基于線粒體控制區的嘉陵裸裂尻魚種群遺傳結構分析

王 太,杜巖巖,楊濯羽,張艷萍,婁忠玉,焦文龍

甘肅省水產研究所,甘肅省冷水性魚類種質資源與遺傳育種重點實驗室, 蘭州 730030

基于線粒體控制區的嘉陵裸裂尻魚種群遺傳結構分析

王 太,杜巖巖,楊濯羽,張艷萍*,婁忠玉,焦文龍

甘肅省水產研究所,甘肅省冷水性魚類種質資源與遺傳育種重點實驗室, 蘭州 730030

嘉陵裸裂尻魚為青藏高原特有魚類,近年來隨自然地理氣候的變遷和人類活動的影響,種群數量急劇減少。為了解嘉陵裸裂尻魚的遺傳背景以便更好的保護其遺傳資源,本研究采用線粒體控制區部分序列變異,分析了嘉陵裸裂尻魚6個地理種群的遺傳結構和分布動態。在147尾個體中共發現17個變異位點,定義了14種單倍型,群體總的單倍型多樣性較高為0.810,核苷酸多樣性低為0.00698。AMOVA分析顯示,44.29%的分子差異源于群體間,55.71%的分子差異源于群體內,群體間遺傳分化極顯著。Fst值統計檢驗表明,除宕昌群體和舟曲群體之間差異不顯著外,其余兩兩群體之間Fst值統計檢驗均顯著。基因流估計顯示各群體間的基因流水平較高,遺傳交流較頻繁。Mantel test檢驗表明,嘉陵裸裂尻魚種群之間遺傳分化程度與地理距離存在顯著相關。系統樹和單倍型網絡進化圖顯示,6個地理群體的單倍型按照嘉陵江水系和渭河水系形成兩個大的類群。錯配分布和中性檢驗表明嘉陵裸裂尻魚群體在近期歷史上群體大小保持穩定,未出現顯著的種群擴張。根據本文所揭示的嘉陵裸裂尻魚種群遺傳結構特征,建議將分布在嘉陵江水系的嘉陵裸裂尻魚作為一個整體進行保護,嘉陵裸裂尻魚渭河種群屬高度分化的單倍型類群,且遺傳多樣性極低,需對該種群進行優先保護。

嘉陵裸裂尻魚；線粒體控制區；種群遺傳結構；遺傳多樣性

青藏高原作為全球遺傳多樣性的重要區域,通過對魚類生物地理學的研究在探討青藏高原的地質變遷和水系演化方面具有現實意義。裂腹魚亞科(Schizothracinae)魚類是青藏高原魚類的重要類群之一,它們對高原環境表現出了很強的適應性,成為在高原上分布范圍最廣、分布海拔最高的類群,最高可分布到海拔5600 m,是鯉科魚類中適應高寒環境的一個特化類群[1],它和鰍科高原鰍屬魚類共同構成了青藏高原魚類區系的主體。

嘉陵裸裂尻魚(Schizopygopsiskialingensis)屬裂腹魚亞科裸裂尻魚屬(Schizopygopsis),主要分布在嘉陵江上游支流白龍江,以底棲無脊椎動物為食。繁殖期在每年6月河流解凍之后,產卵場位于水深1米以內的緩流處。近年來,隨著自然地理氣候的變遷、人類活動的加劇,涉水工程的建設、水體污染和長期過度捕撈等對嘉陵裸裂尻魚“三場”及棲息地、洄游通道等造成了嚴重影響,再加上其性成熟晚,分布區域狹窄,生長速度緩慢等自身因素限制了種群的發展[2],種群數量急劇減少,棲息地呈現出一種破碎化狀態,已經被列入甘肅省重點保護野生動物名錄。目前,嘉陵裸裂尻魚的相關研究主要集中在形態學[3]、資源分布[4]和分類地位[5]方面,遺傳多樣性評估方面的研究還未見有報道。

