受環境因素影響的DNA甲基化在孤獨譜系障礙病因學中的研究進展

趙袁志，黃 凌，周東升，曹曉君，胡珍玉

（1寧波大學醫學院，浙江 寧波 315211；2寧波市康寧醫院，浙江 寧波 315201）

受環境因素影響的DNA甲基化在孤獨譜系障礙病因學中的研究進展

趙袁志1，黃 凌1，周東升2，曹曉君1，胡珍玉2

（1寧波大學醫學院，浙江 寧波 315211；2寧波市康寧醫院，浙江 寧波 315201）

0 前言

孤獨譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是以社會溝通、交往和興趣行為等表現偏離正常為共同特點的一組神經發育性障礙的統稱［1］．近十幾年年來國際和國內流行病學的相關數據報告均表明，全世界各個國家ASD患病率都在明顯升高，已引起相關機構和組織的強烈重視［2］．如：美國孤獨癥及發展障礙監控網（astism and developmental disabilitties monitering，ADDM）2014年統計的數據表明，2010年，美國11個州每1000名8歲兒童中有5．7～21．9名患病，平均有 14．7 名 ASD 患兒．［3］．2011 年，俞蓉蓉等［4］通過對已報道的中國10個省市ASD兒童患病率進行統計和分析，認為132 788例0～14歲兒童ASD的總患病率為每1000名孩子中有2．55名患病．

整個20世紀ASD都被認為是一種極其罕見的疾病，起初人們認為父母及家人錯誤的養育方式才是造成兒童ASD的主要原因．后來有人首次提出遺傳和生物因素可能是導致ASD的部分原因，但由于與錯誤教養方式無關，當時被人們所排斥［5］．20世紀60～70年代，ASD被考慮為兒童精神病或者兒童精神分裂癥，這種考慮代表人們對ASD的病因學認識取得了巨大的進步．直到20世紀80年代，ASD的生物學機制才開始被人們接受，并且認為這是一種兒童的發育障礙．孤獨癥先后被DSM-3（the diagnostic and statistic manual of mental disorders-Ⅲ）和 ICD-10（the international classification of diseases-10）引用，定義為廣泛性發育障礙 （pervasive developmental disorders，PDD）的一個亞型．在DSM下一個版本DSM-Ⅳ中，PDD被概念化為3個核心癥狀：社會互動障礙、定性溝通障礙和限制的興趣愛好與重復的行為模式．其包括五個具體的亞型：孤獨癥（autism）、不典型孤獨癥（atypical autism）、阿斯伯格綜合癥（aspergevr's）、雷特綜合癥（Rett's）、童年瓦解性障礙（又稱衰退性精神障礙，disintegration disorder）［6］．在 2013 年 6 月發布的最新版本的DSM-5中這些子組被合并成一個統一的譜系，即孤獨譜系障礙．DSM-5與 DSM-4相比，保留DSM-4中的多項內容，排除Rett綜合癥、童年瓦解性精神障礙．但是，DSM-5在類別、名稱、障礙程度、診斷領域、社會性與感知覺內容、診斷年齡等方面有所變動［7］．

ASD有很強的遺傳基礎，如關于雙胞胎的一個前瞻性研究報道稱，如果一個孩子有一個同胞患有ASD，那么其后代患病的可能性為18．7%，如果這個孩子有超過一個以上的同胞患有ASD，則可能性會達到 32．2%［8－9］．ASD 遺傳方面的原因很復雜，并且潛在的遺傳生物學機制不明，僅用遺傳學來解釋ASD的病因會產生很多疑問，例如ASD相關的遺傳變異也常出現在非ASD診斷的人群中［10］．一個大型雙隊列研究證實子宮內環境因素所致ASD的風險率為30%～80%，明顯高于遺傳的 14%～67%［11］．大量的遺傳研究［12］發現，遺傳因素目前只能解釋大約1／3的ASD患者的病因．這些研究均表明，使用遺傳因素解釋ASD的病因略顯證據不足，ASD產生的機制可能涉及基因和環境危險因素之間復雜的相互作用［13］．近年來的主要觀點是ASD的產生是遺傳、表觀遺傳和環境多方面共同作用的結果．

