帕瑞昔布對(duì)腦缺血損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的研究

袁 峰 付紅光 孫 凱 董鐵立 楊鵬舉

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450014

·論著科研之窗·

帕瑞昔布對(duì)腦缺血損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的研究

袁 峰 付紅光 孫 凱 董鐵立 楊鵬舉△

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450014

線粒體ATP敏感性鉀離子通道；帕瑞昔布；腦缺血再灌注；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；大鼠

帕瑞昔布是新型的環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑，具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用。研究顯示[1]，帕瑞昔布可減少腦缺血再灌注時(shí)的神經(jīng)組織細(xì)胞損傷，但機(jī)制尚未明確。mitoKATP的激活在腦缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[2]。本研究旨在評(píng)價(jià)mitoKATP在帕瑞昔布減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量280～330 g，清潔級(jí)，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK(豫)2010—0002]。

1．1．2 主要試劑和耗材：帕瑞昔布(批號(hào)：N23160，Pfizer公司，America)；5-HD(批號(hào)：H50726，美國(guó)Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA細(xì)胞裂解液(美國(guó)Sigma公司)；PMSF蛋白酶抑制劑(德國(guó)Roche公司)；4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(北京索萊寶公司)；30%聚丙烯酰胺(美國(guó)Amresco公司)；兔抗Bcl-2多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗Bax多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；抗兔HRP標(biāo)記熒光二抗(美國(guó)Abcam公司)；24G動(dòng)脈留置針(日本美德醫(yī)療集團(tuán)supercath 5)；2838-A4型線栓(北京西濃科技有限公司)。

1．2方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：100只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組(S組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、帕瑞昔布組(P組)、 5-羥葵酸組(5-HD組)和5-羥葵酸+帕瑞昔布組(5-HD+P組)，每組20只。

1．2．2 模型制備：參照文獻(xiàn)[3]，采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為350 mg/kg。麻醉成功后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取頸部正中切口，分離至右側(cè)頸總動(dòng)脈、右側(cè)頸外動(dòng)脈和右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈。用3-0絲線分別縫扎右側(cè)頸外動(dòng)脈和右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端，小動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈。在距離右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處約5 mm處，用24 G的動(dòng)脈留置針穿刺頸總動(dòng)脈后，取線栓通過(guò)留置針進(jìn)入頸總動(dòng)脈后。松開(kāi)小動(dòng)脈夾，緩慢推進(jìn)線栓，輕輕插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，深度18～20 mm，妥善固定線栓。阻塞2 h后拔出線栓恢復(fù)灌注，縫合傷口。術(shù)中維持大鼠體溫為37 ℃左右，保留自主呼吸。S組僅切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，不置入線栓。P組于缺血前15 min和再灌注12 h經(jīng)陰莖背靜脈注射帕瑞昔布，4 mg/kg。5-HD組在缺血前1 h經(jīng)陰莖背靜脈注射5-HD，30 mg/kg。5-HD+P組在缺血前1 h經(jīng)陰莖背靜脈注射5-HD，30 mg/kg，余操作同P組。S組和I/R組給予等容量生理鹽水。

1．2．3 腦缺血再灌注：在腦缺血再灌注24 h時(shí)，參照文獻(xiàn)[4]采用盲法行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：無(wú)神經(jīng)癥狀=0分；提尾時(shí)損傷對(duì)側(cè)前肢不能伸直=1分；行走時(shí)向損傷對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)=2分；行走困難，并向損傷對(duì)側(cè)傾倒=3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)不清=4分。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠清醒后出現(xiàn)損傷對(duì)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時(shí)向損傷對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)為其判斷成功標(biāo)準(zhǔn)；0分、4分或死亡舍棄，并及時(shí)補(bǔ)充。

1．2．4 腦組織SOD和MDA的檢測(cè)：各組于神經(jīng)功能缺陷評(píng)分完成后，深麻醉后迅速斷頭處死，將右側(cè)大腦半球用冰冷生理鹽水沖洗。按1 g腦組織加入9 mL的生理鹽水，再將腦組織剪成組織小塊，倒入玻璃勻漿器中，上下充分研磨，制備成10%腦組織勻漿。取制備好的10%腦組織勻漿，用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟實(shí)施操作

