香砂六君丸對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟線粒體的影響

婁林潔，游艷婷，馬柯，陳澤偉，孫曉敏，周琳

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 中醫科，浙江 溫州 325015；2.南方醫科大學 中醫藥學院，廣東廣州 510515；3.南方醫科大學南方醫院 內分泌科，廣東 廣州 510515）

香砂六君丸對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟線粒體的影響

婁林潔1，游艷婷2，馬柯2，陳澤偉2，孫曉敏2，周琳3

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 中醫科，浙江 溫州 325015；2.南方醫科大學 中醫藥學院，廣東廣州 510515；3.南方醫科大學南方醫院 內分泌科，廣東 廣州 510515）

目的：研究香砂六君丸對非酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟組織內線粒體的影響。方法：24只正常成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組和治療組。采用高脂飼料喂養法來制作非酒精性脂肪肝大鼠模型，給予香砂六君丸（1.35 g·kg-1·d-1）灌胃4周治療后取材。檢測各組大鼠的體質量、肝臟濕重、肝臟HE染色結果、血液生化指標。用Real time PCR法、紫外分光光度計法對肝臟組織線粒體DNA（mtDNA）拷貝數、線粒體復合物I、IV活性的變化進行測定。結果：與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟濕重和質量指數（肝臟濕重/體質量）顯著升高，血清總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平明顯升高，肝臟組織mtDNA顯著降低，肝臟組織線粒體復合物I、IV活性顯著降低，差異均有統計學意義（p＜0.05）。與模型組大鼠相比，治療組大鼠肝臟濕重和質量指數顯著降低，血清TC和LDL-C水平明顯降低，肝臟組織mtDNA顯著升高，肝臟組織線粒體復合物I、IV活性顯著升高，差異均有統計學意義（p＜0.05）。肝臟HE染色結果顯示，模型組大鼠肝細胞出現大量脂肪空泡，細胞核固縮；治療組大鼠肝細胞出現脂肪空泡量顯著減少，細胞核固縮情況減輕。結論：香砂六君丸可能通過調節mtDNA拷貝數與呼吸鏈酶復合物活性對非酒精性脂肪肝起到治療作用。

非酒精性脂肪肝；香砂六君丸；線粒體呼吸鏈酶復合物；DNA，線粒體

隨著經濟的發展，人們的飲食與生活習慣也隨之改變。非健康的飲食會引起非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發生[1]。現如今，NAFLD已經逐漸成為發病率最高的肝臟疾病之一，吡咯列酮、羅格列酮等噻唑烷二酮類胰島素增敏劑為臨床NAFLD經典用藥，但該類藥物具有潛在的不良反應，如體質量的增加以及心血管病風險的增加以及停藥以后肝酶的反彈等。中醫藥防治NAFLD積累了豐富的經驗。其中，香砂六君丸為補脾益氣，燥濕化痰的代表方劑，對NAFLD有較好療效，但其治療機制尚未完全闡明[2]。線粒體為細胞內氧化呼吸與產能的主要場所，通過氧化磷酸化過程提供維持正常生理活動的能量，NAFLD誘導的線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量產生并激活蛋白激酶C、己糖胺和多元醇等途徑是糖尿病慢性并發癥發生、發展的共同機制[3]。因此，本研究通過香砂六君丸治療NAFLD大鼠，觀察大鼠肝臟組織線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數與呼吸鏈復合體表達的改變，探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠24只，8周齡，體質量（180±20）g，購于廣東省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002，飼養于廣州體育科學研究所實驗動物中心SPF級動物房，實驗過程符合廣州體育科學研究所動物倫理學標準。自由攝食與飲水，溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每天光照與黑夜時間各為12 h。

1.2 主要試劑與儀器 香砂六君丸濃縮丸購自河南仲景宛西制藥股份有限公司；AU5800全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Blood＆Cell Culture mini Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；PCR引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司；線粒體復合物I和IV的相關試劑均購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒與ECL化學發光試劑盒均購自美國Thermo公司；CFX-96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；特氟龍組織研磨器購自美國Wheaton公司；全波長多功能酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模及給藥：24只大鼠適應性飼養1周后隨機分成3組：正常對照組、模型組和治療組，每組8只。模型組與治療組采用高脂飼料（80%基礎飼料、18%豬油和2%膽固醇）喂養來制作NAFLD大鼠模型[3]。8周后，治療組給予香砂六君丸濃縮丸，以劑量1.35 g·kg-1·d-1（按照人體等效劑量計算并結合預實驗）連續灌胃4周；正常對照組與模型組予以等體積的溶媒，連續灌胃4周。實驗結束后麻醉處死大鼠，取肝臟組織標本。