1 孤獨譜系障礙疾病遺傳學病因

基因和基因組變異通常有不同的分類：按照病因是否明確分為“典型”變異和“特發性”變異；根據最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）分為常見變異、罕見變異和低頻變異［14］；按照機制主要分為單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和 DNA拷貝數變異（copy number variation，CNV）等．

“特發性”是用來描述不明原因引起的ASD的一個概念．這些原因包括單基因、多基因和環境等因素，許多涉及癲癇和智能低下的基因被用來解釋ASD的病因．“典型”ASD通常由基因變異所引起，如結節性硬化癥、脆性X綜合征或其它已知綜合癥［15］．常見變異模型被廣泛應用于ASD的研究，為許多候選基因和全基因組關聯研究提供了依據．通過對常見變異模型的研究找出了許多ASD易感基因，近來對于ASD罕見基因的研究也成為熱門．大量研究［16－17］發現，很多常見疾病如ASD和精神分裂癥的主要原因是高度滲透的罕見基因變異，而不是常見基因變異．常見基因突變來源于祖先，這些突變的基因產生的表型會減弱ASD的生育能力，且很多時候其遺傳到下一代并未表現出來，這些證據表明常見基因突變并不能完全解釋一些遺傳問題．而罕見變異由于產生配子時出現了新發突變等因素，導致各種功能障礙和生育能力下降，如只能遺傳幾代，負面的影響使得這種突變永遠不會成為“常見”變異．下面主要從SNP和CNV角度重點綜述遺傳和ASD之間的關系．

1．1 SNP SNP是指由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括堿基的轉換、顛換、插入或缺失．已知SNP增加特發性ASD的遺傳風險已經通過候選基因測序的方法證實．

例如SHANK3是ASD的SNP關聯性分析中研究最多的基因之一［18］．通過結合孤獨癥測序聯盟（autism sequencing consortium，ASC）和孤獨癥基因組計劃（autism genome project，AGP）中已發表的 ASD相關的數據進行統計分析，確認了65個ASD風險基因［19］．由于ASD是多基因遺傳病，涉及許多 SNPs，而每一個SNP對于ASD產生的影響較小．盡管隨著測序技術的高速進步，全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）的應用均提高了ASD的SNP檢測能力，然而這些方法只能確定有限的位點，并且檢測之后的結果難以復制．以上結論均表明僅用常見的SNP對ASD進行預測診斷需要更多樣本的證實［18］．已知ASD是一種神經發育性疾病，而從神經系統發育相關的基因角度來看ASD的發病基因，一般可大致分為兩類，神經發育相關基因（如FMR1、神經元表面蛋白家族基因、MeCP2、神經配體蛋白家族基因等）以及神經變性相關基因（ApoE、Reelin和APP 等）［20］．

1．2 DNA拷貝數變異 CNV指的是至少1 kb的基因組復制或刪除．CNVs與其他機制相比，是一種比較溫和的致病機制．新發或罕見的CNV作為ASD的遺傳變異已經被確定［21］．Sanders 等［22］發現顯著增加的堿基對重復與ASD有關．雖然CNV是多態性的，且經常在人類中遺傳，但是在ASD患者中發現的新發或罕見CNV頻率更高．有一個ASD家系數量為近200個的研究表明，單一家系（家系中只有一個ASD患者）比多態性家系（家系中有2個或2個以上ASD 患者）有更多的罕見或新發 CNV 比率［23－25］．另外，雖然7q31涉及CADPS2和其他7個基因的新發刪除，但連鎖研究發現7q31中存在幾倍的復制［26］．而7q31的潛在作用在CADPS2基因敲出的老鼠和在患有ASD的人體研究中都得到了證實［27］．Roberts等［28］使用微陣列分析了65名ASD患者的樣本，發現參與ASD最常見的染色體是15號染色體，而其上的15q、22q、16p和7q中出現相當高頻率的CNVs，如15q11-13 的復制和 16p11．2 的刪除和復制［29］．

1．3 ASD相關的遺傳病因組成 目前經過各方面統合的研究只識別出了部分遺傳原因［30］，已知的遺傳病因在ASD總病因的比例分別為：細胞遺傳學變異（＜5%），拷貝數變異（即亞微觀的刪除和重復）（10%～20%）和與ASD相關的單基因變異 （＜5%）．