線粒體DNA具有結構簡單、母系遺傳、幾乎不發生重組和進化速度較快的特點,是研究動物群體遺傳學的理想分子標記[6][7]。線粒體DNA控制區序列為線粒體非編碼區序列,進化速度較快,是分析魚類種群遺傳結構的優良標記。趙凱等[8]采用D-loop和cytb聯合序列分析了的祁連山裸鯉的生物地理學過程,認為在0.05—0.37Ma前祁連裸鯉種群由石羊河沿著青藏高原東北邊緣由東向西擴張。孟瑋等[9]采用D-loop序列片段分析了塔里木裂腹魚的遺傳結構,認為塔里木河的5個群體間遺傳分化顯著。本文通過線粒體控制區序列變異分析了嘉陵裸裂尻魚的種群遺傳變化,旨在為嘉陵裸裂尻魚資源的管理與保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

實驗采集嘉陵裸裂尻魚6個野生群體(見圖1),共147尾個體,樣品數量、采集地見表1。取右側胸鰭2 g置于無水乙醇中固定后帶回實驗室進行分析,采用酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2 PCR擴增和序列測定

擴增mtDNA控制區序列的引物[8]: GEDL200: 5′-CACCCCTGGCTCCCAAAGCCAG- 3′; GEDH860: 5′-AGGGGTTTGACAAGAATAACAGGA- 3′,由上海美吉生物醫藥科技有限公司合成。PCR反應體系為25 μL,其中包括1 U TaqDNA聚合酶(TaKaRa),2.5 μL 10× Taq buffer(TaKaRa,含Mg2+),兩條引物(10 mmol/L)各1 μL,0.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL DNA模板,其余雙蒸水補足。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸60 s,共30個循環；反應結束后在72℃再延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物工程公司純化并雙向測序,測序引物為擴增引物。

1.3 數據分析

用DnaSP 5.0軟件[10]計算單倍型數、多態位點、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和錯配分布(Mismatch)分析(自舉值為500)等；采用Arlequin 3.0軟件[11]計算兩兩群體間的遺傳分化指數FST值(重復次數10000),用公式Nm=[(1/Fst)-1]/2 計算基因流Nm[12],并進行AMOVA分析和Tajima′s D、Fu′s Fs中性檢驗(重復次數10000),獲得SSD值和Raggedness值。采用矩陣相關分析(Mantel test)檢驗6個種群之間的遺傳分化是否與地理距離相關,檢驗矩陣為種群兩兩之間線性化的遺傳分化系數Fst矩陣及采樣點地理距離矩陣,地理距離為兩個GPS位點間的直線距離,并進行ln轉換,計算相關系數r。用Mega 7.0軟件[13]統計堿基組成,并基于Kimura2-parameter模型以黃河裸裂尻魚、極邊扁咽齒魚和齊口裂腹魚為外群,用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構建分子系統樹,系統樹中節點的自舉置信水平應用自引導估計,循環次數為1000次。Network 4.6.1.1軟件[14]中的median-joining算法繪制單倍型最小網絡關系圖,用以展示單倍型進化關系。

表1 嘉陵裸裂尻魚樣本信息及遺傳多樣性指數

圖1 嘉陵裸裂尻魚采樣點分布圖Fig.1 Sketch map of sampling sites of Schizopygopsis kialingensis

2 結果

2.1 序列變異及群體遺傳多樣性

對嘉陵裸裂尻魚的線粒體控制區序列進行比對排序后,得到706 bp的同源序列。147尾個體共包含17個核苷酸變異位點,其中簡約信息位點16個,單突變位點1個。堿基組成分析顯示,A、T、C和G堿基平均含量分別為31.6%、31.6%、21.9%和14.9%,其中A+T含量(63.2%)明顯高于G+C含量(36.8%),表現出明顯的AT偏好和反G偏倚,與其他脊椎動物線粒體控制區核苷酸的組成特點相一致[15]。嘉陵裸裂尻魚群體的遺傳多樣性信息見表1,由表1中可以看出147尾個體共檢測出14個單倍型(KY092436—KY092449),顯示出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性(Hd=0.810±0.018；π=0.00698±0.00044),其中采樣點舟曲城關鎮的嘉陵裸裂尻魚單倍型多樣性最高,為0.713±0.074；采樣點渭源鍬峪鄉的單倍型多樣性最低,為0.071±0.065。

