長效重組鏈激酶(r-SK-PEG結合物)對大鼠急性肺栓塞動脈血氣、細胞因子的影響*

余 林，孟 堯，李萬成，張 維，姜 軼，周夏飛，金家貴△

1.成都醫學院第一附屬醫院 呼吸內科(成都610500)；2.成都醫學院 (成都610500)

·論著·

長效重組鏈激酶(r-SK-PEG結合物)對大鼠急性肺栓塞動脈血氣、細胞因子的影響*

余 林1，孟 堯2，李萬成1，張 維1，姜 軼1，周夏飛1，金家貴2△

1.成都醫學院第一附屬醫院 呼吸內科(成都610500)；2.成都醫學院 (成都610500)

目的觀察長效重組鏈激酶(r-SK-PEG結合物)對大鼠急性肺栓塞(PTE)動脈血氣、肺動脈壓和細胞因子的影響。方法將160只SD雄性大鼠隨機分為4組：假手術組(Ⅰ組)、肺栓塞組(Ⅱ組)、低分子肝素組(Ⅲ組)和長效重組鏈激酶組(Ⅳ組)，每組各40只，采用自體血栓回輸法建立PTE模型，造模成功后，Ⅰ組和Ⅱ組分別靜脈滴注生理鹽水，Ⅲ組皮下注射低分子肝素，Ⅳ組靜脈點滴r-SK-PEG結合物，連續給藥7 d，給藥后1、3、6 h和1、3、5 d進行肺動脈壓(mPAP)、右心室壓力(RVP)、動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)及內皮素(ET-1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、一氧化氮(NO)測定。結果Ⅳ組治療后6 h和1、3 d的mPAP明顯低于Ⅱ組(P<0.05)，PaO2明顯高于Ⅲ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后6 h、1 d的mPAP明顯低于Ⅲ組(P<0.05),RVP明顯低于Ⅱ組、Ⅲ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后6 h和1、3、5 d的PaO2明顯高于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后3、6 h的ET-1明顯高于Ⅱ組、Ⅲ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后1、3、5 d的MMP-9明顯低于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后3、6 h和1、3、5 d的NO明顯高于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后3、6 h的NO明顯高于Ⅲ組(P<0.05)。結論PTE采用r-SK-PEG結合物治療,能更加迅速緩解呼吸困難、糾正低氧血癥、降低肺動脈壓力和改善血管內皮功能。

r-SK-PEG結合物；急性肺栓塞；血氣；細胞因子

肺栓塞(PE)是由于體循環的各種栓子脫落，阻塞肺動脈及其分支，引起肺循環障礙的臨床病理生理綜合征。最常見的栓子為血栓，由血栓引起的PE也稱肺血栓栓塞，主要表現為患者突然發生不明原因的虛脫、面色蒼白、出冷汗、呼吸困難者、胸痛、咳嗽等，并有腦缺氧癥狀，如極度焦慮不安、倦怠、惡心、抽搐和昏迷。

溶栓酶或鏈球菌激酶(streptokinase,SK)是從β-溶血性鏈球菌培養液中提純精制而成的一種高純度酶，白色或類白色凍干粉，易溶于水及生理鹽水，具有促進體內纖維蛋白溶解系統的活力，使纖維蛋白溶酶原轉變為活性的纖維蛋白溶酶，引進血栓內部崩解和血栓表面溶解[1-3]。重組鏈激酶(recombinant streptokinase, r-SK)來源于含有高效表達鏈激酶基因的大腸桿菌，經發酵、分離和高度純化后凍干制成，可用于防治急性心肌梗死、腦梗塞、深部靜脈血栓和肺栓塞[4-5]，還適用于防治動脈栓塞、分流梗阻和胸膜黏連[6-7]，可以使心、肺功能保持正常，神經系統的后遺癥完全消失或大部分消失等[8]。然而，與其他抗血栓藥物類似，其存在的問題就是它們屬于異源蛋白，在人體內多次使用后會產生一定的免疫反應、毒副作用和半衰期短等[9]。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是FDA認可的用于修飾蛋白藥物的高分子親水化合物，本身無毒性，且有著很好的生物相容性，與蛋白質藥物結合后可獲得下述有利性質：1)溶解度提高；2)免疫原性降低或消除；3)被水解酶降解的可能性減小；4)被腎臟清除的速率降低；5)藥物體內分布和動力學行為改變；6)貯存穩定性提高。長效重組鏈激酶(r-SK-PEG結合物)是采用系列分子量(10、20、40 kDa)的單甲氧基聚乙二醇2-賴氨酸-N-羥基琥珀酰亞胺[(mPEG)2-Lys-NHS]對SK進行化學修飾獲得的，除本項目組外，尚未發現其他學者有r-SK-PEG結合物在動物體內的藥效研究報道。本研究觀察r-SK-PEG結合物對大鼠急性肺栓塞(PTE)血氣、細胞因子的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

