破壁靈芝孢子粉對刀豆蛋白A誘導免疫損傷小鼠外周血CD4+和CD8+細胞因子水平的影響及護肝作用*

趙燕平 余亞平 胡 潔

浙江省中醫院下沙院區 浙江 杭州 310018

破壁靈芝孢子粉對刀豆蛋白A誘導免疫損傷小鼠外周血CD4+和CD8+細胞因子水平的影響及護肝作用*

趙燕平 余亞平 胡 潔

浙江省中醫院下沙院區 浙江 杭州 310018

破壁靈芝孢子粉 刀豆蛋白A 免疫損傷 小鼠

細胞水平抗病毒是目前臨床上治療慢性乙型肝炎（以下簡稱“慢乙肝”）的最有效手段，但現有抗病毒藥物只能抑制病毒而不能清除病毒[1]。目前的共識是，激活機體細胞免疫應答，特別是增強HBV特異性T淋巴細胞應答是打破HBV感染耐受、達到清除病毒的關鍵因素[2-3]，而中醫藥在慢乙肝免疫調控上具有獨特的優勢。破壁靈芝孢子粉是臨床和民間常用的提高正氣、增強免疫的珍貴中藥，筆者采用ConA誘導免疫肝損傷小鼠模型，觀察破壁靈芝孢子粉干預效果，探討破壁靈芝孢子粉的護肝作用及其可能的免疫調節機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：采用清潔級Balb/c雄性小鼠46只，體重20～30g，6～8周齡，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號[SCXK（滬）2013-2016]，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障環境內，使用許可證號[SYXK（浙）2013-0184]，環境溫度為23±1℃，相對濕度為50%～65%，飼喂全價營養顆粒飼料，自由飲水。

1.2 藥物和試劑：破壁靈芝孢子粉：購自壽仙谷藥業公司，使用時用生理鹽水調配成兩組濃度備用：低劑量組0.1g/ml、高劑量組0.2g/ml；刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司（C2010，批號80M7680V），使用時溶于生理鹽水；肝功能氨基轉移酶試劑購自德國DiaSysDiagnoticsSystemsGmbH(批號分別為07235/00002244、07218/00001951)；抗CD4FITC，抗CD8FITC熒光單克隆抗體：購自BD公司（批號分別為557303、553035）。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 分組造模與給藥：將46只Balb/c雄性小鼠正常飼養1周后隨機分為4組：空白組10只；模型組12只；低劑量破壁靈芝孢子粉組（低靈組）12只；高劑量破壁靈芝孢子粉組（高靈組）12只。空白組正常飼養。造模參考劉光偉等[4]的方法，模型組及低靈組、高靈組均用ConA 5mg/kg尾iv，隔天1次，共2周。造模成功后，空白組及模型組予生理鹽水0.1ml/10g ig，低靈組和高靈組分別用破逼靈芝孢子粉以1.0g/kg及2.0g/kg ig，共4周。

1.3.2 血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測：4周后摘眼球取血，檢測ALT、AST水平，由浙江中醫藥大學動物實驗中心協助完成。

1.3.3 外周血淋巴細胞亞群檢測：摘眼球取血，加入抗凝管，PBS緩沖液稀釋，加入淋巴細胞分離液，1800r/min，離心10min，吸取白色絮狀淋巴細胞層，PBS緩沖液洗滌2次，棄上清，加抗體試劑，流式檢測。

1.3.4 統計學方法：采用SPSS19.0軟件進行統計處理，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 破壁靈芝孢子粉對小鼠血清ALT、AST水平的影響：實驗過程中，由于灌胃操作失誤，導致高靈組死亡2只，低靈組死亡1只。破壁靈芝孢子粉干預后，小鼠ALT、AST水平較模型組明顯好轉，高靈組較低靈組好轉更明顯，差異有統計學意義。提示破壁靈芝孢子粉可以改善ConA誘導的免疫性肝損傷。具體見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST的比較（±s，U/L）

表1 各組小鼠血清ALT、AST的比較（±s，U/L）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低靈組比較，&P＜0.05。

AST 86.45±28.76 223.63±77.31*101.76±34.56#&134.38±42.67#組別空白組模型組高靈組低靈組只數10 12 10 11 ALT 67.45±23.46 201.78±62.47*92.76±33.78#&129.62±44.65#