2.2 群體遺傳分化

通過計算兩兩群體間Fst值得到的結果顯示(表2),宕昌群體(TC)和舟曲群體(ZQ)之間差異不顯著(P>0.01),其余兩兩群體之間Fst值統計檢驗均顯著。其中,迭部群體與渭源群體間的Fst值最大(0.75132),宕昌群體與舟曲群體間的Fst值最小(0.03368)。嘉陵裸裂尻魚群體進行分子變異(AMOVA)分析結果顯示(表3),44.29%的分子差異位于群體間,55.71%的分子差異位于群體內,群體間遺傳分化極顯著(Fst=0.44292；P=0.000)。按照采樣點所處水系將6個地理種群分為2組,渭源種群為1組,其余5個種群為1組,進行AMOVA分析顯示,38.48%的分子差異位于組間,19.25%的分子差異位于組內群體間,42.27%的分子差異位于群體內,組間的遺傳分化不顯著(Fst=0.38481；P=0.155),組內群體間和群體內的遺傳分化極顯著。根據遺傳分化指數計算出種群間的基因流Nm為0.08275—7.17280,其中只有舟曲群體與迭部群體、拱壩群體和宕昌群體,宕昌與迭部群體之間的基因流大于1(表4)。

表2 嘉陵裸裂尻魚群體間Fst值(對角線下)及相應的P值(對角線上)

表3 嘉陵裸裂尻魚6種群間遺傳差異的分子方差分析(AMOVA)

表4嘉陵裸裂尻魚6個地理種群間基因流(Nm)(下三角)與地理距離(km)(上三角)

Table4Matrixofpopulationpairwisemigrationrates(Nm)values(below diagonal)andgeographicaldistances(km) (above diagonal)betweenpopulationsofSchizopygopsiskialingensis

群體屬地Populationgeogra-phy迭部益哇鄉迭部臘子鄉舟曲城關鎮舟曲拱壩鄉宕昌南河鎮渭源鍬峪鄉迭部益哇鄉67.6110.6143.8115.8144.2迭部臘子鄉0.3064653.084.447.9105.3舟曲城關鎮2.163830.8191134.827.5136.3舟曲拱壩鄉0.474510.459501.6903959.9145.1宕昌南河鎮1.284310.753697.172800.50134117.7渭源鍬峪鄉0.082750.152110.133840.103740.10660

Mantel test檢驗表明,嘉陵裸裂尻魚種群之間遺傳分化程度與地理距離存在顯著的相關(r=0.6952,P<0.0500),說明距離隔離模型可以有效的解釋嘉陵裸裂尻魚種群目前遺傳格局的形成。但是也有情況例外,迭部嗌哇鄉(DB)群體與迭部臘子鄉(LZ)群體的地理距離較近,但群體之間的遺傳差異較大。

2.3 分子系統發育分析

以黃河裸裂尻魚(Schizopygopsispylzovi)、極邊扁咽齒魚(Platypharodonextremus)和齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)為外類群,應用鄰接法(NJ)構建嘉陵裸裂尻魚14個線粒體控制區序列單倍型(KY092436-KY092449)之間的系統發育樹(圖2)。結果顯示,所有的嘉陵裸裂尻魚樣本聚為一個單系,并清楚的識別出了對應于水系的兩個譜系群體,即嘉陵江組群和渭河組群。依據Network軟件以中接法(Median-joining)構建的單倍型進化網絡關系圖顯示(圖3、圖4),大部分單倍型之間經過一步突變,H1做為嘉陵裸裂尻魚在嘉陵江水系的祖先單倍型,H3做為渭河水系的祖先單倍型,并且兩個譜系群體之間沒有共享單倍型。單倍型進化網絡圖進一步支持了系統發育樹的分析, 嘉陵裸裂尻魚6個地理群體的單倍型按照嘉陵江水系和渭河水系形成兩個大的類群。