1．2．5 Westen Blot檢測(cè)Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)：取制備好的10%腦組織勻漿，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。按100 μg蛋白/20 μL換算樣本勻漿上清液體積。取適量勻漿上清液，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，進(jìn)行免疫印跡操作，加入一抗置于4 ℃低溫過(guò)夜：Bcl-2 抗體(1：200)，Bax 抗體(1：1 000)，洗膜后再加入酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，再次洗膜，進(jìn)行ECL底物發(fā)光，最后對(duì)膜拍照，在凝膠成像分析系統(tǒng)上處理。蛋白的含量以條帶的OD值乘以面積表示，采用計(jì)算機(jī)軟件Image J分析結(jié)果。

2 結(jié)果

與S組相比，其余各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及MDA水平升高，SOD水平降低(P<0.05)；與I/R組相比，P組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分及MDA水平降低，SOD水平升高(P<0.05)；與P組相比，5-HD+P組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分分及MDA水平升高，SOD水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

與S組相比，其余各組大鼠的Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與I/R組相比，P組大鼠的Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與P組相比，5-HD+P組大鼠的Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、SOD及MDA水平比較

注：與S組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與P組比較，cP<0.05

表2 各組大鼠Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較

注：與S組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與P組比較，cP<0.05

3 討論

正常情況下，體內(nèi)的氧自由基生成和清除系統(tǒng)存在動(dòng)態(tài)平衡，可及時(shí)清除機(jī)體生成的氧自由基，使其不會(huì)損害組織細(xì)胞。SOD是十分重要的抗氧化酶之一，可清除氧自由基，其含量的高低可反映組織細(xì)胞缺血缺氧的程度[5-6]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，可評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的強(qiáng)弱，間接反映組織細(xì)胞損傷的程度[7]。本研究結(jié)果表明，與I/R組比較，P組中的SOD水平升高，MDA水平降低，說(shuō)明帕瑞昔布可抑制氧化應(yīng)激刺激，減輕腦缺血再灌注損傷，與相關(guān)研究結(jié)果[8]相似，提示Cox-2抑制劑不僅可減輕腦缺血后大鼠海馬氧化性損傷，且還可減輕缺血所致的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

研究證實(shí)，Bcl-2家族蛋白由促凋亡和抗凋亡蛋白構(gòu)成，其功能失調(diào)可以加重缺血性神經(jīng)元的損傷[9]。抗凋亡蛋白，Bcl-2蛋白有助于維持細(xì)胞膜的完整性，阻止細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，能夠促進(jìn)細(xì)胞的存活[10]。然而，促凋亡蛋白，Bax蛋白可誘導(dǎo)MPTP的開(kāi)放，促使細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果表明，與I/R組比較，P組中的Bcl-2蛋白含量升高，Bax蛋白含量降低，提示帕瑞昔布可增加抗凋亡蛋白的表達(dá)，降低促凋亡蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

線粒體在機(jī)體能量代謝方面起重要作用，是腦缺血缺氧損傷的關(guān)鍵部位之一。作為線粒體的重要靶點(diǎn)，mitoKATP的開(kāi)放可保護(hù)缺血缺氧的神經(jīng)組織細(xì)胞[12]。研究證實(shí)，七氟醚的腦保護(hù)作用是通過(guò)激活mitoKATP，若給予其通道阻斷劑5-HD，則可抑制七氟醚的腦保護(hù)作用[13]。本研究結(jié)果表明，在帕瑞昔布用藥前給予5-HD后，其SOD水平降低，MDA水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明mitoKATP關(guān)閉可抑制帕瑞昔布對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用，提示帕瑞昔布通過(guò)激活mitoKATP，使線粒體膜去極化，使氧自由基的生成減少[14]；抑制細(xì)胞色素C的釋放，減少Bax蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[15]，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。本研究?jī)H對(duì)帕瑞昔布在大鼠腦缺血再灌注24 h的觀察，尚未對(duì)再灌注其他時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究。關(guān)于帕瑞昔布的腦保護(hù)作用在腦缺血再灌注其他時(shí)間點(diǎn)的變化還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，帕瑞昔布通過(guò)增強(qiáng)氧自由基的清除、抵抗氧化應(yīng)激刺激及抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與激活線mitoKATP有關(guān)。

