白藜蘆醇對阿爾茨海默病合并糖尿病大鼠的氧化應激作用

孫治坤 馬興榮 韓 笑 張錢林 張杰文△

1)河南省人民醫院神經內科，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450052

·論著科研之窗·

白藜蘆醇對阿爾茨海默病合并糖尿病大鼠的氧化應激作用

孫治坤1)馬興榮2)韓 笑1)張錢林1)張杰文1)△

1)河南省人民醫院神經內科，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450052

目的觀察白藜蘆醇對阿爾茨海默病合并糖尿病大鼠模型腦內氧化應激的作用。方法動物隨機分為對照組、阿爾茨海默病合并糖尿病模型組、白藜蘆醇對照組和白藜蘆醇治療組。模型組采用鏈脲佐菌素腹腔內注射誘導出糖尿病的大鼠模型，在腦立體定位儀的指導下把凝聚態的Aβ1-40注射到糖尿病大鼠腦內的雙側海馬內，白藜蘆醇對照組和白藜蘆醇治療組從術后1周開始每天給予25 mg/kg的白藜蘆醇灌胃，持續4周。采用Morris水迷宮試驗檢測大鼠學習記憶水平，同時測定大鼠腦皮質和海馬組織乙酰膽堿酯酶(AchE)和膽堿乙酰轉移酶(ChAT)的活性以及與氧化應激有關的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)活性的變化情況。結果與對照組相比，阿爾茨海默病合并糖尿病模型組大鼠的學習記憶能力明顯下降(P<0.05)，且腦皮質和海馬組織內AchE活性明顯升高(P<0.05)，而ChAT的活性卻明顯降低(P<0.05)；阿爾茨海默病合并糖尿病模型組腦皮質和海馬組織內MDA的活性與對照組相比明顯升高(P<0.05)，而SOD及GSH活性卻明顯降低(P<0.05)。與阿爾茨海默病合并糖尿病模型組相比，白藜蘆醇治療組上述指標的變化程度均明顯減輕(P<0.05)。結論白藜蘆醇可明顯提高阿爾茨海默病合并糖尿病大鼠的學習記憶能力，其作用機制通過調節腦組織內乙酰膽堿代謝以及氧化應激反應實現。

阿爾茨海默病；白藜蘆醇；氧化應激；糖尿病；大鼠；乙酰膽堿酯酶(AchE)；膽堿乙酰轉移酶(ChAT)；丙二醛(MDA)；超氧化物歧化酶(SOD)；谷胱甘肽(GSH)

當前，隨著人們生活水平的逐漸提高以及整個社會人口老齡化的逐步進展，糖尿病(diabetes melli-tus，DM)和阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)均已經成為老年人中最為普遍的疾病。臨床上，這兩種疾病往往并存，給整個社會和家庭帶來沉重的負擔，然而，目前卻沒有單純同時針對這兩種疾病的有效治療措施。白藜蘆醇是一種具有強抗氧化功能的化合物，以往研究認為，其在多種、多個系統性疾病中具有保護作用[1-6]。然而，關于其是否可以同時對糖尿病及阿爾茨海默病有保護作用的研究甚少。本研究擬采用AD合并DM大鼠模型，從氧化應激的角度深入探討白藜蘆醇對AD合并DM的作用，為臨床治療同時有DM和AD的患者提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1．1實驗動物分組實驗動物是由河南省實驗動物中心提供的健康Wistar大鼠，8～10月齡，體質量250～300 g，不限性別。動物購回后常規飼養3 d，觀察其有無異常情況，同時用Morris水迷宮試驗篩選出60只相對比較靈活的大鼠，按照隨機分組的原則，把篩選出來的60只大鼠平均分為4組：對照組(假手術組)、AD合并DM病組、白藜蘆醇對照組(假手術后應用白藜蘆醇治療)、白藜蘆醇治療組(AD合并DM模型后應用白藜蘆醇治療)。