將160只SD雄性大鼠(3～4周齡，體質量230～280 g，購自四川大學實驗動物中心)，按順序編號，采用SPSS 19.0產生隨機數字，按編號將大鼠隨機分為4組：假手術組(Ⅰ組)、肺栓塞組(Ⅱ組)、低分子肝素組(Ⅲ組)和長效重組鏈激酶組(Ⅳ組)，每組各40只。

1.2 大鼠自體血栓制備

將大鼠尾巴浸泡于45～50 ℃熱水中數分鐘，或者使用酒精和二甲苯反復涂擦尾巴，使血管擴張，剪掉尾尖5～10 mm，置于試管內，自尾根部向尾尖按摩，使血液流入試管。靜置，待其凝固后，再置于70 ℃水浴內10 min，倒入消毒平皿，將其切成1.1 mm×2.0 mm血栓栓子，使用生理鹽水沖洗3遍，再置于試管內，加入2 mL生理鹽水，冷藏備用。

1.3 動物模型建立

實驗大鼠均采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部剪毛消毒,作正中縱行切口,分離右側頸內靜脈,插入導管針至肺動脈，勻速、緩慢注入已制備的血栓20～30 個，縫合切口，建立PTE模型。

1.4 給藥方法

實驗大鼠均采用架式籠飼養，5只1籠，室內溫度保持在(22±2)℃，濕度保持50%～60%，光照和黑暗各12 h交替下，喂養標準顆粒飼料，飲水為自來水。Ⅰ組和Ⅱ組分別靜脈滴注生理鹽水，Ⅲ組皮下注射低分子肝素0.01 mL/kg，Ⅳ組靜脈滴注r-SK-PEG結合物150 萬IU/kg，1 h內滴完，連續給藥7 d。術后大鼠自由進食水。

1.5 數據采集

1)給藥后1、3、6 h和1、3、5 d，采用右心導管法測定肺動脈壓(mPAP)及右心室壓力(RVP)。2)給藥后1、3、6 h和1、3、5 d行大鼠頸總動脈插管，取動脈血1 mL測定血氣指標[動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)]。3)給藥后1、3、6 h和1、3、5 d行大鼠頸總動脈插管，取動脈血1 mL，采用放射免疫法測定內皮素(ET-1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和一氧化氮(NO)。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 PTE大鼠模型制作情況

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組大鼠采用自體血栓回輸法建立PTE模型，術后1～2 h共死亡5只，其中，Ⅱ組2只、Ⅲ組2只、Ⅳ組1只，制成PTE模型共115只，成功率為95.83%(115/120)。

2.2 不同組別不同時間點mPAP比較

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后mPAP均明顯升高(P<0.05)，Ⅳ組治療后6 h和1、3 d的mPAP明顯低于Ⅱ組(P<0.05)，而Ⅲ組治療3 d后mPAP才明顯低于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅳ組治療后6 h、1 d的mPAP明顯低于Ⅲ組(P<0.05)(表1)。

表1 不同組別不同時間點mPAP比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，△P<0.05；與Ⅲ組比較，&P<0.05

2.3 不同組別不同時間點RVP比較

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后RVP均明顯升高(P<0.05)，Ⅳ組治療后6 h、1 d的RVP明顯低于Ⅱ組、Ⅲ組(P<0.05)(表2)。

表2 不同組別不同時間點RVP比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，△P<0.05；與Ⅲ組比較，&P<0.05

2.4 不同組別不同時間點血氣指標比較

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后PaO2明顯下降(P<0.05)，Ⅳ組治療后6 h和1、3、5 d的PaO2明顯高于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅲ組治療后3、5 d的PaO2明顯高于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅳ組治療后6 h和1、3 d的PaO2明顯高于Ⅲ組(P<0.05)(表3～4)。

表3 不同組別不同時間點PaO2比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，△P<0.05；與Ⅲ組比較，&P<0.05

表4 不同組別不同時間點PaCO2比較

2.5 不同組別不同時間點ET-1比較

Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后ET-1明顯升高(P<0.05)，Ⅳ組治療后3、6 h的ET-1明顯高于Ⅱ組、Ⅲ組(P<0.05)(表5)。

表5 不同組別不同時間點ET-1比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，△P<0.05；與Ⅲ組比較，&P<0.05

