與小麥三雌蕊基因(Pis1)連鎖的SRAP標記研究

胡召杉，楊在君*，彭正松

(1.西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.西昌學院 農業科學學院，四川 西昌 615013)

與小麥三雌蕊基因(Pis1)連鎖的SRAP標記研究

胡召杉1，楊在君1*，彭正松2

(1.西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.西昌學院 農業科學學院，四川 西昌 615013)

【目的】為了尋找與小麥三雌蕊基因Pis1連鎖的分子標記。【方法】利用川麥28(CM28)與其三雌蕊近等基因系CM28TP雜交的F2群體為研究材料，采用SRAP分子標記技術，結合分組混合分析法(BSA)篩選與Pis1基因連鎖的分子標記。【結果】①1936個SRAP引物組合在兩親本CM28和CM28TP中具有多態性的引物組合為224對，多態性引物比例為11.57 %；②利用三雌蕊池和正常池進一步篩選得到m2e36和m16e26 2個與Pis1基因連鎖的SRAP標記；③利用218個F2分離群體檢測，算出m2e36與Pis1基因的圖距為18.22 cM，m16e26與Pis1基因的距離為22.63 cM，這2個分子標記分別位于Pis1 的兩側。【結論】該結果為進一步利用SRAP標記進行小麥基因定位奠定了基礎。

小麥；三雌蕊性狀；Pis1基因；SRAP標記

【研究意義】小麥是典型的復穗狀花絮，其麥穗由多個小穗排列在主穗軸的兩側構成，而小穗又是由著生于小穗軸上的3～5朵小花組成。正常情況下，小花由2個稃片、2個漿片、3個雄蕊和1個雌蕊組成，每朵小花結一粒種子。陳濟世先生最先在小麥中發現一朵小花結3粒種子的突變體，并將其命名為“三粒小麥”，但其親本無法確定[1]。“三粒小麥”又稱“多子房小麥”，它具有較多的可以在雜交小麥制種中利用的優良性狀，如：穗粒數多，稃片開張，角度大等。彭正松教授等對“三粒小麥”進行了多年的田間選育，最后培育出“三雌蕊品系(Three pistils，TP)”。TP性狀是由顯性核基因Pis1控制，與細胞質遺傳無關[2-3]。因此，TP與Murai等人[4]發現的雄蕊雌蕊化品系的遺傳機制不同，且TP具有3個正常的雄蕊和3個可育的雌蕊，一朵小花能結3粒種子，顯著增加了小麥的穗粒數，因而具有較高的育種學價值。利用微衛星標記(SSR)已將Pis1基因定位于2D染色體的長臂上(2DL)，位于SSR標記Xgwm539和Xgwm349之間。但Pis1基因距離SSR標記Xgwm539和Xgwm349均較遠，分別為：17.6和19.5 cM[5]。雖然TP的遺傳基礎基本清楚，但控制三雌蕊性狀發生的Pis1基因的DNA序列信息尚不清楚。要準確克隆Pis1基因，最有效的方法就是圖位克隆，而實施圖位克隆的首要任務是找到與Pis1基因緊密連鎖的分子標記。目前用于小麥基因定位的分子標記主要是SSR標記，但SSR標記在小麥基因組中數量有限無法滿足基因的精細定位要求，因此必須在小麥中開發新的分子標記。【前人研究進展】SRAP(sequence-related amplified polymorphism)標記是Li等[6]開發的一種基于PCR技術的分子標記。SRAP標記具備RFLP、RAPD、SSR和AFLP 等分子標記的優點，同時也克服了上述分子標記的缺點，該分子標記不僅有效和可靠，且使用成本較低。SRAP標記在設計引物時正反引物分別針對DNA序列相對保守的外顯子與變異較大的內含子、啟動子與間隔序列，因此，多數SRAP標記在基因組中的分布是均勻的[7]。目前，SRAP標記已廣范應用于遺傳多樣性研究[8-11]，遺傳圖譜的構建[12-13]和基因克隆[14]等方面。然而，與小麥功能基因連鎖的SRAP標記研究尚未見報道。【本研究切入點】本研究擬篩選與小麥三雌蕊基因Pis1連鎖的SRAP標記。【擬解決的關鍵問題】為Pis1基因的克隆奠定基礎，同時也為其它功能基因的定位提供新的更為有效的分子標記。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料為小麥三雌蕊近等基因系CM28TP和其輪回親本川麥28(CM28)，以及CM28與CM28TP雜交后的F2群體。