1.3.2 生化指標檢測：10%水合氯醛（0.5 mL·kg-1）麻醉大鼠后，腹腔腹主靜脈取全血6 mL，分別注入肝素抗凝管6 mL，迅速混勻，低溫離心（3 000 r/min）后上機檢測。

1.3.3 肝臟組織病理變化檢測：將新鮮肝臟組織在冰磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中反復洗滌，在4%中性甲醛溶液（pH 7.4）中固定，乙醇梯度脫水，切片，HE染色，觀察肝臟組織形態學變化。

1.3.4 Real time PCR檢測肝臟組織mtDNA拷貝數的表達量：取大鼠肝臟組織，Blood＆Cell Culture mini Kit提取肝臟組織總DNA，測定濃度后調整成一致濃度，選取線粒體基因編碼ND1為目的基因，核基因編碼的β-actin為內參基因，ND1基因（正向序列：5’-ATTCTAGCCACAAGTCTTT-3’，反向序列：5’-GGAGGACGGATAAGAGGATAAT-3’）與β-actin基因（正向序列：5’-GAAATCGTGCGTGATTAAAG-3’，反正向序列：5’-ATCGGAACCGCTCATTG-3’）是通過NCBI全序列設計。擴增反應體系：10 μL SYBR Green Supermix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，DNA模板2 μL，ddH2O為7 μL。PCR儀中Real time PCR反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，39個循環。根據NTC反應有無熒光信號檢出，并結合熔解曲線確認反應體系是否有污染。以β-actin為內參，計算樣品中mtDNA的相對表達量。

1.3.5 線粒體的提取：線粒體提取方法參照文獻[4]：剪取加入組織凍存液凍存的肝臟組織約2 g，組織復蘇液快速解凍組織（體積比為1∶4）。 4 ℃條件下勻漿棒反復勻漿50次，差速離心法提取線粒體，最后的沉淀使用預冷的線粒體緩沖液重懸，即為粗提取的線粒體。

1.3.6 復合物酶活性測定：采用BCA法檢測線粒體濃度，調成一致濃度后液氮反復凍融3次，破碎線粒體。根據文獻[5]配制復合物體系I和IV，使用紫外分光光度計分別在340 nm和550 nm條件下進行檢測。

1.4 統計學處理方法 使用SPSS20.0軟件對數據進行統計分析。數據以 ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 正常組大鼠體格健壯、反應與行動迅速敏捷、被毛光澤緊密。高脂飲食8周的大鼠出現體質量增加、活動減少精神狀態疲乏、皮毛枯黃，與正常對照組大鼠體質量相比，模型組大鼠體質量顯著升高（F=8.892，P＜0.01）符合NAFLD大鼠的形態表現，提示大鼠模型造模成功。與模型組大鼠比較，治療組大鼠體質量有一定程度的降低（F=11.332，P＜0.01），反應力與活動情況有所改善，被毛光澤度增加。見表1。

2.2 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟質量的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟組織濕重增加，并且相應質量指數（肝臟濕重/體質量）也顯著升高，差異均有統計學意義（F=7.371、9.164，P＜0.01）。較模型組，治療組大鼠體質量與肝臟濕重增加情況均顯著減輕，并且相應質量指數也顯著降低（F=13.668、11.032，P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠體質量、肝臟濕重和質量指數比較（n=8，±s）

2.3 香砂六君子丸對NAFLD大鼠血清生化指標的影響 造模后第12周時，大鼠血清生化檢測結果顯示，模型組血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平明顯高于正常對照組（F=6.917、8.332，P＜0.05）；而甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、葡萄糖（glucose）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）在2組大鼠間差異均無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比，治療組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯降低（F=9.362、11.733，P＜0.05），而TG、HDL-C、glucose、AST、ALT在2組大鼠間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血清生化指標比較（n=8， ±s）