1．2 AD合并DM模型腹腔內注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg，STZ，購自美國Sigma 公司，使用前用0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液進行配置，pH 4.5)，3 d后尾靜脈采血，測定尾靜脈血的血糖含量，當測出的隨機血糖持續>16.7 mmol/L的大鼠才符合慢性糖尿病的標準，提示糖尿病大鼠模型成功。當成功造模出糖尿病大鼠后，常規飼養1周，使用10%水合氯醛(3 mL/kg)通過腹腔內注射的方法麻醉糖尿病模型大鼠，通過腦立體定位儀牢固地固定住大鼠的顱骨，然后進行備皮以及皮膚的消毒，切開大鼠的頭顱頂中線，切口長約2 cm，小心分離皮下組織，暴露出大鼠的前囟，按照大鼠腦立體定位圖譜的指導，在中線旁2.0 mm處輕輕地垂直進針，深度約2.9 mm，然后使用牙科鉆把顱骨打開，把1 μL凝聚態的Aβ1-40(購自Sigma 公司，購回后先用生理鹽水制成母液存放在-80 ℃的冰箱里，使用前取出在37 ℃的孵育箱中孵育24 h后使用)用5 μL的微量進樣器緩緩地注射入糖尿病大鼠的雙側海馬內，注入后留針約10 min，緩慢撤針(為避免撤針時凝聚態的 Aβ1-40蛋白溢出來)，撤針后縫合皮膚、消毒傷口[7]。術后常規飼養1周，Morris水迷宮對造模大鼠進行初步篩選，首先檢測出對照組大鼠游到平臺的平均時間，以平均值+5%作為標準，再檢測出造模的大鼠上臺所需要的時間，如果所用時間超出這個標準值，表明AD合并DM大鼠造模成功。對照組大鼠的制作是把等體積的檸檬酸緩沖液緩慢注射入大鼠腹腔內及等體積的生理鹽水緩慢注射到大鼠雙側海馬。白藜蘆醇對照組和白藜蘆醇治療組大鼠均在術后1周通過Morris水迷宮初步篩選后，每天給予25 mg/kg的白藜蘆醇(購自Sigma公司，使用時溶于2 mL的0.5 g/L羧甲基纖維素鈉中)灌胃，連續4周。對照組大鼠及AD合并DM大鼠分別使用等量0.5 g/L羧甲基纖維素鈉治療。

1．3行為學檢測參照我們以前的實驗方法[7-8]，Morris水迷宮設備購自上海中國醫科院，該設備由3個部分組成：圓形的水池、分析系統和自動攝像系統，檢測實驗有定位航行實驗和空間搜索實驗。(1)定位航行實驗：該實驗主要對各組大鼠的行為學進行訓練和測試。圓形的水池壁是黑色的，水池的直徑約120 cm，深約30 cm，在水中可加入黑色的食用色素，從而使水池中的水不清亮，水溫要求恒定在22 ℃左右，把水池均分為4個象限，在第2象限水面下1～2 cm有一個黑色的小圓形平臺，直徑約9 cm，每只大鼠進行4 d、4次/d的訓練，每次訓練持續180 s，而每2次訓練間隔30 min左右，按照隨機原則從4個象限中選擇每次訓練的入水點，但每相鄰兩天的入水順序必須不一致，如果訓練時大鼠能夠在180 s內上臺，就允許這只大鼠在這個小平臺上停留約30 s左右；如果大鼠在180 s內的訓練時間內不能發現這個平臺，就把這只大鼠牽引到這個平臺上，并讓大鼠停留在平臺上約30 s，這種情況下，該大鼠的潛伏期定為180 s。整個訓練和檢測中，使用攝像頭跟蹤記錄大鼠在水池中的游泳軌跡，記錄后把這些數據輸入到特定的計算機中計算大鼠到達小平臺的潛伏期及游泳距離。(2)空間搜索實驗主要是測量大鼠對那個小平臺空間位置的記憶保持能力。在前一個實驗結束后的次日，撤掉水池中的平臺，分2次隨機在距離原平臺位置最遠的2個象限里把實驗大鼠放入水中，記錄并認真分析該大鼠在平臺所在象限內的時間百分比以及游泳距離百分比[7-8]。

1．4大鼠皮質和海馬組織內指標的檢測參照我們以前的實驗方法[7-8]，按照試劑盒的說明書進行檢測(AchE及ChAT活性檢測試劑盒購自中國南京建成生物公司；MDA及SOD活性檢測試劑盒購自中國上海賽默飛科技有限公司；GSH活性檢測試劑盒購自美國Cayman Chemical公司)。樣品的制作：斷頭法處死各組大鼠，迅速取出腦組織，冰盒上快速小心剝離出大鼠的大腦皮質和海馬組織，分別稱重后，冷凍保存在液氮中，使用前取出后加入預冷的生理鹽水中，在冰盒上研磨制成組織勻漿，用購自Sigma 公司的Biorad蛋白定量試劑盒進行蛋白含量的檢測，測定好樣品中蛋白含量后分別仔細按照試劑盒說明書進行指標的測定，具體如下：(1)AchE活性的檢測：乙酰膽堿經過AchE的水解可以生成乙酸和膽堿，其中的膽堿與巰基顯色劑起反應后可以生成對稱三硝基苯(TNB，Sym Trinitrobenzene)，所生成的TNB在412 nm處具有最大的吸光度值，我們通過測定吸光度計算出需要檢測的膽堿酯酶活力，所得數值的單位以U/mg Pro表示。(2)ChAT活性的測定：ChAT可以促進膽堿和乙酰輔酶A起反應，其反應的產物和顯色劑結合后，在324 nm處具有最佳的吸光度值，通過測定這個吸光度計算出ChAT的活性，結果單位以U/mgPro表示。(3)丙二醛(MDA)的活性測定：硫代巴比妥酸(TBA)可以和MDA結合形成紅色產物，該紅色的產物在523 nm處有最大吸收峰，通過檢測這個吸光光度值可以計算出MDA的活性，其單位用nmol/mg Pro表示。(4)超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定：采用黃嘌呤氧化法對SOD的活性進行檢測，SOD的活性以每mg組織蛋白中50%的SOD被抑制時所對應的SOD量作為一個亞硝酸鹽單位(U/mgPro)表示。(5)谷胱甘肽(GSH)活性檢測：由于巰基化合物和二硫代二硝基甲酸起反應時能產生一種化合物呈現出黃色，該化合物在412 nm處具有最大的吸收峰值，我們檢測這個吸光度值算出GSH的活性，該活性單位以mg/gPro表示[9]。