2 孤獨譜系障礙與表觀遺傳相關研究

隨著遺傳學研究的深入，有些疾病的病因并不能很好的用遺傳學異常學說解釋．例如，雖然同卵雙胞胎基因型相同，但他們的表型及疾病易感性大不相同［31］．隨著 Wu 等［32］在 1942 年對“表觀”這個概念的首次提出，人們對表觀遺傳在解釋各種疾病的發病機制的作用形成了初步的認識．表觀遺傳是指在環境和遺傳相互作用后，不發生DNA序列變化的可遺傳的基因功能改變．表觀遺傳作用機制主要涉及DNA共價修飾、蛋白質共價修飾、染色質重塑和非編碼RNA的調控等．近些年來，隨著人們對表觀遺傳學各個方面研究的了解加深，逐漸認識到ASD的產生與表觀遺傳學機制有著密切關系．Rangasamy等［33］發現神經結構及其功能的表觀遺傳學機制是神經系統發育的關鍵環節．Nguyen等［34］通過對ASD的同卵雙胞胎的淋巴細胞系細胞進行的全基因組的表觀遺傳分析，證明ASD患者存在廣泛的表觀遺傳失調現象．Schanen等［35］發現許多與ASD相關聯的染色體位點可以受到基因組印記影響，證明表觀遺傳能夠增加ASD發病的風險．脆性X綜合征和Rett綜合癥是ASD的亞型，也被發現這些患者存在表觀遺傳失調的現象［36－37］．DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的最重要的方式之一，有證據證明ASD患者存在全基因組甲基化調節異常［38－39］．下面主要從 ASD相關 DNA甲基化的各個角度進行分析和介紹．

2．1 DNA甲基化修飾相關背景知識簡述 DNA甲基化主要是指將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）上的甲基（-CH3）轉移至DNA的雙核苷酸序列（CpG）的特定堿基胞嘧啶的第5位碳原子上，產生5-甲基胞嘧啶（5mC），這個過程依靠 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b這3種主要的DNA甲基轉移酶作用才能完成［40］．普遍認為DNA上高甲基化可以抑制基因的轉錄，最終使基因沉默（即基因不能表達）［41］，低甲基化則使基因高表達．然而也有研究得出相反的結論，即DNA高甲基化也可產生基因的高表達，這可能是因為高甲基化抑制了反義RNA或微小RNA的轉錄，而它們的功能是下調宿主基因的表達［42］．基因甲基化水平和模式隨著細胞類型的不同和發育階段的不同而不同，DNA甲基化在胚胎期、兒童期和成人期均可以發生明顯的變化［43］，在胚胎期變化最明顯．早期胚胎階段，DNA甲基化用來消除全能性；在細胞分化期間，特定的DNA甲基化發生重調；在后期的發育中，DNA甲基化遺傳模式受環境影響發生去甲基化和從頭甲基化．組織類型方面，與其他組織相比，人體胚胎干細胞和腦組織有著更高程度的甲基化（＞75%）［44］．雖然大腦組織是研究精神疾病的最佳組織，近來的全基因組研究卻證明一些大腦的表觀遺傳是可以在外周組織（如血液或者唾液細胞）表現的［45］．

2．2 與ASD相關的DNA甲基化 2010年后，ASD相關的全基因組和特定基因的DNA甲基化實驗研究總結如表1．

表1 與ASD相關的DNA甲基化研究

2．3 與其他表觀遺傳學機制的關系 DNA甲基化的過程與另外兩個表觀遺傳機制（基因組印記和X染色體失活）相互作用．例如，啟動子區域CpG島形成的5mC在基因組印記中起重要作用［60］．美國的一項研究表明，女性X染色體上有一個微小的環，環內的基因滅活，會導致基因的表達異常，從而引起其后代的發育異常，如Turner綜合癥、嚴重的精神發育遲滯等［61］．

