瓶內接種菌根真菌對毛棉杜鵑生長與抗性酶的影響

周玉潔，洪文君，黃久香，唐光大

(華南農業大學南方石灰巖植物研究中心，林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642)

瓶內接種菌根真菌對毛棉杜鵑生長與抗性酶的影響

周玉潔，洪文君，黃久香*，唐光大

(華南農業大學南方石灰巖植物研究中心，林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642)

【目的】研究毛棉杜鵑(Rhododendronmoulmainense)的接種效應，篩選較佳的菌種，為毛棉杜鵑高效育種提供參考，并初步揭示菌根提高植株抗性的機理。【方法】選用7種從野生毛棉杜鵑中分離并鑒定的杜鵑類真菌回接到毛棉杜鵑無菌組培苗中，定期觀察生長情況，測定苗高與生物量增長率、菌根侵染率、病情指數、PAL酶與LOX酶活性。【結果】①對照組2周后枯萎，而接菌組均生長良好。②7號菌組苗高生長率與生物量增重率均為最高，分別為71.81 %與83.62 %，其次是17號與14號處理組。③16號的菌根侵染率最高，1號菌種最低。7號的病情指數最低，5號、3號病情指數最高。各接菌處理組的PAL酶和LOX酶活性均高于CK組，16號PAL酶、LOX酶活性最高，為4.82與0.88 U/mg，1號、5號、17號PAL酶活性最低，為1.90～2.20 U/mg，1號、3號LOX酶活性最低，為0.29～0.38 U/mg。相關性分析表明，侵染強度與PAL酶活性和LOX酶活性均有顯著正相關，而病情指數與侵染強度、PAL酶活性和LOX酶活性均呈負相關。【結論】7種真菌均可與毛棉杜鵑無菌組培苗形成菌根共生體，但不同菌種對宿主植物的生長影響有差異， 7號(Bionectriaochroleuca)為最優的菌種，14號(Aspergillussydowii)與17號(Paecilomycesjavanicus)菌種為次優菌種。菌根侵染強度越大更加有益于PAL酶和LOX酶的產生，對植物的抗性與生長可能有一定程度的影響，但與真菌的種類有關。

毛棉杜鵑；杜鵑類真菌；菌根化育苗；生長效應；抗病性；抗逆性

【研究意義】杜鵑類菌根(ericoid mycorrhizas，簡稱為ERM)，又被稱為歐石楠類菌根。特指杜鵑花類植物上形成的菌根，屬于一種特殊的內生菌根類型，對植株的生長產生影響，因此常被應用于菌根化育苗中[1]。幾乎所有的杜鵑花科植物有明顯的菌根結構，每種杜鵑花科植物的根系均寄生了多種菌種，不同菌種對植株的影響有所差異[2]。Vohnik M et al.[3]對Rhododendron‘Azurro’接種ERM菌種后發現不同菌種、菌種組合對營養吸收、根系生物量等有不同程度的影響，同一菌種的不同菌種的接種效應也有一定的差別。有些菌種對植株傷害較為嚴重，導致植株病害；而有些菌種對植株生長促進顯著，或能夠提高植株的抗性能力，表明了優良菌種篩選的重要性。【前人研究進展】為篩選出優良的菌種，通常先進行菌根分離，并運用形態與分子手段鑒定菌種種類[4-5]；通過真菌回接實驗探索各菌種的接種效應，從而篩選優良菌種[6-7]。歐靜等[8]通過測定接種ERM 真菌對桃葉杜鵑幼苗體內的激素含量，表明IAA，GA，ZT，和ZR等激素是促進植株生長的重要原因。杜鵑花類植物多分布于較貧瘠的土壤，ERM對杜鵑植株的抗逆性與逆境環境的營養吸收具有重要的作用[9]。陳可等[10]證明西瓜接種菌根苗能夠激活抗逆性有關的防御性酶，使根系對逆境產生快速反應，從而提高抗連作障礙的能力。【本研究切入點】目前針對菌根與杜鵑類植物抗逆性與抗病性的相關報道較少。毛棉杜鵑為杜鵑花科杜鵑屬的常綠木本花卉，株形優雅，花繁茂而馨香，具有較高的園林應用價值，但由于野生毛棉杜鵑多分布于海拔700～1500 m的山谷[11]，在低海拔地區生長易受到限制，高效菌種的篩選有益于毛棉杜鵑的工廠化育苗的實現。前期研究表明接種菌根有益于提高毛棉杜鵑的抗旱能力[12]，而不同菌種的侵染與相關抗性酶活性的關系尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】本研究以毛棉杜鵑組培苗為研究對象，探索菌根對毛棉杜鵑生長的影響，篩選出較佳的菌種，為毛棉杜鵑的高效育種提供參考；并進一步分析接種真菌后菌根結構對毛棉杜鵑抗逆性與抗病性相關酶的影響，以期初步揭示菌根化育苗提高植株抗性的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試毛棉杜鵑為組織培養的無菌生根苗，苗齡為60 d。菌劑純培養所采用的培養基為MMN培養基[13]。內生真菌菌種均從廣東深圳梧桐山毛棉杜鵑野生植株須根中分離獲得。經廣東省微生物研究所的形態與分子測序鑒定，共有7個菌種(表1)，均為子囊菌門，子囊菌類Hymenoscyphusericae(Read)Korf &Kernan是最早分離和鑒定的一類菌根真菌類型。很多杜鵑類植物都分離出這種內生菌，包括沙龍白珠樹(Gaultheriashallon)[14]、澳石楠(Epacrisimpressa)[15]、Rhododendronobtusumvar.Kaempferi[16]等。