2.4 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟組織結構的影響 肝臟組織HE染色后光鏡下觀察：正常對照組大鼠肝小葉和肝細胞結構正常，肝細胞排列整齊，無腫脹和脂肪變性，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠與正常對照組比，肝臟脂肪變性明顯，肝細胞間呈現大量脂肪滴，部分肝細胞呈氣球樣變，而治療組大鼠較模型組肝細胞脂肪滴及氣球樣變減少，無明顯炎性細胞浸潤，細胞結構趨于正常，見圖1。

2.5 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟mtDNA拷貝數的影響 與正常對照組（1.001±0.080）相比，模型組大鼠肝臟組織mtDNA拷貝數（0.669±0.069）顯著降低（F=10.171，P＜0.01），治療組較模型組大鼠mtDNA拷貝數（0.864±0.065）顯著升高（F=8.221，P＜0.01）。

圖1 3組大鼠肝臟HE染色結果（×200）

2.6 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟線粒體復合物活性的影響 模型組大鼠肝臟組織線粒體內復合物I和IV的活性較正常對照組均顯著降低（F= 14.221、9.873，P＜0.05）；治療組較模型組復合物I和IV的活性顯著升高（F=11.065、13.699，P＜0.05），但與正常對照組相比，2組復合物I和IV的活性差異無統計學意義（F=2.331、1.986，P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠肝臟組織線粒體復合物活性比較（n=8，

表3 各組大鼠肝臟組織線粒體復合物活性比較（n=8，

與正常對照組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01

組別 線粒體復合物I 線粒體復合物IV正常對照組 0.563±0.088 2.638±0.124模型組 0.188±0.055a 1.285±0.186a治療組 0.312±0.038b 1.937±0.143b F 28.309 24.667 P 0.001 0.007

3 討論

NAFLD包括肝細胞脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化等一系列病理變化。現如今，該病隨著人們的生活品質的提高發病率也逐漸增加，尤其在發達國家人群最為突出[6]。臨床研究發現NAFLD為代謝紊亂引起的代謝綜合征的肝臟表現，嚴重時會導致糖與脂肪代謝異常，并誘發心腦血管系統以及內分泌系統相繼發生病變[7]。本研究發現較正常對照組，模型組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯升高，肝臟組織結構出現大量空泡化，細胞核固縮，表明NAFLD對肝臟造成了一定的損傷。

作為機體各項生命活動的核心與樞紐，線粒體主要為能量代謝和遺傳變異兩大機能提供了基本場所。線粒體的功能是否正常，在一定程度直接決定了細胞所在的臟腑以及整個機體的生命活動[8]。與核DNA不同，mtDNA無組蛋白包被，且線粒體內酶修復的系統并不完善，更容易受到氧化磷酸化過程產生的ROS損傷而引起高發突變[9]。線粒體結構損傷、電子傳遞鏈被抑制、酶活性降低、mtDNA的突變或缺失等都會引起能量代謝障礙，進而出現相互損傷的系列過程，即為線粒體功能異常[10-11]。較正常對照組，模型組大鼠mtDNA含量顯著降低，表明NAFLD造成了線粒體數量減少，mtDNA結構損傷，有線粒體參與的相關能量代謝功能減弱。

氧化磷酸化是由線粒體呼吸鏈完成的，線粒體內膜呼吸鏈是位于線粒體的一個重要酶系，由四個大分子跨膜蛋白（復合物I、I I、I I I和IV）和輔酶Q以及細胞色素C構成的。mtDNA在復合物I和IV上分別編碼了7個和3個亞單位，占mtDNA上總的蛋白編碼區的83.6%。復合物I作為線粒體在呼吸鏈中重要的組成成分，減弱其活性可以削弱呼吸鏈整體傳遞電子與產生能量的能力；復合物IV是呼吸鏈中的關鍵酶之一，它又是最脆弱、最不穩定、最易受損的酶，其酶活性的改變將直接造成整個呼吸鏈的功能變化[12]。在氧化磷酸化過程中，復合物I與復合物IV直接影響線粒體的能量代謝功能。較正常對照組，模型組復合物I與復合物IV活性顯著性降低，表明NAFLD不僅引起線粒體結構損傷，也一定程度影響了線粒體的功能，導致氧化呼吸的過程減弱。模型組大鼠mtDNA以及線粒體氧化呼吸鏈的損傷導致了更多的電子泄漏，從而導致ROS產生量增加，其環狀結構斷裂，編碼的相關呼吸鏈上的亞基合成減少，能量代謝減弱，發生氧化應激反應，改變分子的結構，能夠破壞核酸、蛋白質和脂質等生物大分子，最終導致肝臟細胞功能損傷和凋亡，引起線粒體氧化應激的惡性循環，從而產生NAFLD相關肝臟損傷的臨床表現。

