PRKAA2基因多態性與阿托伐他汀對2型糖尿病患者降脂穩定斑塊療效的關系

葉榮蘋 李晟 劉偉 黃智慧 陳雷 肖建新

PRKAA2基因多態性與阿托伐他汀對2型糖尿病患者降脂穩定斑塊療效的關系

葉榮蘋 李晟 劉偉 黃智慧 陳雷 肖建新

目的 探討PRKAA2基因多態性與阿托伐他汀鈣在2型糖尿病伴動脈粥樣硬化患者降脂穩定斑塊作用的相關性。方法 2型糖尿病伴動脈粥樣硬化患者203例，常規口服阿托伐他汀3個月后復查頸部B超，按照頸動脈斑塊預后結果分顯效組（116例）及失效組（87例），應用基因測序技術檢測PRKAA2基因多態性。結果 顯效組PRKAA2基因多態性（rs2796516位點）G等位基因頻率顯著高于失效組（64.7% vs 54.6%），顯效組GG基因型顯著高于失效組（39.7% vs 33.3%），差異有統計學意義（P＜0.05）。余基因型比較差異無統計學意義。結論 PRKAA2基因（rs2796516）位點與阿托伐他汀鈣降脂穩定斑塊的效果存在一定的相關性，單倍型模塊（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT單倍型對阿托伐他汀鈣降脂穩定斑塊的失效也存在一定作用。

腺苷酸活化蛋白激酶 基因多態性 動脈粥樣硬化

Objective To explore the relevance of PRKAA2 gene polymorphism and atorvastatin in lipid-lowering to stabilize plaques in type 2 diabetes mellitus. Methods 203 cases with atherosclerosis in patients with type 2 diabetes were collected and checked neck ultrasound after 3 months of regular oral atorvastatin. They were divided into excellent group（116 cases）and failure group（87 cases）according to the prognosis of carotid plaques，detection PRKAA2 gene polymorphism was detected with the genetic sequencing technology. Results The PRKAA2 gene polymorphism（rs2796516 loci）G allele frequency in excellent group was signif i cantly higher than the failure group（64.7% vs 54.6%），GG genotype of excellent group was signif i cantly higher than the failure group（39.7% vs 33.3%），the difference was statistically signif i cant（P＜0.05）.Genotype was no statistical difference. Conclusion There is certain correlation between PRKAA2 gene（rs2796516）site with atorvastatin calcium the effect of lipid stable plaques，then haploid type module（rs1124900 - rs2796516 - rs2746342 rs2051040 - rs2796498 - rs17848595 - rs1418442）of GATCAAT haploid type of atorvastatin calcium lipid stable plaques failure also has certain effect.

AMP-activated protein kinase（AMPK） Gene polymorphism Atherosclerosis

糖尿病及動脈粥樣硬化是當前嚴重影響人類健康的全球性公共衛生問題，其患病率逐年升高，其中我國糖尿病患病人數位居世界第二。2型糖尿病（T2DM）主要的發病機制是胰島素抵抗和胰島β細胞功能下降。頸動脈粥樣硬化是T2DM常見的大血管并發癥。他汀類藥物通過降低LDL-C明顯降低心血管風險的作用已獲公認，但個體對他汀類藥的反應卻不相同。國內研究證明［1］，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可以通過增加脂肪酸氧化而減少骨骼肌中甘油三酯的合成并改善胰島素抵抗。編碼AMPKα2亞基的基因PRKAA2位于lp3。本文探討PRKAA2基因多態性與2型糖尿病動脈粥樣硬化的發病相關性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2016年12月本院2型糖尿病伴頸動脈粥樣硬化患者150例。所有患者均符合1999 年WHO 糖尿病診斷標準，頸動脈B超檢查結果均符合不穩定型斑塊標準。所有患者均常規口服阿托伐他汀（美國輝瑞制藥有限公司）20mg口服，1次/晚，治療3個月后，電話預約門診隨訪復查頸動脈B超，轉歸至穩定型斑塊為顯效組，不穩定型斑塊為失效組。排除標準：（1）近期曾出現心肌梗死及腦血管疾病。（2）既往使用降脂藥物，無長期使用激素藥物。（3）近期有創傷、手術或血管重建。（4）自身免疫性疾病。（5）因不能耐受藥物導致嚴重不良反應者。（6）肝臟疾病及嚴重腎功能不全及惡性腫瘤。所有患者均為無血緣關系的散發人群，本項目經醫院倫理委員會批準，所有患者均知情并簽署同意書。

