柚皮素對3T3-L1和HepG2細胞胰島素抵抗模型葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性的影響*

王 元，曾凱宏,Δ，鄧 波，余雪梅，宋 怡，黃璐嬌，周 雪

1. 電子科技大學醫學院(成都 610054)；2. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院 臨床營養科(成都 610072)

·論著·

柚皮素對3T3-L1和HepG2細胞胰島素抵抗模型葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性的影響*

王 元1，曾凱宏1,2Δ，鄧 波2，余雪梅2，宋 怡2，黃璐嬌2，周 雪2

1. 電子科技大學醫學院(成都 610054)；2. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院 臨床營養科(成都 610072)

目的探討柚皮素(Naringenin，Nar)對3T3-L1和HepG2 細胞胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)模型葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性的影響。方法采用含0.5 mM IBMX 、1 μM 地塞米松、10 mg/L 胰島素的誘導液將3T3-L1細胞誘導分化為成熟脂肪細胞，采用高糖/高胰島素誘導建立3T3-L1和HepG2 細胞IR模型；按照空白組、正常組、IR模型組、對照藥物IR組以及不同濃度Nar干預IR組；以MTT法檢測細胞增殖；以葡萄糖氧化酶法(GOD)檢測細胞對葡萄糖的攝取量。結果與正常組細胞相比，3T3-L1和HepG2 IR模型組細胞增殖受到抑制、葡萄糖攝取量減少以及對胰島素敏感性減弱(P<0.001)；Nar干預IR模型組能明顯促進IR細胞的增殖，增加IR細胞的葡萄糖攝取和增強對胰島素的敏感性(P<0.001)。結論Nar對3T3-L1和HepG2 細胞IR模型葡萄糖攝取能力降低和胰島素敏感性改變有改善作用，可以作為防治IR的一種手段。

柚皮素；胰島素抵抗；細胞增殖；葡萄糖攝??；胰島素敏感性

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)的發病率呈逐年現上升趨勢，DM分為Ⅰ型DM(T1DM)和Ⅱ型DM(T2DM)，其中T2DM 占90%～ 95%[1]。胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)和胰島β細胞功能障礙是T2DM的兩大病理生理特征，機體組織(脂肪、肝臟、肌肉組織等)產生IR時靶細胞攝取和利用葡萄糖能力及對胰島素的敏感性降低[2]。柚皮素(Naringenin，Nar)是柚皮苷的苷元，屬于二氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物葡萄柚及柑橘類水果中，現已證實， Nar具有抗氧化、免疫調節、調節血糖及升高血漿胰島素濃度等作用[3]。但Nar對IR引起的細胞葡萄糖攝取和利用能力降低及對胰島素的敏感性改變的效用，目前在國內外尚無研究報道。本實驗以高糖/高胰島素誘導的小鼠前脂肪細胞(3T3-L1)和人肝癌細胞(HepG2)IR模型為研究對象，檢測Nar對兩種細胞IR模型細胞增殖、葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠前脂肪細胞(3T3-L1)和人肝癌細胞(HepG2)購自ATCC公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 Nar、羅格列酮購自BBI Life Science公司。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (IBMX)、地塞米松、胰島素均購自Sigma 公司， DMEM 培養基、胎牛血清(FBS) 購自 Gibco 公司，葡萄糖氧化酶法測定試劑盒(GOD)購于北京普利萊公司，噻唑藍(MTT)購于碧云天公司，油紅O染色試劑盒購于上海歌凡生物公司，其他試劑均為分析純級別，酶標儀型號為Thermo Fisher Multiskan FC酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1和HepG2細胞培養及3T3-L1細胞誘導分化 3T3-L1 和HepG2細胞在37 ℃、5% CO2恒濕的孵箱中培養，使用含10% FBS的高糖DMEM培養基，每 48 h 換培養液1次。將3T3-L1細胞誘導分化為成熟脂肪細胞的步驟如下:待細胞融合2 d后，加入含0.5 mM IBMX 、1 μM地塞米松、10 mg/L胰島素和10% FBS的高糖DMEM培養基培養48 h，換含10 mg/L胰島素和10% FBS的高糖 DMEM培養基培養48 h，換含10% FBS的高糖 DMEM培養基繼續培養，每48 h換1次培養液，誘導分化至8～14 d[4]。