圖2 基于D-loop區序列構建嘉陵裸裂尻魚的NJ樹,節點處的數字為1000次bootstrap檢驗的支持率Fig.2 A neighbor-joining tree of part of Schizopygopsis kialingensisin resulted from D-loop sequence. Numbers at nodes are percent recovery in bootstrap analysis (1000 replicates)

圖3 嘉陵裸裂尻魚單倍型最小進化網絡關系 Fig.3 Haplotypes minimum spanning network for Schizopygopsis kialingensis

2.4 群體擴張分析

對所擴增的147尾嘉陵裸裂尻魚的線粒體控制區序列進行核苷酸錯配分布分析、Tajima′s D和Fu′s FS中性檢驗來分析種群歷史動態。結果顯示,迭部益哇鄉群體(DB)、迭部臘子鄉群體(LZ)和渭源群體(WY)的核苷酸錯配分布曲線呈明顯的單峰型(圖3),但Tajima′s D和Fu′s FS檢驗均不顯著(P>0.05),表明這3個群體未顯著偏離種群擴張模型。其余3個群體的核苷酸錯配分布都呈現多峰分布,且Tajima′s D和Fu′s FS檢驗均不顯著,未檢測到種群擴張。將所有個體做為一個整體進行核苷酸錯配分布,呈現出多峰分布,Tajima′s D和Fu′s FS檢驗符合中性進化的假設,說明嘉陵裸裂尻魚群體在近期歷史上群體大小保持穩定,未出現顯著的種群擴張。

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

種群遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,體現了物種對不同環境的適應能力的潛力,遺傳多樣性水平、形成機制和分布格局可揭示物種起源與進化歷程,是物種進化潛能的保證,也是物種保護工作的基礎。單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)是衡量一個物種群體變異程度的重要指標[16]。嘉陵裸裂尻魚的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(Hd=0.810±0.018；π=0.00698±0.00044)整體低于同亞科魚類齊口裂腹魚[17](Schizothoraxprenanti)(Hd=0.98；π=0.019)和極邊扁咽齒魚[18](Platypharodonextremus)(Hd=0.995；π=0.0129),與厚唇裸重唇魚[19](Gymnodiptychuspachycheilus)(Hd=0.844；π=0.0054)和黃河裸裂尻魚(Schizopygopsispylzovi)[20](Hd=0.79；π=0.0027)相當。嘉陵裸裂尻魚6個地理群體的單倍型多樣性呈現出有些群體高、有些群體低的現象,而核苷酸多樣性均較低,甚至在迭部益哇鄉(DB)和渭源(WY)群體的核苷酸多樣性低于0.001。這種在不同群體的遺傳多樣性存在顯著的地理差異的現象在淡水魚類中被大量觀察到[21,22],嘉陵裸裂尻魚較低的核苷酸多樣性,可能與青藏高原第四紀以來經歷了數次地質變遷和氣候的改變,使種群受到“瓶頸效應”的打擊,后部分種群又受到“創立者效應”的作用,導致部分種群的遺傳多樣性貧乏。對于渭源種群(WY)來說,長期的地理隔離也可能是造成遺傳多樣性水平極低的主要原因之一,有效群體數量小引起的遺傳漂變導致大量的遺傳變異丟失。

表5 嘉陵裸裂尻魚的中性檢驗

圖4 不同地理群體嘉陵裸裂尻魚的核苷酸錯配分布曲線Fig.4 The result ofmismatchdistributionpairwise haplotypes geneticdifferences forSchizopygopsis kialingensis(實線為模擬的不配對分布,虛線為觀察到的不配對分布A:DB,B:LZ,C:ZQ,D:GB,E:TC,F:WY,G:整體)