3 環境因素對ASD的DNA甲基化的影響

盡管環境因素對ASD表觀遺傳的影響機制并不完全清楚，但環境因素與DNA甲基化的修飾密切相關．如多個人類研究已經確定懷孕期間環境的影響和后代甲基化模式存在關聯［10］．與ASD相關的很多環境因素也可能導致人體內的表觀遺傳學變化，使基因功能發生紊亂，從而增加兒童患ASD的易感性．目前可以將對ASD的DNA甲基化產生影響的環境因素分為以下大類：感染和免疫、飲食和營養、環境毒性物質的接觸、父母生理狀態、生活方式和壓力或氧化應激等．

3．1 感染和免疫 Nardone等［10］通過綜述大量的文獻得出結論：免疫激活（如母孕期的病毒感染）和孕產婦自身免疫性疾病與ASD有關．Poly I：C（聚肌胞苷酸）是一種雙鏈模擬RNA分子，可以通過激活Toll樣受體表達interferon-1觸發免疫反應，可以向懷孕的嚙齒動物注入Poly I：C模擬母孕期的免疫激活反應［62］．Basil等［63］用這個模型模擬免疫反應，檢測新生老鼠的丘腦下部組織MECP2和LINE-1基因的DNA甲基化，發現這2個基因CpGs的DNA甲基化降低．Labouesse 等［51］的實驗也發現，用 Poly I：C 治療母老鼠，其后代的額葉皮質GAD1和GAD2基因DNA甲基化增高．這些實驗表明，免疫激活可以引發后代大腦中DNA甲基化模式的長期變化．

3．2 飲食和營養 在飲食補充方面，最著名的是對1944～1945年丹麥的冬天饑荒的研究，Heijmans等［64］通過檢測曾經歷過饑荒母親的后代的甲基化分析發現，IGF2基因的DNA甲基化發生了失調．Tobi等［65］繼續展開研究，發現在饑荒過了60多年后，之前的表觀改變仍然存在，這就證明了孕產期環境因素（包括飲食的攝入）對表觀遺傳的影響長期持續存在．而針對ASD的DNA甲基化相關的飲食攝入的研究，迄今為止研究最多的營養物質是葉酸．DNA甲基化取決于飲食甲基供體（如葉酸、膽堿和蛋氨酸等）的可用性，而這些供體又通過一碳單位代謝相互關聯．葉酸或甲基供體可以通過影響DNA甲基化能力繼而間接影響神經的發育．現有的人類和動物一碳單位代謝的研究表明，母體葉酸狀態通過影響DNA甲基化而影響 ASD 患病的風險因素［66］．Hendren 等［67］用甲基維生素B12治療ASD的兒童，發現臨床改善與等離體蛋氨酸的增加、S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）的減少和S-腺苷甲硫胺酸 （SAM）／（SAH）的增加成正相關，表明甲基維生素B12可以改善ASD患兒的細胞甲基化能力．當然除了甲基化供體物質還有其他物質的攝入也能影響甲基化的變化，如高脂肪、低碳水化合物和生酮飲食［68］．

3．3 環境毒性物質 環境毒性物質會增加ASD患病風險，Deth［69］發現，環境化學物質可以改變發育的大腦的DNA甲基化模式，從而增加ASD的患病風險．這些化學物質具有代表性的是多氯聯苯（PCB）、多環芳烴（PAH）、鉛、雙酚 A（BPA），汞和殺蟲劑．研究［70－71］表明妊娠期接觸 PAH，會導致后代 Bdnf IV啟動子甲基化的增加和PPARγ甲基化的降低．與生殖毒性有關的BPA能夠影響生長和免疫調節，在圍產期飲食接觸過BPA的婦女，近來發現其后代的骨髓源性肥大細胞中全基因組甲基化降低［72］．空氣污染作為重要的環境毒性物質之一，早在2006年就被報道與罹患ASD風險之間存在關聯［73］．美國的科學家發現在高濃度的超細環境顆粒環境下生活的小鼠模型的大腦出現了神經化學變化、神經膠質細胞激活和腦室體積擴大的現象［74］．而中國科學家發現細顆粒物（PM2．5）可以通過影響DNA甲基化而對神經發育產生毒性作用［75］．這些研究均為空氣污染如何增加ASD患病風險提供了可能的發生機制．