2.6 不同組別不同時間點MMP-9比較

Ⅳ組治療后1、3、5 d的MMP-9明顯低于Ⅱ組(P<0.05)，而Ⅲ組治療后3、5 d的MMP-9才明顯低于Ⅱ組(P<0.05)(表6)。

表6 不同組別不同時間點MMP-9比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，△P<0.05

2.7 不同組別不同時間點NO比較

Ⅳ組治療后3、6 h和1、3、5 d的NO明顯高于Ⅱ組(P<0.05)，而Ⅲ組治療后6 h和1、3、5 d的NO明顯高于Ⅱ組(P<0.05)，Ⅳ組治療后3、6 h的NO明顯高于Ⅲ組(P<0.05)(表7)。

表7 不同組別不同時間點NO比較

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05；與Ⅱ組比較，△P<0.05；與Ⅲ組比較，&P<0.05

3 討論

肺血栓栓塞癥是內源性或外源性血栓栓子栓塞肺動脈或其分支所致，以氣體交換障礙為最主要的病理生理改變，是由于血流阻塞引起肺泡死腔量增大，出現低氧血癥，表現為PaO2明顯下降和PaCO2明顯升高，肺部氣體交換異常與栓子的大小、性質、阻塞程度等因素有關。PTE是一種高發病率、病死率和致殘率的疾病，早期發現并予以積極治療，能有效改善臨床預后，血氣分析的變化對PTE早期診斷有較大的臨床價值。

肺部血栓形成導致肺血管內皮受損，剌激血管內皮細胞釋放多種縮血管物質，引起血管收縮，導致肺循環阻力增加，使肺動脈壓力升高。其中，ET-1具有強烈的血管收縮作用，NO具有引起血管擴張的作用，二者均為血管內皮細胞分泌的重要血管活性物質，在PTE發病過程中起十分重要的作用，并可能是影響PTE預后的重要因素之一[10],可引起患者血流動力學改變和氣體交換異常。另外，ET-1能夠促進肺血管平滑肌細胞增殖，參與肺動脈高壓的肺血管重構過程。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類以Zn2+為輔助因子的蛋白酶家族，其中，MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，其產生與FGF、VEGF等細胞因子及IL-1、TNF-a等炎性因子有關，缺血缺氧條件下的產生也會大量增加[11]。MMPs/基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)系統失衡在肺動脈高壓形成過程中起重要作用，且對PTE后肺動脈內膜增生也發揮重要作用[12]。

目前，溶栓、抗凝治療是治療PTE的有效方法。溶栓治療可迅速溶解部分或全部血栓，解除肺動脈栓塞，降低肺動脈阻力，減輕肺動脈高壓，而溶栓治療后一段時間，存在著繼發血栓形成而重新堵塞血管的危險，因此，需再配合抗凝治療，防止血栓的延伸，并依靠機體自身的纖維蛋白溶解系統溶解已形成的血栓[13-14]。鏈激酶是臨床常用的溶栓藥物，r-SK是利用重組技術制成的新型非纖維蛋白特異性溶栓藥物，但因其異源蛋白，在人體內多次使用后會產生一定的免疫反應、毒副作用和半衰期短等，采用系列分子量(10、20、40 kDa)的(mPEG)2-Lys-NHS對SK進行化學修飾，能有效降低或消除免疫原性。本研究首創觀察r-SK-PEG結合物在治療大鼠PTE中的應用效果。

