迪康凝膠對大鼠燙傷創面的治療作用及可能機制研究*

崔博慧，李 龍，黃凌遠，羅 丹，趙嬋娟，孫小青，牟妍希，王志軍△

1.大連大學整形外科研究所(大連 116021); 2.成都里來生物科技有限公司(成都 610000); 3.四川大學華西第二醫院(成都 610000)

·論著·

迪康凝膠對大鼠燙傷創面的治療作用及可能機制研究*

崔博慧1，李 龍1，黃凌遠2，羅 丹2，趙嬋娟3，孫小青1，牟妍希1，王志軍1△

1.大連大學整形外科研究所(大連 116021); 2.成都里來生物科技有限公司(成都 610000); 3.四川大學華西第二醫院(成都 610000)

目的探討迪康凝膠對燙傷大鼠創面愈合的效果及作用機制。方法將SD大鼠隨機分為模型組、美寶燙傷膏組、迪康凝膠組，3組均采用超級控溫燙傷儀，造背部深Ⅱ度燙傷。模型組不給藥，其余給藥1次/d，連續21 d。連續考察21 d內創面愈合情況及創面病理組織形態。ELISA法檢測組織TNF-α和IL-8及Ⅰ、Ⅲ型膠原。RT-PCR檢測組織TNF-α和IL-8表達水平。結果與模型組比較，迪康凝膠組愈合時間縮短(P<0.05，P<0.01)，創傷愈合率增高(P<0.05，P<0.01)，差異有統計學意義。組織學觀察證明，迪康凝膠具有良好的組織損傷修復作用。ELISA檢測表明，燙傷后兩藥物組創面組織TNF-α和IL-8含量均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)；而膠原Ⅰ、Ⅲ組織含量均高于模型組。RT-PCR檢測表明，兩藥物組組織TNF-α mRNA和IL-8 mRNA表達水平均與其蛋白濃度水平基本一致。結論迪康凝膠能促進大鼠皮膚燙傷后創面愈合，是治療燙傷創面的有效藥物。

迪康凝膠；美寶燙傷膏；燙傷；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原；TNF-α；IL-8；大鼠

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 采用清潔級雄性SD大鼠81只，體質量(220±15)g，購于成都達碩實驗動物有限公司。生產許可證號：SCXK(川2013-24)，使用許可證號：SYXK(川2014-189)。(25±2)℃室溫下，暫養1周后開始試驗，試驗期間，自由采食、飲水。

1.1.2 藥物 美寶燙傷膏：上海美寶生命科技有限公司；迪康凝膠：成都迪康藥業有限公司。

1.1.3 主要試劑 大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測試劑盒，大鼠白介素-8(IL-8)ELISA檢測試劑盒，大鼠膠原Ⅰ型、Ⅲ型ELISA檢測試劑盒，購于上海鑫樂；總RNA抽提試劑(Invitrogen)；多聚甲醛、伊紅液、蘇木素(AR級)。

1.1.4 主要儀器 Multlskan酶標儀(賽默飛世爾)，實時熒光定量(RT-PCR)儀(Thermo Fisher)，低溫離心機C2500(湖南湘儀實驗儀器)，轉輪式切片機(徠卡-2016，德國)，BMJ-Ⅲ型包埋機(中威電子)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(中威電子)，SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌器(上海宜川)，BN-200高精密電子天平(臺灣巨林櫻花)等。

1.2 方法

1.2.1 動物建模 采用8%硫化鈉溶液，燙傷前1 d將大鼠背毛脫去。造模前，先用10%水合氯醛，按3 mL/kg劑量腹腔注射麻醉，再固定于超級控溫燙傷儀。將大鼠背向上，采用0.5 kg壓力、80 ℃，燙傷20 s，經組織病理驗證深Ⅱ度燙傷造模成功，每只鼠造4個燙傷創面[9]。單籠飼養，頸部使用膠帶固定，防止大鼠舔舐藥物。

1.2.2 實驗動物分組及處理 大鼠隨機分為3組：燙傷模型組(自然愈合)、美寶燙傷膏組、迪康凝膠組，每組24只。隨機分組方式為：首先將72只大鼠依次編號，在excle中輸入相應編號，利用Rand函數對每個編號隨機生成對應數值[10]，升序排列，每24個依次的隨機編號對應的大鼠作為1組。模型組不給藥，使其自然愈合；藥物組造模當天開始給藥，連續21 d，1次/d。取健康大鼠共9只，不燙傷，分別于3、7、14 d，每個時間點處死3只，作為組織病理正常對照組。