1.2.2 3T3-L1成熟脂肪細胞的鑒定 將分化成熟的3T3-L1脂肪細胞去掉培養液，用 PBS洗3次，用10%多聚甲醛固定液固定15 min，再用PBS洗3次，以油紅O染色30 min，倒置顯微鏡下觀察染色結果，并拍攝圖片，若發現85%以上的細胞呈含脂滴狀態即誘導成功[4-5]。

1.2.3 建立3T3-L1和HepG2細胞IR模型 將生長狀態良好的細胞均勻接種在 96 孔板中。3T3-L1前脂肪細胞按照“1.2.1”的方法誘導分化為成熟的脂肪細胞，換含10% FBS的低糖DMEM培養基培養48 h，換入無血清的低糖DMEM培養基培養12 h，換入含100 nM胰島素、10% FBS的高糖DMEM培養基干預30 min，建立3T3-L1脂肪細胞IR模型[5]。待HepG2細胞生長穩定，換2% FBS低糖DMEM培養基培養12 h，換含100 nM胰島素、2% FBS的低糖DMEM培養基培養24 h，建立HepG2細胞IR模型[6]。

1.2.4 實驗分組 將兩種細胞均分為空白組(無細胞，只含DMEM培養基)、正常組(正常細胞，不加任何藥物，簡稱Nor組)、IR模型組(IR模型細胞，不加任何藥物，簡稱IR組)、對照藥物IR組(IR模型細胞，20 μg/mL羅格列酮，簡稱Con組)和不同濃度(12.5、25、50、75、100、150 μg/mL)Nar干預IR組，共6組，每組設6個復孔。各組做相應處理后，于培養箱內培養24 h。

1.2.5 檢測Nar對3T3-L1和HepG2細胞各組細胞增殖的影響 按照“1.2.4”所述方法進行干預后，每孔加MTT溶液10 μL，培養箱內孵育4 h，吸棄上清培養液，加DMSO 150 μL，振蕩30 min，用酶標儀于490 nm波長處測量OD值，以每孔OD值減去空白組OD值計算細胞增殖，實驗重復3次。

1.2.6 檢測Nar對 3T3-L1和 HepG2各組細胞葡萄糖攝取的影響 按照“1.2.4”所述方法進行干預后，吸棄上清培養液，每孔加100 μL含10% FBS低糖DMEM培養基培養1 h，用GOD法測定每孔內剩余葡萄糖含量，于酶標儀570 nm波長處測定 OD值，葡萄糖攝取量=空白組葡萄糖含量-每孔剩余葡萄糖含量，實驗重復3次。

1.2.7 檢測Nar對 3T3-L1和HepG2各組細胞胰島素敏感性的影響 按照“1.2.4”所述方法進行干預后，吸棄上清培養液，每孔加100 μL含100 nM胰島素、10% FBS低糖DMEM培養基培養1 h，按“1.2.6”所述方法測葡萄糖攝取量，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 3T3-L1成熟脂肪細胞的鑒定

3T3-L1細胞為貼壁細胞，呈長梭形，不聚團生長。誘導3T3-L1細胞8 d后，每孔中細胞均呈現典型的脂肪細胞表型，細胞中富含脂滴>85%，脂滴可被油紅染色。大部分3T3-L1細胞已被誘導為脂肪細胞，可用于進一步實驗(圖1)。

圖1 3T3-L1細胞光學顯微鏡圖片(×100)注：A：誘導前細胞形態；B：誘導后細胞形態；C：誘導后細胞油紅O染色

2.2 Nar 干預對 3T3-L1和HepG2細胞IR模型細胞增殖的影響

光學顯微鏡下，與正常3T3-L1脂肪細胞相比，3T3-L1 IR組細胞增殖降低，脂滴量減少，Nar干預能使IR細胞增殖，脂滴量增加。HepG2細胞呈多角形，并聚團生長，與正常HepG2細胞相比，HepG2 IR細胞團之間透亮的死亡細胞增多，細胞增殖減少，Nar干預能使IR組細胞團之間細胞死亡減少，細胞增殖明顯增加。