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Studyontheneuroprotectiveeffectsofparecoxiboncerebralischemiainjuryrats

YUANFeng，F(xiàn)UHongguang，SUNKai，DONGTieli，YANGPengju

DepartmentofAnesthesiology，theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014，China

ObjectiveTo evaluate the Role of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels in attenuation of cerebral ischemia-reperfusion injury by parecoxib in rats．MethodsOne hundred healthy male Sprague-Dawley rats，weighing 280g-330g，were randomly assigned into 5 groups (n=20 each) using a random number table：sham operation group (group S)；focal cerebral I/R group (group I/R)；parecoxib group (group P)；5-hydroxydecanoate group (group 5-HD)；5-hydroxydecanoate group+parecoxib group (group 5-HD+P)．Focal cerebral ischemia was produced by 2h right middle cerebral artery occlusion followed by reperfusion．Group P

parecoxib 4mg/kg intravenously 15min before ischemia and again at 12h during reperfusion，while group S and I/R received the equal volume of normal saline instead．In group 5-HD，5-HD 30 mg/kg was injected intravenously at 1h before ischemia．In group 5-HD+P，5-HD 30 mg/kg was injected intravenously at 1h before ischemia and the other procedures were similar to those previously described in group P．The neurological function deficit score (NDS) was evaluated in the 5 groups in 24h after reperfusion．Then the rats were sacrificed，and their brains were immediately removed for evaluation of the levels of super oxide dismutase (SOD)，malondialdehyde (MDA)，Bax protein and Bcl-2 protein．ResultsCompared with group S，the NDS，the levels of MDA and Bax protein increased，and the levels of SOD and Bxl-2 protein decreased in the other groups (P<0.05)．Compared with group I/R，the NDS，the levels of MDA and Bax protein decreased，and the levels of SOD and Bxl-2 protein increased in group P (P<0.05)．Compared with group P，the NDS，the levels of MDA and Bax protein increased，and the levels of SOD and Bxl-2 protein decreased in 5-HD+P (P<0.05)．ConclusionMitoKATP channels are involved in reduction of I/R-induced cerebral injury by parecoxib in rats．

Mitochondrial KATP channel；Parecoxib；Cerebral ischemia-reperfusion；Oxidative stress；Apoptosis；Rat

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.21.003

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(122300410403)

△ 通信作者：楊鵬舉(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師。研究方向：圍術(shù)期器官功能保護(hù)。Email：455275093@qq．com

目的評(píng)價(jià)線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mitoKATP)對(duì)帕瑞昔布減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法成年健康雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量280～330 g，隨機(jī)分成5組(n=20只)：假手術(shù)組(S組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、帕瑞昔布組(P組)、 5-羥葵酸組(5-HD組)和5-羥葵酸+帕瑞昔布組(5-HD+P組)。采用改良線栓法阻塞右側(cè)頸總動(dòng)脈2 h恢復(fù)灌注的方法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。P組在缺血前15 min和再灌注12 h經(jīng)靜脈注射帕瑞昔布，4 mg/kg。5-HD組在缺血前1 h經(jīng)靜脈注射5-HD，30 mg/kg。5-HD+P組在缺血前1 h經(jīng)靜脈注射5-HD，30 mg/kg，余操作同P組。S組和I/R組給予等容量生理鹽水。各組于再灌注24 h時(shí)，行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分后處死取腦，檢測(cè)SOD、MDA、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與S組相比，其余各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、MDA水平及Bax蛋白表達(dá)升高，SOD水平及Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與I/R組相比，P組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、MDA水平及Bax蛋白表達(dá)降低，SOD水平及Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與P組相比，5-HD+P組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、MDA水平及Bax蛋白表達(dá)升高，SOD水平及Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論mitoKATP通道參與了帕瑞昔布減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的過(guò)程。

R-332

A

1673-5110(2017)21-0012-04

(收稿2017-06-30)

關(guān)慧