“上火”人群中Activin A、E-selectin的差異表達研究

汪琴靜 徐 莉 包 潔 季巾君 謝冠群 范永升

(1 浙江中醫藥大學附屬江南醫院中醫內科，杭州，311200； 2 浙江中醫藥大學基礎醫學院，杭州，310053)

“上火”人群中Activin A、E-selectin的差異表達研究

汪琴靜1徐 莉2包 潔2季巾君2謝冠群2范永升2

(1 浙江中醫藥大學附屬江南醫院中醫內科，杭州，311200； 2 浙江中醫藥大學基礎醫學院，杭州，310053)

目的：通過對“上火”人群中細胞因子激活素A(ActivinA)及E選擇素(E-selectin)血清含量的測定以及外周血單個核細胞基因表達水平檢測，探討激活素A及E選擇素在“上火”人群發病機制的影響和作用。方法：采集臨床患者血液樣本并提取血清及外周血單個核細胞。應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中激活素A及E選擇素的含量，應用RT-PCR法檢測激活素A及E選擇素的基因表達水平。結果：“上火”患者血清中activinA、E-selectin的水平以及外周血單個核細胞activinA、E-selectin基因表達水平高于正常平和質人群；觀察組外周血中activinA、E-selectin的基因表達水平高于陰虛“上火”人群。結論：“上火”是一種局部的炎性反應，機體內環境在多種因素的作用下激活素A水平升高，影響炎性反應介質的作用或者本身作為一種炎性反應介質活化血管內皮細胞刺激E選擇素的分泌與合成，誘導炎性反應，這是“上火”機制之一。

上火；激活素A；E選擇素；炎性反應

“上火”是指人體陰陽失衡，表現為目赤、口瘡、口腔潰瘍、牙齦腫痛、咽痛、口干、尿赤、便干等一系列熱象的疾病[1]。課題組前期大規模流行病學調查發現，引起“上火”的因素主要有情志、飲食、藥物等[2]。“上火”常見實熱“上火”與陰虛“上火”2種證型[3]。課題組前期利用細胞因子芯片檢測6例陰虛“上火”患者“上火”前后血清細胞因子的變化，結果發現下調的細胞因子有10種，上調的細胞因子有23種，其中發現細胞因子Activin A和E-selectin明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)，提示細胞因子在“上火”的發病過程中發揮作用。本研究擬在上述基礎上，進一步從細胞分子生物學角度探討Activin A和E-selectin對2種不同類型上火患者的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江中醫藥大學第一附屬醫院招募的臨床志愿者48例，隨機分為實熱組、陰虛組、對照組，每組16例，其中男21例，女27例，平均年齡為38.83歲。分別采集促凝管及抗凝管血液，促凝管提取血清，抗凝管提取單核細胞，3組間年齡及性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2 診斷標準 實熱“上火”和陰虛“上火”診斷標準需符合“上火”診斷標準外還應符合自身證候標準，具體如下：實熱“上火”診斷標準：1個主癥+舌象或脈象(主癥：眼眵或痰、發熱或惡熱、目赤、面紅、牙齦腫痛、大便秘結；舌脈：舌紅苔黃燥、脈數有力)；陰虛“上火”診斷標準：1個主癥+舌象或脈象(主癥：手足心熱、兩顴潮紅、午后潮熱；舌脈：舌紅苔少或無或剝、脈細數)；2)平和質健康人群(作為正常對照組)，符合《中醫體質分類及判定》中平和質的判定標準；3)患者年齡在18～60歲之間；并且無心腦肝腎等重要臟器疾病者；4)自愿參加本試驗并同意簽署知情同意者。

表1 臨床樣本情況本

注：與對照組比較，*P<0.05

1.3 納入標準 1)符合入選標準的實熱、陰虛“上火”人群，具體標準如下：采用專家咨詢法，經過多輪專家咨詢，確定“上火”的診斷標準：1個主癥(頭面部癥狀)或2個次癥(至少1個頭面部癥狀)。其中主癥為：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡、口苦、目赤干澀；次癥為：口角糜爛、目眵增多、口渴、舌痛、鼻衄、鼻腔干燥、大便干結、心煩、小便黃、多食易饑、五心煩熱、痔瘡發作、潮熱。

1.4 排除標準 1)不符合納入標準者；2)合并各系統靶器官嚴重病變、腫瘤、精神障礙等疾病的患者；3)懷孕及哺乳期婦女；4)研究過程中認為有不適宜入選情況者。

1.5 試劑與儀器 Activin A、E-Selectin試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific公司。Oligo(dT)、Rnase抑制劑、mRNA、M-MLV逆轉錄酶購于日本TAKARA公司，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司。Bio-rad T100梯度PCR儀(Bio-Rad Laboratories，Inc)、微量核酸測量儀(3300Pro Amersham ultrospec)。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 酶聯免疫吸附法檢測activinA、E-selectin的含量 促凝管取血后立即混勻，室溫靜置45 min后離心取血清。按說明書將不同濃度標準品及稀釋好的樣品加入酶標板后封板，加入生物素抗體、TMB顯色液、終止液等試劑，用酶標儀在450 nm測定OD值。繪制標準曲線。