2 結果

2．1白藜蘆醇對AD合并DM大鼠的空間學習記憶能力的影響定位航行實驗結果顯示，在大鼠訓練的第1～3天，AD合并DM組平均上臺前所需要的時間(潛伏期)以及上臺前游泳的距離與其他3組相比無明顯差別(P>0.05，圖1)；第4天時，AD合并DM組平均上臺前所需要的時間及上臺前所游泳的距離明顯高于對照組(P<0.05，圖1)，而白藜蘆醇治療組上述指標變化程度均明顯低于模型組(P<0.05，圖1)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖1 定位航行實驗結果 A：各組在訓練的4 d中平均上臺潛伏期；B：各組在訓練的4 d中平均上臺前游泳的距離

空間搜索實驗結果顯示，實驗第5天時，撤除掉平臺后，AD合并DM組與對照組相比，第2象限中游泳的平均時間百分比和平均距離百分比均明顯降低(P<0.05，圖2)，但白藜蘆醇治療組在第二象限中無論是游泳的時間百分比還是游泳距離百分比均明顯高于模型組(P<0.05，圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 空間搜索實驗結果 A：各組在平臺所在象限中游泳的時間百分比；B：各組在平臺所在象限中游泳的距離百分比

2．2白藜蘆醇對AD合并DM大鼠皮質和海馬組織AchE、ChAT活性的影響模型組大鼠腦皮質和海馬組織內AchE活性均較對照組明顯升高(P<0.05表1)，ChAT的活性均較對照組明顯降低(P<0.05，表1)；白藜蘆醇治療組腦皮質和海馬組織內AchE活性均較AD合并DM組明顯降低(P<0.05，表1)，而ChAT的活性均較AD合并DM組明顯升高(P<0.05，表1)。

表1 白藜蘆醇對AD合并DM大鼠皮質、海馬AchE、ChAT活性的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2．3白藜蘆醇對AD合并DM大鼠模型的皮質和海馬MDA、SOD活性及GSH含量的影響AD合并DM組腦皮質和海馬組織內MDA含量與對照組相比明顯升高(P<0.05，表2)，SOD活性與對照組相比明顯降低(P<0.05，表2)，GSH含量與對照組相比也明顯降低(P<0.05，表2)；白藜蘆醇治療組腦皮質和海馬組織內MDA含量與AD合并DM組相比明顯降低(P<0.05，表2)，SOD活性與AD合并DM組相比明顯升高(P<0.05，表2)，GSH含量與AD合并DM組相比明顯升高(P<0.05，表2)。

表2 白藜蘆醇對AD合并DM大鼠皮質、海馬MDA、SOD及GSH活性影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

近年來，阿爾茨海默病和糖尿病的發病率逐漸增高，尤其是阿爾茨海默病，是一種和年齡相關性疾病，隨著人們年齡的逐漸增長，發病率也越來越高。流行病學研究發現，日本人群中65歲以上老年人阿爾茨海默病的患病率3.5%～5.8%；而西方國家阿爾茨海默病的患病率在85歲以上的人群中高達47%～50%。糖尿病的發病率也逐漸增高，國際糖尿病聯盟(IDF)最新數據顯示，全世界范圍內共有4.15億成年人糖尿病，比2013年增加了0.33億。研究證實，糖尿病是AD的一個非常重要的高危因素[10-12]，糖尿病患者并發阿爾茨海默病的風險也非常高，這兩種疾病往往并存于一個患者中。然而，目前針對糖尿病患者合并阿爾茨海默病的預防以及認知障礙的治療尚缺乏有效的措施。