1.2 試驗方法

1.2.1 F2群體的構建 分別以CM28為母本和以CM28TP為父本配置雜交組合得到F1代種子。F1種植后套袋自交獲得F2群體。親本及F2群體的218個單株于2014年11月種植于西華師范大學生命科學學院實驗田中，行距20 cm，株距10 cm，統一水肥管理。

1.2.2 性狀調查 性狀統計在小麥成熟期進行，若一朵小花能夠結2粒或3粒種子則記為三雌蕊性狀，若一朵小花只結1粒種子則記為正常雌蕊。

1.2.3 總DNA提取 采集親本及F2群體單株的幼嫩葉片，用植物多糖多酚植物DNA提取試劑盒(LABGENE，瑞士)提取其總DNA。

1.2.4 構建BSA池 選取群體中的三雌蕊性狀單株和正常雌蕊性狀單株各10株，分別等量混合各株DNA，建立DNA三雌蕊池(P)和正常雌蕊池(N)。

1.2.5 SRAP標記分析 采用Li等[6]發表的引物，包括44條SRAP正向引物和44條SRAP反向引物，共1936對引物組合(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應體系、程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染參照楊在君等[10]的方法。

1.2.6 數據統計 數據的統計以條帶的有無作為區別不同基因型的標志，并根據標記在兩親本中的表現進行歸類，將三雌蕊性狀中出現的帶型記為“a”，正常雌蕊中出現的帶型記為“b”，缺失數據記為“-”。標記的命名采用引物組合的方式，如m16e26表示引物組合為Me16和Em26。

1.2.7 連鎖分析 利用Mapmaker3.0，設置LOD≥3.0，對標記進行連鎖分析，采用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳距離。利用Mapdraw繪制連鎖圖[15]。

2 結果與分析

2.1 小麥三雌蕊性狀的遺傳分析

2.2 親本間多態性標記的篩選

利用1936個SRAP引物組合(表1)對2個親本CM28和CM28TP進行篩選。結果發現1936對引物組合中有1926對引物組合(99.5 %)在兩親本中能擴增出清晰的條帶，條帶主要分布在50～1000 bp之間。每對引物組合擴增出的條帶數目不等，擴增最少的引物組合僅出現1個條帶，如Me19-Em37；最多的擴增出21個條帶，如Me22-Em2。大部分引物組合能擴增出3～9個條帶。在1926對引物組合中有224對的擴增產物具有多態性，占所用引物的11.63 %。這224對引物組合共擴增出371個差異性條帶。其中Me5-Em23產生的差異性條帶最多為7條，大部分引物組合產生1～2條差異性條帶。

2.3 Pis1基因定位

利用篩選出的224對在親本間具有多態性的引物組合對三雌蕊池和正常池進行分析，其中引物組合Me2-Em36在三雌蕊DNA池中產生1條特異性條帶(記為m2e36)，Me16-Em26在正常雌蕊DNA池中產生1特異性條帶(記為m16e26)。用建庫的20個單株對2個標記進行驗證，結果2個引物組合特異性明顯，Me2-Em36引物組合在10個三雌蕊單株中，8株擴增出100 bp左右的特征條帶；在10個正常雌蕊單株中，6株無該條帶，4株有條帶(圖1)。Me16-Em26引物組合在10個正常雌蕊植株中，9株擴能增出1條約80 bp的特征條帶，1株無條帶；在10個三雌蕊單株中，9株無條帶，1株有條帶(圖1)。利用Me2-Em36和Me16-Em26引物組合對F2群體218個單株進行PCR擴增，利用Mapmaker3.0計算遺傳距離，Mapdraw繪制連鎖圖，結果表明m2e36與Pis1的遺傳距離為18.22 cM，m16e26與Pis1的連鎖距離為22.63 cM。這2個分子標記分別位于Pis1基因的兩側(圖2)。

表1 正向和反向SRAP引物序列

A：Em2-Me36擴增結果；B：Em2-Me36擴增結果；1：正常雌蕊DNA池；2：三雌蕊DNA池；3～12：三雌蕊單株；13～22：正常雌蕊單株A：The PCR results with primer Em2-Me36；B：The PCR results with primer Em2-Me36；1：Normal pistils DNA pools；2：Three pistils DNA pools；3-12：Three pistils plants；13-22：Normal pistils plants圖1 Em2-Me36和Em16-Me26在三雌蕊池和正常雌蕊池及建池三雌蕊、正常雌蕊單株間的擴增結果Fig.1 PCR results of three pistils and normal pistils DNA pools, 10 three pistils plants and 10 normal pistils plants with primer Em2-Me36 and Em16-Me26

