(biāo)記的無意義miRNA為對照組，轉(zhuǎn)染操作流程按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)液，使用D-Hank's液清洗。熒光顯微鏡(Olympus BX51)下觀察不同濃度轉(zhuǎn)染組的陽性細(xì)胞率，以確定有效的轉(zhuǎn)染濃度。miRNA前體和抑制劑的轉(zhuǎn)染效率用miRNA特異性實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定。

1.3RT-qPCR分析 miR-199a-3p的RT-qPCR應(yīng)用StepOnePlusReal-Time PCR System系統(tǒng)(Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA)，按Trizol試劑盒(美國GIBCO/BRL公司)說明書提取總RNA，并按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒說明書合成cDNA。應(yīng)用hsa-miR-199a-3p assay試劑盒(TaqMan，批號002304)檢測miR-199a-3p水平，以RNU6B作為內(nèi)參基因(TaqMan，批號001093)，相對定量PCR操作流程參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]。

1.4體外軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn) 按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于含有0.5%瓊脂糖的6孔板基底層中，過夜貼壁后待細(xì)胞生長到70%～80%匯合后，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miRNA模擬物前體和(或)抑制劑。10 d后在40倍顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑>100 μm的菌落。

1.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞用0.125%的胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，使用含1%牛血清蛋白(BSA)的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104細(xì)胞/ml。每組取300 μl細(xì)胞懸液加入Transwell中，37℃培養(yǎng)箱孵育，約24～48 h后終止實(shí)驗(yàn)，4%甲醛固定，結(jié)晶紫染色5 min，非侵入細(xì)胞用棉簽剔除。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)算每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)量。

1.6免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 免疫印跡法檢測c-Met蛋白表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參蛋白，在轉(zhuǎn)染成功培養(yǎng)72 h后收集卵巢癌SK0V3細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min，加入細(xì)胞勻漿液(50 mmol/L This-HCl pH=7.4，0.2 mmol/L PMSF，1%Triton X-100，1 mmol/L EDTA)，4℃下以12000 r/min離心10 min，取上清，上樣量為10 μl/well，使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白進(jìn)行分離，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h，加入Anti-c-Met多克隆抗體(Abcam，1∶800)、Anti- MMP-2(Abcam，1∶800)或Anti-CD44多克隆抗體(Abcam，1∶1000)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗鼠/兔IgG二抗常溫孵育1 h，再經(jīng)ECL孵育，暗室內(nèi)X線膠片成像，GelPro軟件進(jìn)行圖像分析。每組重復(fù)6次，結(jié)果取算數(shù)平均數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用單因素方差分析。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1miR-199a-3p過表達(dá)和抑制效率鑒定 與對照組比較，miR-199a-3p過表達(dá)組SK0V3細(xì)胞中miR-199a-3p呈高表達(dá)狀態(tài)，而miR-199a-3p抑制組SK0V3細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。提示本實(shí)驗(yàn)采用的miR-199a-3p過表達(dá)和抑制方法具有較高效率，完全可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1卵巢癌SK0V3細(xì)胞miR-199a-3p過表達(dá)和抑制效率鑒定

2.2miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖能力的影響 與對照組比較，miR-199a-3p過表達(dá)組SK0V3細(xì)胞與細(xì)胞克隆數(shù)量顯著減少，而miR-199a-3p抑制組SK0V3細(xì)胞與細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。提示miR-199a-3p的表達(dá)水平與SK0V3細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)。

圖2miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖能力的影響

2.3miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞侵襲能力的影響 與對照組比較，miR-199a-3p過表達(dá)組SK0V3細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而miR-199a-3p抑制組SK0V3細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。說明miR-199a-3p表達(dá)上調(diào)能顯著抑制SK0V3細(xì)胞侵襲能力，反之則促進(jìn)SK0V3細(xì)胞發(fā)生侵襲。

圖3miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞c-Met、MMP-2、CD44蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，miR-199a-3p過表達(dá)組SK0V3細(xì)胞c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)水平均顯著減少，而miR-199a-3p抑制組SK0V3細(xì)胞c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。說明miR-199a-3p表達(dá)上調(diào)能顯著抑制SK0V3細(xì)胞中c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)，反之則促進(jìn)c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)，推測miR-199a-3p可能通過影響c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表達(dá)而參與卵巢癌SK0V3細(xì)胞的生物學(xué)行為。