白藜蘆醇是目前研究及應用較多的一類具有較強抗氧化、清除自由基等作用[4]的化合物，它在多種系統性疾病中均具有保護作用[1-6]。本實驗中，我們以氧化應激為指標，首次設想采用AD合并DM的大鼠模型研究白藜蘆醇對這兩種疾病并存的治療作用。結果發現，通過水迷宮試驗檢測表明，白藜蘆醇能明顯改善AD合并DM組大鼠受損的學習記憶功能(P<0.05)。

中樞膽堿能系統是大腦中與學習記憶關系密切的神經遞質，其核心是Ach。Ach是由于膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成的，由AchE進行分解，因此Ach在腦內含量的動態平衡是由ChAT和AchE共同維持的。阿爾茨海默病的一個標志性的生化特征是腦內ChAT活性下降，當腦內ChAT的活性下降而AchE的活性增高時就加速了Ach的分解，使腦內Ach的含量降低，進而使患者的學習記憶和認知能力下降[13]。本研究發現，白藜蘆醇治療組與AD合并DM模型組相比，大鼠腦皮質和海馬AchE的活性明顯降低，而ChAT的活性卻明顯升高(P<0.05)，提示白藜蘆醇能改善AD合并DM大鼠腦內Ach的含量。

在對糖尿病或阿爾茨海默病的發病機制研究中，氧化應激都具有重要的地位[14]。在阿爾茨海默病患者中，腦內的氧化應激和自由基可以使乙酰膽堿酯酶的活性受到抑制，提示阿爾茨海默病患者的衰老和癡呆可能與氧化應激相關。在糖尿病的發病中，研究也認為，胰島素抵抗和β細胞功能受損與氧化應激也是密切相關的。MDA是由氧自由基引起的一種氧化反應的代謝產物，其含量可反映體內生物膜不飽和脂肪酸的過氧化程度，從而間接地反映引起生物膜不飽和脂肪酸發生過氧化反應的氧自由基的水平[15]。SOD是生物體內最為重要的一種氧自由基清除酶，它可以通過催化O2-發生歧化反應清除體內所產成的氧自由基，所以人們可通過測定體內或組織內SOD的活性評估機體清除自由基的能力。GSH在機體內的作用主要是特異性催化還原型谷胱甘肽的還原反應，從而起到穩定細胞膜的結構和保護細胞功能的作用[16]。因此，在該研究中，我們對各組大鼠腦內MDA、SOD及GSH的含量均進行了詳細的檢測。既往研究發現，白藜蘆醇對單獨糖尿病大鼠腦內氧化應激有明顯的保護作用[17-19]。我們的研究表明，AD合并DM組大鼠腦皮質和海馬組織內MDA含量與對照組相比明顯升高，而SOD活性及GSH含量卻明顯降低(P<0.05)，白藜蘆醇治療后，大鼠腦皮質和海馬組織上述指標的變化程度均明顯降低(P<0.05)，提示白藜蘆醇可保護AD合并DM大鼠免遭氧化應激的損傷。

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EffectsofresveratrolonthememoryimpairmentandoxidativestressinratmodelofAlzheimer'sdiseasewithdiabetesmellitus

SUNZhikun*，MAXingrong，HANXiao，ZHANGQianlin，ZHANGJiewen

*DepartmentofNeurology，HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003，China

ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on memory impairment and oxidative stress in the rat model of Alzheimer's disease with diabetes mellitus．MethodsWe used the streptozotocin intraperitoneal injection and then Aβ1-40hippocampal injection to establish the Alzheimer's disease with diabetic rat model．The spatial learning and memory performance were tested by the Morris water maze，we also examined the activity of acetylcholinesterase (AchE)，choline acetyltransferase (ChAT)，malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in cortex and hippocampus．ResultsThe results showed that resveratrol could successfully inhibit the memory impairment，increase the ChAT，SOD and GSH activity，decrease the AchE and MDA activity in diabetic with Alzheimer's disease rat model．ConclusionResveratrol can protect the Alzheimer's disease with Diabetic rat model by decreasing memory impairment and oxidative stress．

Alzheimer’s disease；Resveratrol；Oxidative stress；Diabetes mellitus；Rats；Acetylcholinesterase(AchE)；Choline acetyltransferase(ChAT)；Malondialdehyde(MDA)；Superoxide dismutase(SOD)；Glutathione(GSH)

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.23.001

河南省醫學普通科技攻關資助項目(201503154)

△通信作者：張杰文(1965-)，男，博士，主任醫師。研究方向：癡呆與認知障礙。Email：zhangjiewen9900@126．com

R-332

A

1673-5110(2017)23-0001-05

(收稿2017-02-10)

夏保軍

信息：孫治坤，馬興榮，韓笑，等．白藜蘆醇對阿爾茨海默病合并糖尿病大鼠的氧化應激作用[J]．中國實用神經疾病雜志，2017，20(23)：1-5．