圖2 Pis1基因與SRAP標記的連鎖圖譜Fig.2 A linkage map of Pis1 gene base on SRAP markers

3 討論與結論

正常情況下，小麥一朵小花只結一粒種子，自陳濟世先生發現“三粒小麥”(多子房)以來，由于其具有穗粒數多、稃片開張、角度大等特點，引起了眾多學者的重視。沈光華等[16]利用小麥中國春單體和雙端體定位分析后認為小麥多子房性狀受2個同效異位隱性基因控制，且這2個基因分別位于5DS和6BS染色體上。武軍等[17]認為，小麥的多子房性狀是在三粒小麥細胞質存在的前提下，由1對顯性核基因控制。馬守才等對不同來源的多子房小麥材料研究后發現多子房性狀既有顯性基因，也有隱性基因控制，而且這些基因均位于6B染色體上[18-19]。彭正松教授等對“三粒小麥”進行了多年的田間選育，最后培育出“TP品系”。TP是由一對顯性核基因控制，與細胞質遺傳無關[2-3]。利用SSR分子標記已將控制三雌蕊性狀的Pis1基因定位于2D染色體的長臂上，位于SSR標記Xgwm539和Xgwm349之間，距離Xgwm539 17.6 cM，距離Xgwm349 19.5 cM[5]。

由于小麥中SSR標記數量有限，很難利用SSR標記進行精細定位，因此必須在小麥中開發新的分子標記。SRAP標記是Li等[6]人開發的一種新型的分子標記，他曾利用SRAP標記在油菜(BrassicacampestrisL.)中發現了一個與恢復基因連鎖的SRAP標記。王瑜等人[20]篩選到了一個與苜蓿(MedicagostivaL.)褐斑病(GLS)抗性基因連鎖的SRAP標記。張媛等人[21]從蘋果(MalusdomesticaB.)砧木中篩選出4個與蘋果砧木的耐鹽基因連鎖的SRPA標記。王帥等[22]從亞洲百合(LiliumasiaticaHybrida)中篩選出一個與無粉性狀連鎖的SRAP標記。迄今為止國內外關于SRAP標記用于小麥功能基因定位的報道較少。本研究從1936個SRAP引物組合中篩選出224個多態性引物組合，多態性引物比例為11.57 %。這比黃瓜的多態性引物比例(34.9 %)低[23]，這主要是由于本實驗用于構建F2群體的親本是一對小麥三雌蕊近等基因系CM28TP及其輪回親本CM28。用三雌蕊池和正常池進一步篩選，得到m2e36和m16e26與Pis1基因連鎖的SRAP標記。然后利用218個F2分離群體檢測，算出m2e36與Pis1基因的圖距為18.22 cM，m16e26與Pis1基因的距離為22.63 cM。

本研究雖然找到了2個與Pis1基因連鎖的SRAP標記，但這2個標記距離Pis1基因仍較遠。使用更多的SRAP引物組合和開發AFLP、SNP等標記，正在本實驗繼續進行，以尋找與Pis1基因緊密連鎖的分子標記，達到把Pis1基因精細定位與圖位克隆的目的。本研究雖然未能進一步精細定位Pis1基因，但開發出了與Pis1基因連鎖的SRAP標記，并在染色體上標定出了SRAP標記的位置，這為進一步利用SRAP標記進行小麥的基因定位奠定了基礎。

[1]陳濟世，張嶺華，吳秉禮.“三雌蕊小麥”的發現及選育初報[J].作物學報，1983，9(1)：69-72.

[2]Peng Z S.A new mutation in wheat producing three pistils in a floret[J].Journal of Agronomy and Crop Science, 2003, 189: 270-272．

[3]Peng Z S, Yang J, Wei S H, et al.Characterization of common wheat (TriticumaestivumL.) mutation line producing three pistils in a floret[J].Hereditas, 2004, 141: 15-18.

[4]Murai K, Takumi S, Koga H, et al.Pistillody, homeotic transformation of stames into pistil-like structures, caused by nuclear-cytoplasm interaction in wheat[J].Plant Journal, 2002, 29: 169-182.

[5]Peng Z S,Martinek P, Kosuge K,et al.Genetic mapping of a mutant gene producing three pistils per floret in common wheat[J].Journal of Applied Genetics, 2008, 49: 135-139.

[6]Li G, Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theoretical and Applied Genetics, 2001, 103: 455-461.

[7]李巧燕，林瑞慶，朱興全.SRAP分子標記及其應用概述[J].熱帶醫學雜志，2006，6(4)：467-469.

[8]Ferriol M, Picó B, Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP marker[J].Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(2): 271-282.

