普拉格雷干預對腦梗死大鼠神經功能的影響及可能機制

劉克洪 李景琦 高 堅 (武警浙江省總隊杭州醫院康復中心，浙江 杭州 310051)

普拉格雷干預對腦梗死大鼠神經功能的影響及可能機制

劉克洪 李景琦 高 堅 (武警浙江省總隊杭州醫院康復中心，浙江 杭州 310051)

目的考察普拉格雷對腦梗死大鼠神經功能的影響及可能機制。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術組，模型組和普拉格雷組3組，每組40只。假手術組與模型組灌胃給予生理鹽水，普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1，連續給藥14 d。記錄或檢測各組行為障礙、組織病理學改變、腦內半胱天冬酶(Caspase)-3及程序化死亡基因(PDCD)-5表達情況，外周血超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達情況。結果與假手術組比，模型組及普拉格雷組神經功能評分升高顯著(P<0.05)；與模型組比較，普拉格雷組神經功能評分顯著降低(P<0.05)。假手術組腦組織細胞結構完整；模型組細胞排列紊亂，水腫嚴重，血管充血；與模型組比較，普拉格雷組腦組織結構較完整，且壞死及水腫程度降低。與假手術組比，模型組可見大量Caspase-3和PDCD-5細胞(P<0.05)，SOD明顯降低(P<0.05)，MDA、NSE和S-100β明顯增高(P<0.05)；與模型組比，普拉格雷組Caspase-3和PDCD-5細胞顯著降低(P<0.05)，SOD明顯增高(P<0.05)，MDA、NSE和S-100β明顯降低(P<0.05)。結論普拉格雷可以通過抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子，調控SOD、MDA、NSE及S-100β表達從而改善腦梗死大鼠的神經功能障礙。

普拉格雷；腦梗死；半胱天冬酶-3；程序化死亡基因；超氧化物歧化酶；丙二醛；神經元特異性烯醇化酶；S-100β

腦梗死后神經功能的改善成為近年來研究的難點和熱點，針對腦梗死動物模型的研究發現，抑制凋亡及保護神經成為治療的重點〔1〕。普拉格雷作為第三代血小板抑制劑，可與P2Y12受體相結合，從而發揮更強更迅速的抗血小板聚集作用，是一種已處于Ⅲ期臨床試驗的藥物〔2〕，然而有關普拉格雷可否改善腦梗死大鼠神經功能的研究至今缺如，其可改善神經保護的機制也未知。本文探究普拉格雷對腦梗死大鼠神經功能的影響及可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 雄性Wistar大鼠(北京維通利華公司)120只，8～10周齡，體重180～220 g，隨機分為假手術組，模型組和普拉格雷組各40只。

1.2腦梗死大鼠的制備 大鼠全麻后置于操作臺上，分離右側頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)。結扎ECA及CCA近心端。在CCA近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動脈分叉處，平均進線(18.5±0.5)mm(ECA與ICA分叉處為起點)，栓線尾端留于皮膚外，栓塞90 min后抽線實現再灌注。以大鼠清醒后爬行時右轉圈，提尾時右前肢內收屈曲為納入標準。假手術組操作同上，僅暴露各組血管，而不進行線栓插入〔3〕。

1.3給藥 假手術組和模型組均灌胃給予生理鹽水，劑量10 ml·kg-1·d-1，普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1，連續給藥14 d。

1.4神經功能評分〔3〕記錄所有大鼠治療后的神經功能評分。0分：活動自如，未有障礙；1分：存在活動障礙，左側前爪無力；2分：存在活動障礙，推手術側肩部，發現對側的移動阻力降低；3分：存在活動障礙，大鼠出現旋轉轉圈；4分：活動障礙明顯，無肢體活動。分值越高提示行為障礙越明顯。

1.5腦組織病理 治療后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠處死，取腦組織，參照固定-脫水-包埋-切片-染色等步驟，光鏡觀察病理形態。

1.6Caspase-3及程序化死亡基因(PDCD)-5在腦組織的表達 選擇1.5的切片，按照脫蠟-透明-脫水-抗原修復-抗體孵育-染色等步驟，光鏡觀察Caspase-3及PDCD-5表達情況。按染色強度與陽性細胞數比例確定陽性情況，無著色0分，<1%為1分、1%～10%為2分，11%～33%為3分，34%～66%為4分，67%～100%為5分，染色強度按無、弱、中和強分別為0、1、2和3分，陽性細胞百分率評分+細胞染色強度評分≥3為陽性，否則為陰性。

1.7外周血超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)表達 治療前后，自大鼠眼球取血，靜置2 h，離心取血清，按照說明書操作步驟〔3〕，并應用儀器檢測吸光度并計算SOD和MDA的相對含量。SOD和MDA試劑購于美國CST公司。