與正常組比較，3T3-L1 IR模型細胞的增殖受到明顯抑制(P<0.001)；與IR模型組比較，不同濃度Nar干預均促進3T3-L1 IR 模型細胞的增殖(P<0.001)，50 μg/mL和75 μg/mL Nar對3T3-L1 IR模型細胞的增殖效果最明顯。與正常組比較，HepG2細胞IR模型細胞增殖受到明顯抑制(P<0.001)；與IR模型組比較，不同濃度Nar干預均促進HepG2細胞IR模型細胞的增殖(P<0.001)，不同濃度Nar干預組之間對HepG2細胞IR模型細胞的增殖進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)(圖2～4)。

圖2 3T3-L1細胞油紅O染色光學顯微鏡圖片(×100)注：A：正常脂肪細胞；B：IR模型細胞；C：IR模型Nar干預細胞

圖3 HepG2細胞光學顯微鏡圖片(×100)注：A：正常細胞；B：IR模型細胞；C：IR模型Nar干預細胞

圖4 Nar 對3T3-L1和HepG2 IR模型細胞增殖的影響

注：A： Nar干預對3T3-L1 IR模型細胞增殖的影響；B：Nar干預對HepG2 IR模型細胞增殖的影響；與正常組比較，***P<0.001；與模型組比較，###P<0.001

2.3 Nar 干預對 3T3-L1細胞IR模型細胞葡萄糖攝取和胰島素敏感性的影響

通過未加胰島素的培養基里的葡萄糖攝取量來檢測Nar 干預對 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的影響，而加胰島素的培養基里的葡萄糖攝取量來檢測Nar 干預對 3T3-L1脂肪細胞的胰島素敏感性的影響。未加胰島素組中，與3T3-L1細胞正常組相比，IR模型組細胞葡萄糖攝取明顯降低(P<0.001)，Nar干預能使IR細胞葡萄糖攝取明顯增加(P<0.001)，其中75 μg/mL Nar干預組葡萄糖攝取增加最為明顯，且略高于對照組細胞葡萄糖攝取。加胰島素組中，與3T3-L1細胞正常組對比，IR模型組細胞對葡萄糖攝取明顯降低(P<0.001)；Nar干預能使IR細胞葡萄糖攝取明顯增加，其中25、50、75 μg/mL Nar干預組葡萄糖攝取增加最明顯(P<0.001)(圖5)。

圖5 Nar 對 3T3-L1 脂肪細胞葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性改變的影響

注：A：培養基中未加胰島素，測定葡萄糖攝取值，檢測不同濃度Nar 干預對 3T3-L1 IR模型葡萄糖攝取能力的影響；B：培養基中加胰島素，測定葡萄糖攝取值，檢測不同濃度Nar干預對 3T3-L1 IR模型胰島素敏感性改變的影響結果； 與正常組比較，***P<0.001；與模型組比較，###P<0.001

2.4 Nar 干預對HepG2細胞IR細胞模型細胞葡萄糖攝取和胰島素敏感性的影響

通過未加胰島素的培養基里的葡萄糖攝取量來檢測Nar 干預對HepG2細胞葡萄糖攝取的影響，而加胰島素的培養基里的葡萄糖攝取量來檢測Nar 干預對HepG2細胞的胰島素敏感性的影響。未加胰島素組中，與HepG2細胞正常組相比，IR模型組細胞葡萄糖攝取明顯降低(P<0.001)，Nar干預能使IR細胞葡萄糖攝取明顯增加(P<0.001)，其中25、50 μg/mL Nar干預組葡萄糖攝取增加最明顯，且略高于對照組細胞葡萄糖攝取。加胰島素組中，與HepG2細胞正常組對比，IR模型組細胞對葡萄糖攝取明顯降低(P<0.001)；Nar干預能使IR細胞葡萄糖攝取明顯增加，其中50 μg/mL Nar干預組葡萄糖攝取增加最明顯(P<0.001)(圖6)。