[9]Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I, et al.Molecular characterization of buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers[J].Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108: 328-334.

[10]楊在君，彭正松，周永紅，等.利用SRAP分子標記評價小麥三雌蕊近等基因系的遺傳背景[J].核農學報， 2012，26(1)：22-27.

[11]黃如葵，黃熊娟，梁家作，等.利用輻射誘變及分子標記輔助篩選進行苦瓜種質創新[J].南方農業學報,2015,46(3):376-380.

[12]李媛媛，沈金雄，王同華，等.利用SRAP、SSR和AFLP標記構建甘藍型油菜遺傳連鎖圖譜[J].中國農業科學， 2007， 40(6)：1118-1126.

[13]梁小玉，季 楊，白史且，等.基于SRAP分子標記構建的菊苣遺傳連鎖圖譜[J].草業學報，2015，24(5)：153-158.

[14]Li G, Quiros C F.Genetic analysis, expression and molecular characterization of BoGSL-ELONG, a major gene involved in the aliphatic glucosinolate pathway ofBrassicaspecies[J].Genetics, 2002, 162: 1937-1943.

[15]劉仁虎, 孟金陵.MapDraw，在Excel種繪制遺傳連鎖圖的宏[J].遺傳，2003，25(3)：317-321.

[16]沈光華，童一中，沈革志.普通小麥多子房基因單體分析的染色體定位及雙端體分析的染色體臂定位[J].遺傳學報, 1992，19(6)：513-516.

[17]武 軍，李邦琴，趙繼新.三雌蕊小麥多子房性狀的遺傳分析[J].西北農業大學學報，2000，28(6)：58-60.

[18]馬守才, 張改生.多子房性狀應用于雜種小麥的研究Ⅰ多子房性狀基因和細胞質效應[J].西北植物學報,2000,20(6)：949-953.

[19]馬守才，張改生，李紅茹，等.小麥品系多Ⅱ多子房性狀的遺傳分析[J].麥類作物學報, 2006, 26(1)：35-37.

[20]王 瑜，袁慶華，李向林，等.與苜蓿褐斑病(GLS)抗性基因連鎖的SRAP標記研究[J].中國農業科學，2010，43(2)：438-442.

[21]張 媛，孫葉紅，李中勇，等.蘋果砧木SRAP-PCR 反應體系的優化及耐鹽性標記的篩選[J].分子植物育種，2016，14(1)：210-215.

[22]王 帥，辛昊陽，甄 艷，等.一個與亞洲百合無花粉性狀緊密連鎖的SRAP標記[J].分子植物育種，2015，13(10)： 2299-2304.

[23]鄧思立，潘俊松，何歡樂，等.黃瓜M基因連鎖的SRAP分子標記[J].上海交通大學學報(農業科學版)，2006， 24(3)： 240-244.

AnalysisofSRAPMarkersAssociatedwithThreePistilsGene(Pis1)inWheat

HU Zhao-shan1，YANG Zai-jun1*，PENG Zheng-song2

(1.Key Laboratory of Southwest China Resource Conservation (Ministry of Education), China West Normal University, Sichuan Nanchong 637009, China；2.College of Agricultural Sciences, Xichang College, Sichuan Xichang 615013, China )

【Objective】This paper aimed to identify the molecular markers linked to three pistils gene (Pis1) in wheat.【Method】The F2population produced by from the crossed of Chuanmai 28 (CM28) and its near isogentic line for three pistils CM28TP were used as materials. The molecular marker associated withPis1 was screened by bulked sergeant analysis (BSA) method and SRAP technology. 【Result】(i)224 pairs showed polymorphism among 1936 pairs of primer, the polymorphic percentage was 11.57 %; (ii) Two specific SRAP marker, m2e36 and m16e26 were found link toPis1 gene in three pistils and normal pistils DNA pool; (iii) After further analysis the 218 F2individuals foundPis1 gene located between the SRAP marker m2e36 and m16e26, 18.22cM distant from m2e36 and 22.63cM distant from m16e26. 【Conclusion】The results could offer the references for further mapping of wheat genes using SRAP markers.

Wheat; Three pistils character;Pis1 gene; SRAP markers

1001-4829(2017)12-2629-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.003

2017-01-20

國家自然科學基金項目(31760425)；西華師范大學英才基金項目(17YC355)

胡召杉(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種研究，E-mail: hzs20151209@163.com；*為通訊作者：楊在君，男，副教授，主要從事小麥遺傳育種研究，E-mail: yangzaijun1@126.com。

S331

A

(責任編輯陳 虹)