3．4 父母的生理狀態 母親的妊娠期糖尿病（gestational diabetes）是一種常見的妊娠并發癥，Wang等［76］在2017年發表了一篇meta分析，指出妊娠期糖尿病是ASD的患病風險因素之一．Barua等［77］也指出妊娠期糖尿病可以誘發幾個基因的甲基化模式發生潛在的變化，這些受影響的基因參與代謝疾病的形成．多個研究發現母親被診斷為妊娠期糖尿病，通過對其后代的臍帶血進行甲基化檢測，發現DNA甲基化調節異常［78－79］．DNA 甲基化的干擾可以起源于精子時期，與父親的年齡有關，這種機制通過表觀缺陷而表達出來［80］．

3．5 生活方式 父母最常見的不良生活方式包括吸煙和飲酒．Breton等采用“Illumina Human Methylation 27芯片”技術對產前煙霧暴露史的兒童進行甲基化分析，發現19個CpG位點的甲基化與產前吸煙顯著相關，表明產前吸煙與表觀遺傳改變密切相關，而這種改變能夠持續在整個兒童時期［81］．Ladd-Acosta等［82］搜集了產前母體吸煙的572個嬰兒臍帶血樣本，對與之相關的26個CpG位點的甲基化進行分析，這些DNA甲基化變化似乎有煙草特異性，且母親產前接觸吸煙的后代在學齡前兒童期和出生時的DNA甲基化情況基本一致，從而說明了血液DNA甲基化可能作為預測產前是否接觸過吸煙的生物標志物．對老鼠胚胎研究發現，飲酒可以通過DNA甲基化改變而影響早期胚神經的形成和幾個基因（參與細胞周期、生長、凋亡和印記等功能）的表達，從而最終調節早期胎兒的發育［83］．盡管妊娠期吸煙飲酒也會導致甲基化，但Fujiwara等［84］通過綜述大量文獻得出結論，傳統的危險因素如吸煙／煙草和酒精不太可能與ASD有關，因此產前的吸煙和飲酒通過調節DNA甲基化影響ASD的患病風險仍需進一步探索．

3．6 壓力和氧化應激 Frye等［85］指出可以通過鐵和銅代謝異常等多種氧化應激機制增加ASD的患病風險，而氧化應激總體上的的機制是內源／外源活性氧的生成增強和對活性氧的抗氧化的防御的失衡．氧化應激可以影響DNA甲基化，雙酚A（bisphenol A，BPA）可以通過高水平的循環葡萄糖誘導ASD患兒的氧化應激反應［86］，同時雙酚 A可以抑制甲基化［72］，由此我們可以推斷氧化應激可能抑制ASD的甲基化水平．日本科學家指出，妊娠前3個月，產前壓力或應激會通過影響表觀修飾（如DNA甲基化）來增加患ASD的易感性［87］．

3．7 環境因素之間的關系 與ASD相關的DNA甲基化很難只受到單一環境因素影響，實際上環境因素之間也能夠相互作用，因而環境因素對ASD的DNA甲基化的影響機制相當復雜．例如上文提到的荷蘭饑荒研究中，至少有兩個以上的風險因素可能會相互影響后代的神經發育，如營養不良和由于饑荒、戰爭和許多其他壓力事件（如悲慘的生活狀況）帶來的母親的壓力［88］．與ASD有關的妊娠期糖尿病不僅可以影響DNA甲基化失調，而且還可以通過影響表觀遺傳來調節免疫系統的激活［10］．多種環境因素的相互作用對ASD的DNA甲基化的產生影響機制仍需進一步的研究．

4 DNA甲基化對ASD的應用前景

致病性甲基化變化對外環境、內環境改變較敏感，也能成為藥物作用的新靶點．目前用于表觀遺傳的藥物分為兩類：核苷類似物和非核苷類似物．①核苷類似物整合于DNA，并通過構成共價鍵封鎖DNA甲基轉移酶，現階段正試驗用于惡性血液病治療．②非核苷類似物通過結合催化亞基封鎖DNA甲基轉移酶并限制其表達［89］．使用Rett綜合癥的小鼠大腦皮層神經元和Rett綜合癥患者的成纖維細胞作為實驗對象的研究，表明MeCp2刪除可以導致BDNF的減少，異常細胞遷移和分化，而這些異常都可以被組蛋白去乙酰化酶6抑制劑（tubastatin A）干預所恢復，以上研究說明表觀遺傳治療可能用于Rett綜合癥的治療［90－91］．同樣用 DNA 甲基化抑制劑 5-氮雜胞苷（5-azacytidine）治療相關疾病的研究也得到了類似的效果［92］．