1.6.2 RT-PCR實驗檢測activinA、E-selectin的基因表達量 引物設計：根據Primer5.0引物設計軟件設計，由上海生物工程有限公司合成，各引物序列見表2。

表2 引物序列

提取外周血單個核細胞后，再提取RNA并進行逆轉錄成cDNA。PCR擴增的目的基因為activinA、E-selectin，以GAPDH為內參。反應條件為：95 ℃ 3 min預變性，然后按95 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，反應45個循環，最后72 ℃ 10 min延伸。

2 結果

2.1 血清activinA、E-selectin含量在上火人群中的表達 上火組activinA血清含量與對照組比較，陰虛組血清含量有一定程度降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；實熱組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與陰虛組比較，實熱組血清含量也顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)。上火組E-selectin血清含量與對照組比較，陰虛組有一定程度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；實熱組血清含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與陰虛組比較，實熱組血清含量升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組血清activinA、E-selectin含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，△P<0.05

2.2 外周血activinA、E-selectin基因水平在上火人群中的表達 上火組activinA的表達水平與對照組比較，實熱組表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，陰虛組表達有一定程度降低，差異無統計學意義(P>0.05)；與陰虛組比較，實熱組表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。上火組E-selectin的表達水平與對照組比較，實熱組表達水平顯著升高(P=0.013)；陰虛組表達水平升高不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)與陰虛組比較，實熱組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

圖1 各組血清activinA含量

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，**P<0.05

圖2 各組E-selectin血清含量

注：與對照組比較，*P<0.05

表4 各組activinA基因表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，△P<0.05

表5 各組E-selectin基因表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與實熱組比較，△P<0.05

3 討論

3.1 中醫對“上火”的認識 中醫對“上火”的認識歷史悠久，明·陳嘉謨所撰《本草蒙荃》：“若研末雞清調稠，可敷上火瘡取效”其中“上火瘡”的敘述是課題組目前發現最早的有關“上火”的文獻記載。“上火”一般分為“實火”和“虛火”2大類[4-5]。實熱“上火”多由于外邪內侵、過食辛辣等刺激，造成臟腑功能失調引起。陰虛“上火”多因內傷勞損所致，如久病精氣耗損、勞傷過度，陰血虛損而生內熱，內熱進而化虛火。《景岳全書·卷十五雜證謨·論火證》指出“凡察火證，必須察其虛實”，認為分清火證虛實之因是診斷的首要任務。《景岳全書·卷三傳忠錄·命門余義》：“實熱之火其來暴，而必有感觸之故；虛熱之火其來徐，而必有積損之因，此虛火實火之大有不同也”。因此，分清虛實對“上火”的辨證與治療都具有重要意義。

圖3 各組activinA、E-selectin基因表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與陰虛組比較，△P<0.05

3.2 “上火”與炎性反應之間的關系 一般情況下“上火”是一種局部的炎性反應，人體受到環境、飲食、心理、感染等諸多因素刺激作用下，機體分泌炎性反應介質，使局部組織產生炎性反應而表現出“上火”的各種臨床表現。如“上火”患者常有反復發作的口腔潰瘍，潰瘍的發生與炎性反應密切相關。有研究發現與正常人比較復發性口腔潰瘍患者外周血中促炎介質明顯升高[6]，抑炎介質水平則明顯下降，調節性T細胞數量減少，機體自身免疫耐受能力降低。此外牙齦炎在“上火”人群中常有發生，作為牙周病的一種重要類型，也與炎性反應關系緊密。牙周病防治的關鍵在于控制菌斑，而在炎性反應急性期抗菌藥物的應用不容忽視。可見“上火”患者的一些臨床表現是由于抗炎與抑炎的平衡被破壞，過度免疫反應導致組織的破壞而引起的。

3.3 激活素A、E選擇素與“上火”的關系 細胞因子參與介導和調節固有免疫及適應性免疫應答、調節細胞生長分化、參與炎性反應發生和創傷愈合等，其表達異常可使機體免疫調節紊亂產生疾病，許多難治性疾病都與機體細胞因子功能紊亂有關[7-8]。前期“上火”的免疫調節通路變化研究中，利用基因芯片技術對造模后的大鼠血清細胞因子進行檢測，發現27個細胞因子2倍上調，1個細胞因子顯著下調。而對6例“上火”患者血清進行芯片分析，下調的細胞因子有10種，發現上調的細胞因子有23種，其中激活素A和E選擇素升高明顯。可見“上火”的發生與細胞因子功能紊亂密切相關。激活素A(Activin A)又稱免疫抑制因子P，屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員[9]。在骨髓、脾臟、肝臟、血管內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞等多種組織中均有發現，具有多種生物學作用。如參與初期胚胎形成，誘導造血干細胞增殖和分化、抑制活化巨噬細胞活性等[10]。此外激活素A還對組織修復，炎性反應恢復和組織再生、分化有著重要的調節作用[11-12]。有研究[13]發現激活素A在體內外均能刺激小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β及IL-6分泌，還能增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬和吞飲功能。多項實驗均顯示炎性反應、機體急性期反應與激活素A有關[14-15]。可見在機體急性反應期或炎性反應早期，激活素A參與早期天然免疫應答的調節過程，通過影響炎性反應介質的作用而調節機體的免疫功能，進而影響機體的生理平衡。