本研究采用的香砂六君丸濃縮丸包含黨參、白術（炒）、茯苓、半夏（制）、陳皮、甘草（蜜炙）、木香、砂仁、生姜、大棗，具有燥濕化痰、補脾益氣的功效，主治食量不多，氣虛痰多，腹脹便溏等的脾虛氣弱的癥狀[13]。在給予NAFLD大鼠香砂六君子丸治療后，治療組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯降低，肝細胞脂肪變性減少，空泡化減輕，細胞結構趨于正常。與模型組大鼠比較，治療組大鼠線粒體結構與功能的損傷減輕，mtDNA拷貝數與復合物I與復合物IV活性顯著性升高，提示香砂六君丸可以減輕NAFLD大鼠氧化應激引起的線粒體受損程度，從而提高線粒體對氧自由基的防御能力[14]。本研究發現香砂六君丸對NAFLD導致的線粒體mtDNA拷貝數與線粒體復合物活性損傷起到一定的調節作用，但其具體作用機制還有待深入研究。

利益沖突申明 本研究無任何利益沖突

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Effect of Xiangsha Liujunzi Pill on liver’s mitochondrial of rats with nonalcoholic fatty liver disease

LOU Linjie1, YOU Yanting2, MA Ke2, CHEN Zewei2, SUN Xiaomin2, ZHOU Lin3.
1.Department of Traditional Chinese Medicine, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou, 510515; 3.Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, 510515

Objective： To observe the effect of Xiangsha Liujunzi Pill on liver’s mitochondrial in rats with nonalcoholic fatty liver disease. Methods： Under specific pathogen free (SPF) conditions, 24 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group, high fat and high cholesterol diet group (HFD)and Xiangsha Liujunzi Pill (1.35 g·kg-1·d-1) treatment group. After 12 weeks, all rats were executed to get liver samples. Blood paramaters were analyzed by automatic biochemical. The copy number of mitochondrial DNA(mtDNA) and the activity of mitochondrial respiratory chain complex I, IV in liver samples was analysized with RT-PCR and UV spectrophotometer respectively. Results： Compared with control group, the hepatic wet weight and mass index (hepatic wet weight/body mass) increased signif i cantly, levels of total cholesterol (TC) and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-C) in serum were signif i cantly increased, and the copy number of mtDNA and the activity of complex I, IV expression were signif i cantly decreased in HFD group. Compared with HFD group, the liver wet weight and quality index of rats were signif i cantly reduced, levels of TC and LDL-C in serum were signif i cantly increased, and the copy number of mtDNA and the activity of complex I, IV expression were signif i cantly increased in Xiangsha Liujunzi Pill treatment group. The HE staining of liver showed that the livers sections of HFD group were abundant of macrovesicular fat droplets in hepatocytes and large quantities ofballooned hepatocytes in centrilobular parenchyma with in fi ltration of in fl ammatory cells and fi brosis. The livers sections of HFD group showed that the macrovesicular fat droplets decreased and the nucleus consolidation was reduced. Conclusion： Xiangsha Liujunzi Pill would has effect on nonalcoholic fatty liver disease. Xiangsha Liujunzi Pill can regulate the disordered mitochondrial respiratory chain complex in nonalcoholic fatty liver disease.

nonalcoholic fatty liver disease; Xiangsha Liujunzi Pill; mitochondrial resporatory chain complex;DNA, mitochondrial

R2-031

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.004

2016-10-22

國家自然科學基金資助項目（81202622）；廣東省自然科學基金資助項目（2014A030313292）；廣州市產學研專項（2014Y2-00504）。

婁林潔（1985-），女，浙江溫州人，住院醫師，碩士。

周琳，副主任醫師，Email：zlecho@163.com。

賈建敏）