1.2.3 大鼠創面愈合情況觀察 觀察創面愈合情況，包括結痂、脫痂、愈合時間及眼觀傷口恢復情況。對結痂、脫痂的判定，參考楊明等[11](2014)報道方法。

1.2.4 創面愈合率的測定 造模后第1、3、7、14、21 天，每組隨機取3只大鼠，采用透明膜描記稱量法[12]，利用描繪創面的透明硫酸紙的質量與面積比例換算，考察創面愈合率。

11月18日，亞太經合組織第二十六次領導人非正式會議在巴布亞新幾內亞莫爾茲比港舉行。會議的主題是“把握包容性機遇，擁抱數字化未來”。國家主席習近平出席并發表題為《把握時代機遇共謀亞太繁榮》的重要講話。

1.2.5 病理組織學觀察 造模后第3、7、14天，每個時間點分別處死“1.2.4”各組大鼠3只及組織病理正常對照組大鼠3只。取燙傷部位全層皮膚，按常規方法制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察。

1.2.6 組織TNF-α和IL-8水平 取“1.2.5”處死大鼠，收集傷口中心及周圍去痂全層皮膚，稱重剪碎，無菌生理鹽水10倍稀釋，勻漿。4 ℃，3 000 rpm離心15 min，收集上清備用，參考說明書，檢測大鼠皮膚組織TNF-α和IL-8含量。

1.2.7 組織Ⅰ、Ⅲ型膠原檢測 取“1.2.6”上清樣本，依照鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原ELISA試劑盒操作說明檢測樣本。

1.2.8 RT-PCR檢測組織TNF-α和IL-8表達水平 第6、12小時和第1、3、7、14天取上述實驗中所處死大鼠的創面中心處及周圍皮膚組織，提取大鼠總RNA，檢測A260和A280吸光度值，電泳確定RNA的完整性后，按照說明書合成cDNA第一鏈。設計TNF-α和IL-8上下游引物，以β-Actin作為內參基因，按照試劑盒說明，檢測皮膚組織TNF-α和IL-8表達情況。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠深Ⅱ度燙傷感染模型的建立

經病理切片檢查：正常組皮膚角質細胞核質呈藍紫色，均勻，皮膚皮脂腺、毛囊等結構分明，真皮層膠原纖維排列整齊(圖1A)；燙傷模型大鼠的皮膚角質細胞結構不清，核聚縮，壞死，膠原纖維變性，結構模糊，細胞變性，深層部分皮膚附屬器發生核聚縮(圖1B)，表明深Ⅱ度燙傷模型造模成功。

圖1 深Ⅱ度燙傷感染模型注：A：正常對照組；B：模型組(HE染色，100×)

2.2 創面愈合情況

燙傷后1～2 d，模型組創面水腫最明顯，迪康凝膠組和美寶燙傷膏組次之；第3～4天開始，燙傷部位逐漸開始結痂。第7天，兩組藥物組均未見明顯分泌物，模型組部分大鼠可見痂下少許分泌物。兩組藥物組開始脫痂時間均較模型組早，第14天兩組藥物組大部分痂皮已脫落，創面均明顯小于模型組，尤其迪康凝膠組可見明顯新生肉芽組織。此后，各組創面進一步減小，第21天兩組藥物組創面基本愈合，二者無明顯差異，模型組創面明顯大于兩組藥物組(圖2)。

圖2 燙傷后各組大鼠創面大體觀察

測量統計每只大鼠背上4個燙傷創面的愈合情況，包括結痂、脫痂和創面愈合的時間。與模型組比較，迪康凝膠組完全愈合時間縮短(P<0.01)。迪康凝膠組脫痂時間縮短(P<0.05)。開始結痂時間，與模型組比較，兩藥物組差異均無統計學意義(P>0.05)。迪康凝膠組與美寶燙傷膏組結痂時間、脫痂時間和創面愈合時間差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。上述結果表明，迪康凝膠可促進大鼠燙傷創面愈合。