E選擇素(E-selectin)屬于選擇素家族，是一類異親型結合、Ca2+依賴的I型單鏈跨膜糖蛋白細胞黏附分子[16]。有研究[17]發現選擇素的主要作用是在炎性反應發生時介導白細胞與血管內皮細胞的識別及起始黏附，參與白細胞越過血管進入炎區組織。還有研究[18]證實在感染及炎性反應發生的過程中，E選擇素通過與其相應的配體相結合后介導白細胞與血管壁接觸，使白細胞在血管壁上緩慢滾動，即而啟動一系列反應，最終導致白細胞在炎性反應區內集中。

激活素A和E-選擇素作為2種重要的細胞因子，在維持機體正常免疫功能和生理平衡舉足輕重的作用。有研究[19]發現TGF-β能夠影響細胞黏附分子的表達是顯著延長心臟移植存活時間的作用機制之一。并且炎性反應組織釋放的白細胞介素、腫瘤壞死因子及轉化生長因子-β(TGF-β)等細胞因子可活化血管內皮細胞上的E選擇素，促進其合成分泌而發揮作用。從TGF-β與細胞黏附分子在炎性反應中的相互作用，可見作為TGF-β超家族中的重要成員激活素可在一定條件下影響炎性反應介質的作用或者本身作為一種炎性反應介質活化血管內皮細胞刺激E選擇素的分泌與合成，進而共同影響機體生理平衡，產生“上火”這類局部炎性反應。故本研究在前期基因芯片技術研究的基礎上篩選出激活素A和E選擇素作為研究對象，進一步探討2者在“上火”疾病發生發展中的作用，以及2者的相互作用關系。本次研究的結果也說明激活素A和E選擇素在誘導“上火”局部炎性反應中起到了一定作用。

綜上所述，“上火”患者血清中激活素A和E選擇素的水平均較正常人群有所升高，同時外周血單核細胞中激活素A和E選擇素的基因表達水平也較正常人群有所升高。說明機體內環境在多種因素的作用下激活素A水平升高，影響炎性反應介質的作用或者本身作為一種炎性反應介質活化血管內皮細胞刺激E選擇素的分泌與合成，誘導炎性反應影響機體生理平衡，從而引發“上火”。

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ResearchontheDifferentialExpressionofActivinAandE-selectininthePopulationofExcessiveInternalHeat

Wang Qinjing1, Xu Li2, Bao Jie2, Ji Jinjun2, Xie Guanqun2, Fan Yongsheng2

(1AffiliatedJiangnanHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou311200,China; 2CollegeofBasicMedicine,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Objective:To study of activin A and E selectin in the pathogenesis of “shanghuo” people and influence effect through the determination of serum content and the level of gene expression in peripheral blood mononuclear cells of activin A or E-selectin who suffered from excessive internal heat.MethodsClinical lit crowd and gentleness in blood samples was collected and serum and peripheral blood mononuclear cells from blood samples was extracted. By enzyme-linked immune sorbent adsorption assay, the content of serum activin A and E-selectin were determined, and RT-PCR detection was sued to detect gene expression level of activin A and E-selectin.ResultsThe level of activin A and E-selectin in serum of patients with excessive internal heat was higher than that of normal and healthy people. The level of activin A and E-selectin gene expression in peripheral blood mononuclear cells of patients with internal heat was higher than that of normal and healthy people. The gene expression level of activin A and E-selectin in peripheral blood was higher than that of yin deficiency and heat syndrome.ConclusionShanghuo is a local inflammation. Under stress, activin A levels are elevated, effecting inflammatory mediators or itself as a mediator of inflammation activated vascular endothelial cells stimulate E-selectin secretion and synthesis, induced inflammatory reaction and to cause the disorder of lipid metabolism in the body′s physiological balance, causing Shanghuo.

Shanghuo; Activin A; E selectin; Inflammatory reaction

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.005

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2014CB543001，2014CB543002)；國家自然科學

基金項目(81673857)

汪琴靜(1988.07—)，女，碩士，中醫師，研究方向：中醫藥防治風濕自身免疫病，E-mail:775161528@qq.com

范永升(1955.11—)，男，博士，教授，國家重點學科帶頭人，研究方向：中醫藥防治風濕自身免疫病，E-mail:fyszjtcm@163.com

(2017-11-03收稿 責任編輯：張文婷)