1.2 方法 （1）基因檢測：于入院次日清晨空腹留取5ml靜脈血提取DNA。HIF-1基因SNP的選擇基因多態性的檢測，從HapMap 數據庫漢族人群群體中選擇SNPs，基于Tagger程序選擇標簽SNPs，定義參數為r2≥0.80和少見等位基因頻率（MAF）≥5%。最終選取代表性的SNPs位點共7個（rs1124900；rs2796516；rs2746342；rs2051040；rs2796498；rs17848595；rs1418442）。使用 primer 5.0設計引物，采用直接測序方法，讀取個體的基因型。（2）頸動脈粥樣硬化檢測方法及診斷標準：檢測頸總動脈、頸總動脈分叉處和頸內動脈起始段2. 0 cm范圍內粥樣硬化情況。將頸動脈內壁分為六種類型：①內膜無增厚。②內膜增厚，IMT＜1.2mm。③扁平斑。④軟斑。⑤硬斑。⑥潰瘍型斑。①～③屬于穩定型斑塊，④～⑥屬于不穩定型斑塊。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。分析等位基因和基因型頻率與動脈粥樣硬化轉歸的關聯性。經Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性，基因型及等位基因頻率的比較行χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。block根據D'＞0.9以及r2＞0.8 進行定義。頻率＜3%單倍型被排除不進行統計學檢驗。計算各SNP間連鎖不平衡程度（D'和r2）。根據可信區間算法定義單倍型塊，并使用期望最大算法估算各單倍型頻率。

2 結果

2.1 PRKAA2基因多態性與預后的關系 PRKAA2基因7個多態性位點的基因型分布結果見表1，兩組rs2796516基因頻率及基因型分布頻率差異有統計學意義（P＜0.05），顯效組G等位基因頻率顯著高于失效組（64.7% vs 54.6%），差異有統計學意義（P＜0.05），基因型分布頻率比較，顯效組GG基因型顯著高于失效組（39.7% vs 33.3%），差異有統計學意義（P＜0.05）。余基因型比較差異無統計學意義。

2.2 連鎖不平衡分析 兩組均未發現連鎖不平衡，見圖 1、2，表 2、3。2.3 單倍體分析 在兩組中定義單倍型塊（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT單倍型頻率，失效組顯著高于顯效組（12.4% vs 4.9%），差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 PRKAA2基因多位點在兩組患者中的分布情況

表2 失效組Linkage Disequilibrium分析

表3 顯效組Linkage Disequilibrium分析

圖2 顯效組Linkage Disequilibrium分析

表4 PRKAA2基因多態性單倍體分析結果

3 討論

2型糖尿病和動脈粥樣硬化是炎癥、胰島素抵抗的不同結果。炎癥參與2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發生，他汀類藥物可減少動脈粥樣硬化所致的心腦血管事件，這可能與這些藥物具有不同程度的抗炎、抗凋亡、改善胰島素敏感性的作用有關。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated proteinki-nase，AMPK）激活后可以通過增加葡萄糖的攝取及脂肪酸的氧化，減少脂肪酸及膽固醇的合成等途徑調節能量代謝，AMPK能感知細胞能量代謝狀態的改變，并通過影響細胞物質代謝的多個環節維持細胞能量供求平衡。AMPK是由催化亞基α、調節亞基β和γ組成的一個異源三聚體。AMPKα2不僅在T2DM發病機制中起著重要作用，對T2DM的治療也有重要意義。AMPKα2的激活是運動療法的降糖作用機制之一。編碼AMPKα2亞基的基因PRKAA2位于lp3，有研究［2-4］報道PRKAA2基因與T2DM及IR有關聯。但在不同人群中研究結果存在差異。