2.3 創面愈合率

于燙傷后1、3、7、14、21 d統計創面愈合率，結果表明，各組創面愈合率均隨時間推移明顯升高。燙傷后第3、7天，美寶燙傷膏組和迪康凝膠組創面愈合率均明顯高于模型組(P<0.05)；第14、21天，兩藥物組創面愈合率均高于模型組(P<0.01)。兩藥物組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 各組大鼠創面愈合時間

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

表2 不同時間點各組大鼠創面愈合率

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 病理組織形態的影響

模型組及兩藥物組燙傷后早期(3 d)均可見真皮層明顯充血，水腫和白細胞浸潤，膠原纖維離散、腫脹。藥物組比模型組炎癥反應輕，且迪康凝膠組輕于美寶燙傷膏組。燙傷后7 d和14 d，模型組創面雖愈合，但燙傷處上皮分化較差，纖維增生，排列紊亂，組織結構不清晰，且炎性細胞浸潤明顯。兩藥物組創面愈合較好，鏡下可見新生表皮各層分化良好，排列整齊(圖3),迪康凝膠效果優于美寶燙傷膏。

圖3 燙傷后各組不同時間點創面皮膚組織病理變化(HE染色， 100×)

2.5 組織TNF-α、IL-8、Ⅰ型及Ⅲ型膠原水平

燙傷后從第1天至第21天，兩藥物組創面組織TNF-α和IL-8含量均低于模型組(P<0.05，P<0.01)。兩藥物組相比，從第7天開始，迪康凝膠組組織TNF-α低于美寶燙傷膏組，但差異無統計學意義(P>0.05)；從第1天開始，迪康凝膠組組織IL-8低于美寶燙傷膏組，其中第14天差異具有統計學意義(P<0.05)(表3～4)。

表3 各組大鼠組織

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

表4 各組大鼠組織IL-8水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；迪康凝膠與美寶燙傷膏組比較，#P<0.05

燙傷后從第1天開始，各組膠原Ⅰ、Ⅲ組織含量均逐漸升高，且兩藥物組膠原含量均高于模型組，尤其第7天開始，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。迪康凝膠組組織膠原Ⅰ型含量從第3天開始，高于美寶燙傷膏組，但差異無統計學意義(P>0.05)；迪康凝膠組組織膠原Ⅲ型含量從第3 天開始，高于美寶燙傷膏組，其中第21天時，差異有統計學意義(P<0.05)(表5～6)。

表5 各組大鼠組織Ⅰ型膠原水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

表6 各組大鼠組織Ⅲ型膠原水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；迪康凝膠與美寶燙傷膏組比較，#P<0.05

2.6 組織TNF-α和IL-8表達水平

造模后的第6～12小時各組TNF-α mRNA表達水平均增加，但從第1天開始逐漸下降，直至考察結束的第14天，依然持續下降。與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。迪康凝膠和美寶燙傷膏組相比，差異無統計學意義(P>0.05)(表7)。

表7 TNF-α基因表達水平變化

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

造模后的第6 小時至第1天，模型組IL-8 mRNA的表達水平持續增加，第3 天已開始減少；兩藥物組6～12 h IL-8 mRNA的表達水平持續增加，第1 天檢測已開始下降。藥物組與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。迪康凝膠和美寶燙傷膏相比，差異無統計學意義(P>0.05)(表8)。

表8 IL-8基因表達水平變化

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究表明，迪康凝膠和美寶燙傷膏均能明顯改善傷口愈合，且效果優于對照，直至21 d，兩藥物組創面均已基本愈合，傷口愈合率在第14和21天均高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。說明迪康凝膠可加快燙傷創面的愈合速度，減小創面面積，與已商品化的陽性藥物美寶燙傷膏相比，眼觀作用效果大致相當。組織病理考察也顯示了類似結果。傷口愈合的前14 d，模型組創面雖愈合，但燙傷處上皮分化較差，纖維增生，排列紊亂，組織結構不清晰，且炎性細胞浸潤明顯。而兩藥物組創面愈合較好，鏡下可見新生表皮和新生纖維分化良好，排列整齊，迪康凝膠效果優于美寶燙傷膏。