5 總結和展望

本文重點綜述了與ASD相關的遺傳和表觀遺傳方面的研究進展，尤其是環境因素對ASD相關的DNA甲基化的影響．目前國內對ASD的表觀遺傳的研究較少，作為ASD病因學研究的又一切入口，DNA甲基化是聯系個體與環境的一個紐帶．人類在母體內所處的早期環境以及后期的生存環境均可影響基因組DNA的甲基化修飾，進而調控相關基因的表達，最終影響疾病的發生和發展［93］．本文的作者均是寧波市康寧醫院兒童精神學組的成員，而我們此次ASD甲基化課題的目的就是想篩選出更多與ASD發病相關的DNA甲基化位點，且進一步證實其差異化的甲基化影響基因的功能和表達．未來的ASD甲基化研究重點可能集中于研究DNA甲基化對基因表達的影響機制、其他表觀遺傳修飾（如組蛋白修飾、非編碼RNA調控）與DNA甲基化相互作用機理以及環境因素對DNA甲基化的作用機制．建立起與ASD相關的DNA甲基化的功能數據網絡，以便對提高ASD疾病風險的預測能力（如預后判斷、診斷分型、療效評估、疾病發展監控），并對其進行更完善的系統評估．

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Research progress on the etiology of DNA methylation affected by the environmental factors in autism spectrum disorder

ZHAO Yuan-Zhi1， HUANG Ling1， ZHOU Dong-Sheng2， CAO Xiao-Jun1，HU Zhen-Yu21Medical School of Ningbo University， Ningbo 315211， China；2Ningbo Kangning Hospital， Ningbo 315201， China

Autism spectrumdisorder（ASD） is a general term for a group of neurodevelopmental disorders characterized by deviation from normal in social communication，interaction and interest behavior and so on．At present， the treatment and effect for ASD on children is limitted and the prognosis is poor，those children who suffered from ASD fail to get effective intervention and treatment，not only will their physical and mental health be seriously affected，but also huge burden will be imposed on their family as well as society．A rapid progress on epigenetics has been made in recent years，especially the deepening research on DNA methylation，which has identified that DNA methylation is an important reason for ASD production．It will provide help for the study of etiology of ASD and provide valuable information for the prevention and treatment of ASD if the DNA methylation genes and loci of ASD abnormalities are found and the molecular biological mechanism of DNA methylation of ASD and its influencing factors（especially environmental factors） are identified．

autism spectrum disorder； genetics； epigenetics；DNA methylation；environmental factors

孤獨譜系障礙（ASD）是以社會溝通、交往和興趣行為等表現偏離正常為共同特點的一組神經發育性障礙的統稱．目前對兒童ASD的治療方法和效果有限，且預后較差．ASD患兒如果沒有得到有效的干預和治療，不僅會嚴重影響患兒的身心健康，也會對其家庭和社會造成巨大的負擔．近些年表觀遺傳學迅速進展，尤其是對DNA甲基化領域研究的逐步深入，已經確定DNA甲基化是ASD產生的重要原因之一．找到ASD異常的DNA甲基化基因和位點，明確ASD的DNA甲基化的分子生物學機制及其影響因素（尤其是環境因素）可以為ASD的病因學研究提供幫助，并對ASD的預防和治療提供寶貴的資料．

孤獨譜系障礙；遺傳；表觀遺傳；DNA甲基化；環境因素

R96

A

2095-6894（2017）12-64-04

2017－06－07；接受日期：2017－06－20

浙江省醫藥衛生科技項目（2017207569）

趙袁志．碩士生．研究方向：兒童精神科．E-mail：1225316340＠ qq．com

胡珍玉．教授，碩士生導師．研究方向：兒童精神科．E-mail：zhaoyz2017＠ 163．com