圖4miR-199a-3p對卵巢癌SK0V3細(xì)胞c-Met、MMP-2、CD44蛋白表達(dá)的影響

3 討論

相關(guān)研究表明，miRNA在癌癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是潛在的治療靶標(biāo)[6-8]。有研究證實(shí)，多種miRNA在卵巢癌中異常表達(dá)，可能涉及卵巢癌的啟動(dòng)和發(fā)展[9]。人基因組相關(guān)位點(diǎn)編碼的miR-199a-5p和miR-199a-3p前體，其中一種位于1號染色體(miR-199a-2, miRBase Accession MI0000281)，編碼dynamin 3；一種位于19號染色體(miR-199a-1, miRBase Accession MI0000242)，編碼dynamin 2[10]。miR-199a在人類不同的腫瘤中有不同的表達(dá)模式，并發(fā)揮著截然相反的作用，如胃癌患者miR-199a-3p表達(dá)上調(diào)，且與患者無進(jìn)展生存期相關(guān)[11]，而結(jié)直腸癌高表達(dá)miR-199a-3p可能與患者總存活率下降有關(guān)[12]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-199a-3p在骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌和乳頭狀甲狀腺癌中亦呈表達(dá)下調(diào)趨勢[13-14]。Minna等[15]研究證實(shí)，卵巢癌組織或細(xì)胞系miR-199a-5p的表達(dá)水平下調(diào)，其通過CD44蛋白抑制卵巢癌啟動(dòng)細(xì)胞的致瘤性和耐藥性[16]。

本研究探討miR-199a-3p在卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖、侵襲中的作用及其可能的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，miR-199a-3p過表達(dá)可顯著降低卵巢癌SK0V3細(xì)胞的增殖和侵襲能力，反之則提高卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，提示miR-199a-3p在卵巢癌SK0V3細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。

正常組織中c-Met蛋白表達(dá)非常低，但由于基因擴(kuò)增、活化突變、過表達(dá)二聚化及自分泌或旁分泌刺激機(jī)制，其在多種類型的腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)[17]。研究表明，抑制c-Met蛋白可減少卵巢癌細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]，且在多種癌細(xì)胞系中被確定為miR-199a-3p重要靶標(biāo)分子[19]。本文研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-199a-3p可顯著抑制c-Met蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的MMP-2和CD44蛋白的表達(dá)，提示miR-199a-3p可能通過調(diào)控c-Met、MMP-2和CD44蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響卵巢癌SK0V3細(xì)胞的增殖及侵襲能力。

綜上，以miR-199a-3p為靶點(diǎn)的干預(yù)治療有望成為抑制卵巢癌SK0V3細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法，值得臨床進(jìn)一步深入研究探討。

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InhibitionAbilityofmiR-199a-3pinProliferationandInvasionofSK0V3CellsinOvarialCancerandItsMechanism

ZHANG Li-juan1, ZHANG Xu-li2, WANG Juan3， WANG Fang4
(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Maternal and Child Health Hospital of Wuxue, Wuxue, Hubei 435400, China; 2. Department of Pharmacy, the First People's Hospital of Wuxue, Wuxue, Hubei 435400, China； 3. Department of Obstetrics Tumor, Cancer Hospital of Hubei Province, Wuhan 430079, China; 4. Molecular Biology Center, Medical College of Wuhan University, Wuhan 430079, China)

ObjectiveTo investigate effects of miR-199a-3p in proliferation and invasion of SK0V3 cells in ovarial cancer and its mechanisms.MethodsSK0V3 cell line of ovarial cancer were recruited in this study, and SK0V3 cells in logarithmic growth phase were divided into miR-199a-3p overexpression, miR-199a-3p inhibition group and control groups. The miR-199a-3p overexpression and inhibition rates, and its effects on proliferation and invasion of SK0V3 cells and Met, MMP-2 and CD44 protein expressions were observed.ResultsCompared with those in control group, in miR-199a-3p overexpression group, miR-199a-3p in SK0V3 cancer cells was over expressed, and numbers of SK0V3 cells, cell clone formation and invasion cells, expressions of c-Met, MMP-2 and CD44 of c-Met downstream proteins were significantly decreased; in miR-199a-3p inhibition group, miR-199a-3p expression in SK0V3 cancer cells was decreased, and numbers of SK0V3 cells, cell clone formation and invasion cells,protein expressions of c-Met, MMP-2 and CD44 of c-Met downstream proteins were significantly increased (P<0.05).ConclusionThet miR-199a-3p can affect invasion and transference of SK0V3 cells in ovarial cancer by inhibiting c-Met, MMP-2 and CD44 protein expressions, and therefore miR-199a-3p may be used as a potential target in treatment of ovarian cancer.

Ovarian cancer； miR-199a-3p； Oncogene；Cell proliferation； Neoplasm invasiveness

湖北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(QJX2010-401)

435400 湖北 武穴，武穴市婦幼保健院婦產(chǎn)科(張麗娟)；435400 湖北 武穴，武穴市第一人民醫(yī)院藥劑科(張旭力)；430079 武漢，湖北省腫瘤醫(yī)院婦瘤科(王娟)；430079 武漢，武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)中心(王芳)

張旭力，電話：13697141714；E-mail：13034480718@sina.com

R737.31

A

1002-3429(2017)12-0090-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.12.034

2017-08-21 修回時(shí)間：2017-09-29)