燙傷后的創傷修復初期，主要是創面局部微循環障礙和過度炎癥反應，局部皮膚組織釋放TNF-α、IL-8等因子顯著增多[13-14]。血流不暢導致局部炎癥因子和代謝產物堆積，炎癥因子又加重局部炎癥反應和組織水腫，壓迫局部血管，加劇局部缺血缺氧，二者互為因果，惡性循環[15-16]。本試驗檢測表明，燙傷后兩藥物組創面組織TNF-α和IL-8含量均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。同時，本研究亦從基因層面考察了TNF-α和IL-8在燙傷組織的表達變化，獲得類似結果，表明迪康凝膠可明顯改善局部微循環，減輕炎性反應。

膠原對于修復過程的完成有著極其重要的作用，除對組織提供支持和張力外，還能對細胞產生多種影響，膠原代謝的不平衡是創面愈合緩慢的原因之一[17]。膠原的類型較多，其中在創面愈合過程中，最重要的兩個膠原為：膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型。Ⅰ型膠原蛋白發揮支架作用，而包繞支架外周的Ⅲ型膠原蛋白含量決定膠原纖維的直徑大小和彈性，Ⅲ型膠原含量越高的膠原纖維越細，拉伸強度越好，瘢痕越輕。結果顯示，燙傷后治療過程中，兩藥物組從第7 天開始，Ⅲ型膠原含量均明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)；第21 天迪康凝膠組的皮膚組織Ⅲ型膠原含量明顯高于美寶燙傷膏組(P<0.05)，表明迪康凝膠對燙傷后瘢痕減少具有一定作用，與臨床眼觀效果一致。Ⅰ型膠原是瘢痕組織纖維化的物質基礎，結果顯示，第7天開始，兩藥物組Ⅰ型膠原含量明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)，但第21天兩藥物組與模型組相比，Ⅰ型膠原含量差異無統計學意義(P>0.05)。統計傷口愈合過程中，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例顯示，從第3天至第21天，迪康凝膠和美寶燙傷膏的Ⅰ/Ⅲ型膠原比值均低于模型組，表明兩組藥物均能促進傷口愈合，減少瘢痕生成。

綜上所述，迪康凝膠對治療燙傷傷口有明顯的臨床效果，可促進傷口愈合，同時減少炎性反應及組織瘢痕形成。迪康凝膠可作為臨床治療燙傷的有效藥物。

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AStudyontheTherapeuticEffectandProbableMechanismsofDikangGelontheScaldWoundHealingofRats

CuiBohui1,LiLong1,HuangLingyuan2,LuoDan2,ZhaoChanjuan3,SunXiaoqing1,MuYanxi1,WangZhijun1△.

1.PlasticSurgeryInstituteofDalianUniversity,Dalian116021,China; 2.WestChinaSecondUniversityHospital,Chengdu610000,China; 3.ChengduLiLaiBiotechnologyCo.,Ltd,Chengdu610000,China

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect and mechanism of Dikang Gel on the scald wound healing of rats.MethodsThe SD rats were divided randomly into the model group, Mebo Ointment group, and Dikang Gel group. The deep second-degree scald model was established with a super temperature-controlled scald apparatus in SD rats. The model group was not treated, while the other two groups were administered once a day for 21 days and the wound healing process and histopathology were monitored within 21 days. The levels of TNF-α, IL-8, typeⅠand Ⅲ collagen in tissues were detected by the ELISA method and the mRNA expression of TNF-αand IL-8 in tissues were detected by RT-PCR.ResultsThe healing time was significantly shorter (P<0.05,P<0.01) and the wound healing rate was significantly higher (P<0.05,P<0.01) in the Dikang Gel group than in the model group. The results of histological observation showed that Dikang Gel had a good effect of tissue repair. The levels of TNF-α and IL-8 in the wound tissues were significantly lower in the two administered groups than in the model group (P<0.05,P<0.01). The levels of typeⅠand Ⅲ collagen were also higher in the two administered groups than in the model group. The results of RT-PCR showed that the mRNA expression levels of TNF-α and IL-8 in the two administered groups were consistent with the levels of protein concentration.ConclusionDikang Gel can promote the scald wound healing of rats, so it is an effective drug in the treatment of the scald wound.

Dikang Gel; Mebo Ointment; Scald; TypeⅠcollagen; Type Ⅲ collagen; TNF-α; IL-8; Rat

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171108.0840.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.06.005

R644

A

成都市科技局科技惠民計劃項目(No:2014-HM01-00274-SF)

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王志軍，E-mail：wangzhijundldx@126.com