1.8外周血神經元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達 治療前后，自大鼠眼球取血，高速離心取上清，以酶標儀采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定NSE及S-100β水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，NSE及S-100β試劑盒均購于R&D公司。

1.9統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組治療前后的神經功能評分 治療前，與假手術組比較，模型組及普拉格雷組神經功能評分較治療前顯著升高(P<0.05)，治療后，普拉格雷組神經功能評分較治療前顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，普拉格雷組神經功能評分明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織病理學比較 假手術組腦組織細胞結構完整；模型組細胞排列紊亂，水腫嚴重，血管充血；與模型組比較，普拉格雷組腦組織結構較完整，且壞死及水腫程度降低，見圖1。

表1 各組治療前后的神經功能評分分)

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組腦Caspase-3及PDCD-5表達 假手術組未見Caspase-3 和PDCD-5陽性細胞，模型組見大量Caspase-3〔32例(80.00%)〕和PDCD-5陽性細胞〔35例(87.50%)〕(χ2=53.333，62.222，均P=0.000)；與模型組比較，普拉格雷組Caspase-3 和PDCD-5陽性率〔17例(42.50%)、15例(37.50%)〕明顯降低(χ2=8.717,P=0.003 0;χ2=21.333,P=0.000 0)，見圖2。

2.4各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較 治療前，與假手術組比較，模型組及普拉格雷組SOD顯著降低(P<0.05)，MDA顯著升高(P<0.05)；治療后，較治療前普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05)，MDA顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05)，MDA顯著降低(P<0.05)，見表2。

圖1 各組腦組織的HE染色(×400)

圖2 各組腦組織Caspase-3及PDCD-5表達(×400)

2.5各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較 治療前，與假手術組比較，模型組及普拉格雷組NSE及S-100β顯著增高(P<0.05)；治療后，普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05)，見表3。

表2 各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較分)

表3 各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較分)

3 討 論

腦梗死發生機制不明，但腦組織缺血缺氧導致的細胞凋亡及氧自由基增高，促使多種腦組織損傷特異性蛋白，如NSE及S-100β分泌增多，誘導腦組織神經功能的損傷。NSE多由神經元細胞分泌，是中樞神經系統(CNS)特異性蛋白，生理狀態下的血清水平較低，難以被檢測到，但當顱內缺血缺氧時，胞質內的NSE即進入血液循環，外周血增高的NSE可作為顱內損傷的標志物〔4～7〕；S-100β可在多種腦內細胞內表達，但表達受限，參與腦細胞的多種代謝過程，被認為是腦損傷的特異性標記蛋白〔8～10〕。

腦梗死發病的重要因素之一是細胞凋亡，細胞凋亡受多種基因調控，線粒體凋亡通路、內質網凋亡途徑和死亡受體通路均可干預凋亡，這三種通路均需要激活下游Caspase-3和PDCD-5等凋亡蛋白才能發揮誘發細胞程序性死亡的作用。Caspase-3為通路中的關鍵因子，是啟動凋亡的重要分子〔11〕。PDCD-5具有早期及始動性的功能，參與線粒體凋亡通路〔12〕。本文結果提示腦梗死大鼠腦部存在明顯的細胞凋亡。

生理條件下，機體具有清除體內多余自由基的功能，然而在缺血缺氧的情況下，氧自由基聚集，損傷腦組織。SOD作為最主要的抗氧化酶，可有效清除體內氧自由基；而MDA與線粒體膜的穩定性相關，兩者的含量可反映機體氧自由基情況〔13,14〕。本文結果提示腦梗死大鼠的氧自由基代謝紊亂。

普拉格雷作為一種新型的抗血小板藥物，是一種前體藥物，可在體內活化為活性物質，與血小板受體結合從而發揮更有效的抗血小板聚集的效果。研究多認為普拉格雷具有較好的預防和改善心腦血管疾病發生發展的功能〔15,16〕。

本文說明普拉格雷可以明顯降低腦梗死大鼠顱內凋亡程度。普拉格雷可以顯著減輕腦梗死大鼠氧自由基的分泌。普拉格雷可以降低腦特異性損傷蛋白的分泌，參與腦梗死的修復。既往研究〔13〕顯示，抗血小板療法可誘發大腦皮層發生依賴性神經功能重組的變化，使腦梗死恢復期患者大腦皮層發生功能重組變化，使患肢運動功能得到恢復。普拉格雷療法可以通過減輕顱內凋亡程度、氧自由基分泌狀況及腦損傷蛋白的合成改善腦梗死大鼠的神經功能障礙，然而有關其深入機制的研究仍需后續實驗。

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R743.3

A

1005-9202(2017)24-6038-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.015

浙江省自然科學基金資助項目(No.LY12H09006)

李景琦(1964-)，男，主任醫師，主要從事腦損傷意識障礙康復研究。

劉克洪(1983-)，男，主治醫師，主要從事神經損傷康復研究。

〔2016-11-29修回〕

(編輯 苑云杰)