3.2 遺傳結構分析

有研究得出地理隔離或同一水域中存在不同的棲息環境限制了基因交流,是魚類出現種群分化的重要原因[23],遺傳分化和基因流是評價種群遺傳結構的重要指標。渭源群體(WY)采自黃河流域渭河,而其他5個地理群體為嘉陵江水系,受地理隔離影響渭源群體與其他群體之間的Fst(0.62172—0.75132)遠大于0.25,說明嘉陵裸裂尻魚渭源群體與其他種群之間遺傳分化較大,這與基因流Nm分析結果一致,群體間基因流貧乏。位于嘉陵江5個水系連通地理群體之間Fst(0.03368-0.44927)較小,相鄰地理種群之間有基因交流(Nm>1),可以抑制遺傳漂變引起的遺傳分化[24],這可能與嘉陵裸裂尻魚具有短距離洄游這一習性有關。Mantel test檢驗表明,嘉陵裸裂尻魚種群之間遺傳分化程度與地理距離存在顯著相關,說明距離隔離模型可以有效解釋種群目前遺傳格局的形成。但是也有迭部嗌哇鄉(DB)群體與迭部臘子鄉(LZ)群體的地理距離較近,但群體之間的遺傳差異較大的現象,說明地理隔離并非唯一影響嘉陵裸裂尻魚遺傳格局的因素,推測可能是由于白龍江上游大量梯級電站的建設,使河流失去連通性,限制了嘉陵裸裂尻魚的擴散,導致兩者之間的遺傳分化加大。

分子變異分析(AMOVA)顯示,55.71%的變異來自于種群內,44.29%的變異來自于種群間。種群間的遺傳變異較大,這與單倍型系統進化樹(圖1)和單倍型進化網絡關系圖(圖2)相一致,渭源種群單倍型獨自聚為一支,且渭源種群與其他種群之間沒有共享單倍型。按照水系將嘉陵裸裂尻魚種群劃分為2組進行AMOVA分析顯示,嘉陵江水系5個地理種群間的遺傳變異將為19.25%,大部分的遺傳變異來自于種群內的個體之間(42.27%),這同樣與單倍型進化樹和單倍型進化網絡關系圖相一致,嘉陵江水系5個地理種群間沒有顯著的地理種群結構。基因流估計顯示各群體間的基因流水平較高,遺傳交流較頻繁,這與它們缺乏種群結構是一致的。綜合這幾方面研究結果都顯示,嘉陵江水系的嘉陵裸裂尻魚沒有顯著的種群分化。

3.3 種群歷史動態與保護

嘉陵裸裂尻魚整體、舟曲城關鎮種群(ZQ)、舟曲拱壩鄉種群(GB)和宕昌種群(TC)的核苷酸錯配分析均呈多峰分布,Tajima′s D和Fu′s FS檢驗符合中性進化的假設。迭部益哇鄉群體(DB)、迭部臘子鄉群體(LZ)和渭源群體(WY)的核苷酸錯配分布曲線呈明顯的單峰型(圖3),但Tajima′s D和Fu′s FS檢驗都不顯著(P>0.05),表明嘉陵裸裂尻魚群體在近期歷史上群體大小保持穩定,未出現顯著的種群擴張。在很多魚類中都發現了單倍型多樣性高而核苷酸多樣性低的現象[25,26],被認為是小的有效群體經過一段時間的穩定后發生了擴張,快速的種群擴張有利于提高對新突變的保持能力而導致核苷酸多樣性低[27]。而嘉陵裸裂尻魚這種單倍型多樣性偏低和核苷酸多樣性低的狀況,推測在第四紀冰期期間由于種群受到“瓶頸效應”打擊之后,未發生種群擴張事件,導致遺傳多樣性偏低。這可能與其自身的性成熟年齡(5齡)晚,個體小(調查最大個體全長18cm)導致的懷卵量低等生物學特性有關[1]。