2.2 破壁靈芝孢子粉對外周血淋巴細胞亞群的影響：與空白組比較，模型組小鼠CD4+%明顯上升、CD8+%明顯下降，藥物干預后，小鼠CD4+%下降、CD8+%上升，且在一定范圍內，藥物濃度越高，效果越明顯。具體見表2。

表2 各組外周血T細胞亞型的比較（±s）

表2 各組外周血T細胞亞型的比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低靈組比較，&P＜0.05。

CD4+/CD8+3.29±1.78 21.5±12.5*2.99±0.7#&11.57±7.5#組別空白組模型組高靈組低靈組只數10 12 10 11 CD4+%10.5±2.6 29.6±3.1*19.2±2.4#&22.1±4.4#CD8+%3.8±1.5 1.6±0.5*6.6±1.3#&3.42±1.2#

3 討論

慢乙肝的發病與機體的免疫功能紊亂密切相關，其中HBV特異性的CD4+和CD8+T細胞的低擴增和弱效應作用被確認為是其中最為關鍵的環節。CD4+T細胞因其具有輔助體液免疫和細胞免疫的功能被稱為輔助性T細胞，CD8+T細胞主要為細胞毒性T細胞（CTL），可以識別并殺傷HBV感染的細胞，因此CD4+/CD8+比值的改變可以直接反應機體細胞免疫的功能狀態。如果我們能通過藥物等手段調整T淋巴細胞亞群的失衡，減弱其免疫抑制功能，提高表位特異性CTL的免疫效應，將為慢乙肝的治療找到新的策略。

現有的免疫抑制劑如胸腺肽、治療性乙肝疫苗因存在療效不夠理想、價格昂貴、注射不便等原因導致臨床應用不多。近年來研究較多的Toll樣受體激動劑、CTL調節劑、TCR轉基因T細胞治療等[5-6]尚局限在動物實驗或小樣本臨床研究。中醫藥作為我國防治慢乙肝的重要措施，雖然在直接抑制病毒復制的近期療效方面與干擾素、核苷類似物存在一定差距，但在整體免疫調控上卻有著獨特的優勢，如豬苓多糖、香菇多糖、云芝多糖等藥物成分可以提高巨噬細胞吞噬功能，促進T淋巴細胞E玫瑰花結形成和轉化，激發機體產生多種與免疫和抗炎反應有關的生物活性因子，誘導干擾素產生[7]。因此研發出具有相關免疫調控作用的中藥，使其與直接抑制病毒復制的西藥聯合應用，將病因治療和病機治療有機地結合起來，就有可能從根本上提高療效。

靈芝，又稱“仙草”，是一種珍貴的藥用真菌，靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的淡霧狀的極其微小的孢子，含有比靈芝子實體更加豐富的多糖類、三萜類、脂肪酸類、氨基酸等活性成分，具有增強免疫、抗腫瘤、抗炎、保肝、抗病毒等功能，且破壁后的靈芝孢子粉效果更好[8]。臨床醫生及民間百姓也會將靈芝制劑用于慢乙肝、紅斑狼狼瘡、萎縮性肌強直、惡性腫瘤等免疫功能低下患者疾病的治療中[9]，但尚缺乏大樣本、系統化的研究。

ConA是誘導免疫性肝損傷的經典試劑，其機制與T細胞和KC細胞相關，與人類慢性肝炎發病機制非常相似[10]，我們以ConA誘導小鼠肝損傷為模型，模擬慢乙肝的免疫失衡狀態，觀察破壁靈芝孢子粉干預后的血清ALT、AST水平外周血T淋巴細胞亞群的變化。研究發現破壁靈芝孢子粉可以有效降低小鼠血清肝酶水平，下調小鼠外周血的CD4+T淋巴細胞百分比、而CD8+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯上升，說明破壁靈芝孢子粉可能通過調節T淋巴細胞亞群比例，減弱CD4+輔助性T細胞及相關效應細胞因子對機體的免疫抑制作用，促進CD8+T細胞增殖、增強CTL識別并滅殺感染細胞的作用，且隨著藥物劑量的增加，其護肝及免疫調節作用在一定范圍內有所提高。筆者預測破壁靈芝孢子粉可以通過調節T細胞亞群比例、提高CTL活性來幫助機體產生有效抗病毒免疫應答，提高抗病毒療效。今后我們也將更深入地研究破壁靈芝孢子粉的免疫調節機制及臨床療效，希望為實現慢乙肝的臨床治愈提供更多安全有效的藥物選擇。

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2017-08-17