前期研究［5］結果顯示，rs2796516位點GG等位基因的脂聯素水平高于GA及AA基因型，而抵抗素及LCL-C水平顯著低于GA及AA基因型，考慮為rs2796516位點A型等位基因可以通過增加胰島素抵抗的趨勢，加速動脈粥樣硬化過程。推測AMPKα2基因多態性（rs2796516）可能導致AMPK對下游蛋白激酶的磷酸化的調控，血管內皮細胞及周圍組織細胞因ATP減少引起內環境的改變，并使原有的抑制能量消耗負反饋途徑激活不全。從而導致血管內皮細胞的凋亡及動脈粥樣硬化進展。其次也有研究提示PRKAA2基因多態性與動脈粥樣硬化下游細胞因子表達中存在一定相關性［6-8］。此次研究加大樣本量，觀察PRKAA2基因多態性與T2DM伴頸動脈斑塊患者服用阿托伐他汀降脂穩定斑塊作用的關系，結果提示兩組rs2796516基因頻率及基因型分布頻率差異有統計學意義（P＜0.05），顯效組G等位基因頻率顯著高于失效組（64.7% vs 54.6%），顯效組GG基因型顯著高于失效組（39.7% vs 33.3%）。其次單倍體分析提示，單倍型模塊（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT單倍型頻率失效組高于顯效組，提示該單倍型可能與阿托伐他汀降脂穩定斑塊失效存在一定相關性。

本資料結果顯示，PRKAA2基因（rs2796516）位點與阿托伐他汀鈣降脂穩定斑塊的效果存在一定的相關性，其次單倍型模塊（rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442）的GATCAAT單倍型對阿托伐他汀鈣降脂穩定斑塊的失效也存在一定作用。本研究尚存在局限性：（1）本研究樣本量仍偏小，結果仍有待擴大樣本量來證實。（2）由于技術原因，實驗未能直接證實PRKAA2基因多態性在動脈粥樣硬化發生機制。（3）本研究中患者的其他生活習慣及環境因素控制欠佳。

［1］ 劉婧星,任建功,孫保生,等.AMPKα2基因多態性與2型糖尿病及脂聯素、抵抗素的關系.基礎醫學與臨床, 2011, 3(12), 1366-1370.

［2］ Kuang X, Yan M, Ajmo JM, et al. Activation of AMP-activated protein kinase in cerebella of Atm-mice is attributable to accumulation of reactive oxygen species. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 418(2)： 267-272.

［3］ Wallace BK, Foroutan S, O'Donnell ME. Ischemia-induced stimulation of Na-K-Cl cotransport in cerebral microvascular endothelial cells involves AMP kinase. Am J Physiol Cell Physiol,2011, 301(2)： 316-326.

［4］ Venna VR, Li J, Benashski SE, et al. Preconditioning induces sustained neuroprotection by downregulation of adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase. Neuroscience, 2012,201： 280-287.

［5］ 葉榮蘋, 李晟, 施翔翔, 等. 2型糖尿病女性人群AMPKα2基因多態性與冠心病及脂聯素抵抗素的關系. 浙江臨床醫學, 2015,17(5)： 705-707.

［6］ Wang Q, Wu S, Zhu H, et al. Deletion of PRKAA triggers mitochondrial fission by inhibiting the autophagy-dependent degradation of DNM1L. Autophagy, 2017, 13(2)： 404-422.

［7］ Di Magno L, Basile A, Coni S, et al. The energy sensor AMPK regulates Hedgehog signaling in human cells through a unique Gli1 metabolic checkpoint. Oncotarget, 2016, 7(8)： 9538-9549.

［8］ Liu L, Pan Y, Song Y, et al. Activation of AMPK α2 inhibits airway smooth muscle cells proliferation. Eur J Pharmacol, 2016,791： 235-243.

浙江省溫州市科技計劃項目（Y20130363）

325000 浙江溫州 解放軍第一一八醫院