魚類種群遺傳結構和譜系系統地理格局的研究結果能夠為物種保護策略及漁業管理措施的制定提供科學依據[28]。嘉陵裸裂尻魚遺傳多樣性總體較為豐富,但各個地理群體內的多樣性比較貧乏。受自然環境變化和涉水工程的建設等因素的影響,可能導致嘉陵裸裂尻魚的遺傳多樣性繼續降低,對復雜環境的適應能力降低,從而進一步威脅到嘉陵裸裂尻魚的生存。雖然目前已經建立了一些保護措施,如建立的白龍江特有魚類國家級水產種質資源保護區、岷江宕昌段特有魚類國家級水產種質資源保護區和白龍江舟曲段特有魚類省級水產種質資源保護區,并在嘉陵江采取人工增殖放流措施。但這些措施對保護嘉陵裸裂尻魚可能并不完善。物種的保護必須考慮到自身的遺傳特性,否則保護將可能是不成功的[29]。本研究結果表明,嘉陵裸裂尻魚的核苷酸多樣性較低,提示對其遺傳多樣性的保護是非常迫切的。根據進化上具關鍵意義的單元ESU(Evolutionarily Significant Unit)設置的原則[30],我們可以將嘉陵江水系的嘉陵裸裂尻魚種群當作一個保護管理單元進行保護,嘉陵裸裂尻魚渭河種群屬高度分化的單倍型類群,且遺傳多樣性極低,需當作一個保護管理單元進行優先保護。

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PopulationgeneticstructureofSchizopygopsiskialingensisinferredfrommitochondrialD-loopsequences

WANG Tai, DU Yanyan, YANG Zhuoyu, ZHANG Yanping*, LOU Zhongyu, JIAO Wenlong

GansuKeyLaboratoryofColdWaterFishesGermplasmResourcesandGeneticsBreeding,GansuFisheriesResearchInstitute,Lanzhou730030,China

Schizopygopsiskialingensisis an endemic fish of the Bailong River, which is a tributary of the Jialing River. The species′ population has been largely reduced in recent years as a result of overfishing, river pollution, and dam construction. To develop effective strategies forpreserving the species′germplasm, it is first necessary to understand the species′ genetic variation and population structure. Therefore, in the present study, a 706-bp segment of the mitochondrial control region was sequenced from 147S.kialingensisspecimens that were collected from six populations in the Bailong and Weihe Rivers. Seventeen variable sites and 14 haplotypes were identified. The six populations exhibited high haplotype diversity (0.810) and low nucleotide diversity (0.00698), and the genetic diversity of the Zhouqu County Chengguan Township population was highest, whereas that of the Weiyuan County Qiaoyu Township population was the lowest. AMOVA indicated that significant difference among populations, with 44.29% molecular variation among the populations and 55.71% molecular variation within populations. Pairwise fixation index (Fst) values indicated that all the populations were significantly different, except the Tanchang County Nanhe Township and Zhouqu County Chengguan Township populations. Meanwhile, gene flow estimates suggested high levels of gene flow, and the Mantel test indicated that the genetic and geographic distances were significantly correlated. In addition, the construction of a neighbor-joining phylogenetic tree and a minimum spanning network indicated that the 14 haplotypes formed two main groups that corresponded to the Bailong River and Weihe River systems, and mismatch distribution and neutrality analyses indicated that the population has not under gone recent expansion. According to these findings, we suggest that theS.kialingensispopulation in the Bailong River should be protected and that the protection of the Weihe River population should be prioritized, owing to the group′s high genetic differentiation and very low genetic diversity.

Schizopygopsiskialingensis; Mitochondria D-loop; Population Genetic Structure; Genetic diversity

國家自然科學基金項目(31460560);甘肅省創新團隊建設計劃(1207TTCA008)

2016- 09- 14;

2016- 12- 07

*通訊作者Corresponding author.E-mail: aqhongqi@qq.com

10.5846/stxb201609141862

王太,杜巖巖,楊濯羽,張艷萍,婁忠玉,焦文龍.基于線粒體控制區的嘉陵裸裂尻魚種群遺傳結構分析.生態學報,2017,37(22):7741- 7749.

Wang T, Du Y Y, Yang Z Y, Zhang Y P, Lou Z Y, Jiao W L.Population genetic structure ofSchizopygopsiskialingensisinferred from mitochondrial D-loop sequences.Acta Ecologica Sinica,2017,37(22):7741- 7749.