本研究結果顯示，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后PaO2明顯下降，Ⅳ組治療后6 h和1、3、5 d的PaO2明顯高于Ⅱ組，Ⅲ組治療后3、5 d的PaO2明顯高于Ⅱ組，Ⅳ組治療后6 h和1、3 d的PaO2明顯高于Ⅲ組，表明血氣分析的變化對PTE的早期診斷有較大的臨床價值[15]。采用低分子肝素或r-SK-PEG結合物均能有效改善血氣指標，但r-SK-PEG結合物改善速度更快，且效果優于低分子肝素，這是由于低分子肝素能夠阻止繼發血栓形成，從而改善血管內皮功能，降低肺循環阻力及肺動脈壓力，進而改善動脈血氣，而r-SK-PEG結合物能使栓子溶解或部分溶解后，更好地改善肺臟血液循環，對氧和改善效果更好。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后mPAP均明顯升高，Ⅳ組治療后6 h和1、3 d的mPAP明顯低于Ⅱ組，而Ⅲ組治療3 d后mPAP才明顯低于Ⅱ組，Ⅳ組治療后6 h、1 d的mPAP明顯低于Ⅲ組；Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后RVP均明顯升高，Ⅳ組治療后6 h、1 d的RVP明顯低于Ⅱ組、Ⅲ組。由此表明，低分子肝素或r-SK-PEG結合物均能有效地減輕肺動脈壓力升高，但是r-SK-PEG結合物能更迅速地部分解除肺動脈機械性阻塞，降低肺動脈壓力的速度更快，對于PTE尤其是生命垂危的患者具有更好的臨床獲益。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后ET-1明顯升高，NO明顯降低，提示PTE存在血管內皮功能障礙[16]。血栓形成可引起血管內皮損傷，內皮細胞釋放的ET-1增加，NO產生減少，內皮功能障礙又可使堵塞部位的血管痙攣，導致肺動脈內壓力上升。Ⅳ組治療后3、6 h的ET-1明顯高于Ⅱ組、Ⅲ組，這可能是由于血管再通導致ET-1升高所致[17]，r-SK-PEG結合物溶栓后栓子脫落，造成血管壁損傷，刺激血管內皮細胞合成釋放ET-1增加，另外，血管再通引起的再灌注損傷可加重內皮細胞損傷，積蓄的ET-1迅速代謝并大量釋放入血。Ⅳ組治療后3、6 h和1、3、5 d的NO明顯高于Ⅱ組，而Ⅲ組治療后6 h和1、3、5 d的NO明顯高于Ⅱ組，Ⅳ組治療后3、6 h的NO明顯高于Ⅲ組,表明r-SK-PEG結合物能增加內源性NO的合成，有效保護血管內皮功能。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組造模后MMP-9明顯升高，Ⅳ組治療后1、3、5 d的MMP-9明顯低于Ⅱ組，而Ⅲ組治療后3、5 d的MMP-9才明顯低于Ⅱ組。這是由于栓塞局部血流由層流變為湍流，局部血管壁所受剪切力明顯升高，導致局部的MMP-9明顯增加[18]，r-SK-PEG結合物溶栓治療能使血管內栓子快速溶解，肺泡滲出及間質炎性細胞浸潤明顯減輕，從而減少MMP-9的表達。

綜上所述，PTE采用r-SK-PEG結合物治療，能更加迅速地緩解呼吸困難、糾正低氧血癥、降低肺動脈壓力和改善血管內皮功能。

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TheEffectofLong-actingRecombinantStreptokinase(r-SK-PEGConjugates)ontheArterialBloodGasandCytokinesinRatswithAcutePulmonaryEmbolism

YuLin1,MengYao2,LiWancheng1,ZhangWei1,JiangYi1,ZhouXiafei1,JinJiagui2△.

1.DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo investigate the effect of long-acting recombinant streptokinase (r-SK-PEG conjugates) on the arterial blood gas, pulmonary artery pressure, and cytokines in rats with acute pulmonary embolism (PTE).Methods160 male SD rats were divided randomly into four groups including the sham operation group (Group I), pulmonary embolism group (Group II), low molecular weight heparin group (Group III), long-acting recombinant streptokinase group (Group IV), and each group consisted of 40 rats. The model of acute pulmonary embolism was established by the autologous thrombosis method. The model rats of Group I and II were treated with the intravenous infusion of normal saline, those of Group III were given subcutaneously with low molecular weight heparin, and those of Group IV were treated with the intravenous drip of long-acting recombinant streptokinase. The treatment lasted for 7 days in all the groups. The mean pressure of pulmonary artery (mPAP), right ventricular pressure (RVP), arterial partial pressure of oxygen (PaO2), partial pressure of carbon dioxide (PaCO2), Endothelin-1 (ET-1), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and nitric oxide (NO) were detected after being administered for 1h, 3h, 6h, 1d, 3d and 5d respectively.ResultsAfter being administered for 6h, 1d and 3d, the mPAP level of Group IV was significantly lower than that of Group II (P<0.05) and the PaO2level of Group IV was significantly higher than that of Group III (P<0.05). After being administered for 6h and 1d, the mPAP level of Group IV was significantly lower than that of Group III (P<0.05) and the RVP level was significantly lower in Group IV than in Group II and III respectively (P<0.05). After being treated for 6h, 1d, 3d and 5d, the PaO2level of Group IV was significantly higher than that of Group II (P<0.05). The ET-1 level was significantly higher in Group IV than in Group II and III respectively (P<0.05). The level of MMP-9 was significantly lower in Group IV than in Group II after being treated for 1d, 3d and 5d respectively (P<0.05). The NO level of Group IV was significantly higher than that of Group II after being treated for 3h, 6h, 1d, 3d and 5d respectively (P<0.05) and that of Group II after being treated for 3h and 6h respectively .ConclusionThe long-acting recombinant streptokinase (r-SK-PEG conjugates) can alleviate the dyspnea more quickly, correct the hypoxemia, reduce the pulmonary artery pressure and improve the vascular endothelial function in the treatment of acute pulmonary embolism.

r-SK-PEG conjugate; Acute pulmonary embolism; Blood gas; Cytokine

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171108.0841.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.06.002

R563.5

A

四川省教育廳基金項目(No:17ZB0134)

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金家貴，E-mail：jinjiagui2014@126.com