圖6 Nar 對HepG2細胞葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性改變的影響

注：A：在培養基中未加胰島素，測定葡萄糖攝取值，檢測不同濃度Nar干預對HepG2 IR模型葡萄糖攝取能力的影響；B：在培養基中加胰島素，測定葡萄糖攝取值，檢測不同濃度Nar干預對HepG2 IR模型胰島素敏感性的影響；與正常組比較，***P<0.001；與模型組比較，###P<0.001

3 討論

據文獻[7]報道，近年全球T2DM的發病率呈逐漸上升趨勢，并且由T2DM誘發的并發癥患者人數也在逐年增加，因此，探索防護T2DM的方法已成為臨床關注的熱點問題之一。Nar是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物， 具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤等多種藥理活性，顯示出豐富的資源優勢和巨大的潛在利用價值。有研究[8]發現，膳食補充Nar可以明顯降低STZ誘導的DM小鼠的空腹血糖和血漿的糖化血紅蛋白值，明顯升高糖尿病小鼠血漿中胰島素濃度；可降低血漿中ALT、AST、 ALP、LDH值，可以改善STZ誘導的DM小鼠的炎癥反應[9]。并且，有研究[10]表明，在L6肌肉細胞中Nar通過激活AMPK磷酸化從而增加葡萄糖攝取。但是，目前還未有關Nar對3T3-L1脂肪細胞IR細胞模型的研究報道。

綜上所述，本研究采用高糖/高胰島素成功誘導3T3-L1和HepG2 細胞IR細胞模型，以不同濃度的Nar對誘導成功的IR細胞模型進行干預，發現Har對3T3-L1成熟脂肪細胞和HepG2 細胞IR模型細胞有促進增殖作用，并且能促進3T3-L1成熟脂肪細胞和HepG2 細胞IR模型細胞的葡萄糖攝取和增加胰島素的敏感性，其中25、50、70 μg/mL Nar對3T3-L1和HepG2 細胞IR模型的葡萄糖攝取和胰島素敏感性的促進作用最為理想。本研究證實，Nar通過緩解IR機制，在改善由于機體產生IR的糖代謝紊亂方面可以起到一定的改善效果，為進一步研究Nar對抗IR機制做了前期鋪墊，可能成為今后防治T2DM IR機制的常用手段。

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TheEffectofNaringeninonGlucoseUptakeandInsulinSensitivityintheInsulinResistanceModelsof3T3-L1AdipocytesandHepG2Cells

WangYuan1,ZengKaiHong1, 2Δ,DengBo2,YuXueMei2,SongYi2,HuangLuJiao2,ZhouXue2.

1.SchoolofMedicine,UniversityofElectronicScienceandTechnologyofChina,Chengdu610054,China; 2.DepartmentofClinicalNutrition,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China

ObjectiveTo investigate the effect of naringenin (Nar) on glucose uptake and insulin sensitivity in the insulin resistance (IR) models of 3T3-L1 adipocytes and HepG2 cells.MethodsThe 3T3-L1 cells were treated with 0.5 mM IBMX, 1μM dexamethasone and 10mg/L insulin to induce mature adipocytes. The IR models of 3T3-L1 adipocytes and HepG2 cells were induced and established by high glucose and high insulin. Then the cells were divided into the blank group, normal control group, IR model group, IR control group with drugs and IR groups with different concentrations of Nar. The cell proliferation was detected by the MTT method and the glucose uptake was detected by the glucose oxidase (GOD) method.ResultsCompared with the normal control group, the cell proliferation, glucose uptake and insulin sensitivity decreased significantly in the IR model of 3T3-L1 adipocytes and HepG2 cells (P<0.001), and the Nar intervention significantly increased their cell proliferation, glucose uptake and insulin sensitivity (P<0.001).ConclusionThe Nar intervention is an effective method in preventing the insulin resistance of 3T3-L1 adipocytes and HepG2 cells by improving their cell proliferation, glucose uptake and insulin sensitivity.

Naringenin; Insulin resistance; Cell proliferation; Glucose uptake; Insulin sensitivity

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171108.0841.014.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.06.001

R587.1

A

國家自然科學基金項目(No:81202206)；四川省衛生計生委項目(No:150216)

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曾凱宏，E-mail:zengkaihong2013@hotmail.com