1.2 菌種的接種

將生長狀態良好的組培苗轉接于共生培養基中，每瓶接種4株苗，于室溫條件培養15 d后，待接種。接種時，將5 mm×5 mm左右大小的菌塊，置于裝有生根苗的培養瓶中作為菌源，另將無菌劑的培養苗作為對照組。每個處理3個重復，每個重復15瓶，培養光照溫度為25 ℃，光照培養強度2000 lx，光照時間為12 h/d。培養45 d后，檢測其菌根侵染率、苗高增長率、生物量增重率、病情指數、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和脂氧合酶(LOX)活性。

表1 菌種信息

表2 不同菌種對毛棉杜鵑組培苗生長形態比較

1.3 評價指標

苗高增長率( %)=接菌苗平均增高/接菌前幼苗平均高度×100 %

生物量增重率( %)=接菌苗平均增重/接菌前幼苗平均干重×100 %

菌根侵染率( %)=被侵染的根段數/鏡檢的總根段數×100 %

病情指數= 100×∑(各級病葉數×各級代表值)/(調查總葉數×最高級代表值)

1.4 數據統計分析方法

采用SPSS 19.0軟件多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 7種菌種對毛棉杜鵑幼苗形態特征的影響

從表2和圖1可知，對照組幼苗在生長第8天后老葉開始變黃，第15天時多數幼苗全株枯萎，可能由于植株在無菌條件下無法獨立在MMN培養基中進行營養吸收，導致植株呈現衰亡現象。其他接菌后的植株均表現正常，表明了接種菌種能夠提高植株營養吸收能力。7種菌種對毛棉杜鵑幼苗反應模式主要呈現為3類：①對根系有促進作用，生長較多的須根，莖部健壯，葉片呈綠色，如7號、14號、17號菌種。②對根系有促進作用，生長較多的須根，莖部稍顯細弱，老葉略顯黃色，如3號、5號、16號菌種。③對根系促進不明顯，莖部生長受到影響，葉片生長不良，如1號菌種。

2.2 7種菌種對毛棉杜鵑幼苗生長的影響

接菌45 d后，不同菌種組毛棉杜鵑組培苗的苗高增長率與生物量增重率存在差異(圖2～3)。接種菌種7號的苗高增長率最大，為71.81 %，與其他處理組呈顯著差異。其次是菌種17號、14號、3號處理組，苗高增長率為46.67 %～50.91 %。苗高增長率較低的為菌種5號、16號、1號與CK處理組，苗高增長率為32.00 %～35.75 %。其中1號處理組苗高增長率低于對照組，可能由于接種1號菌種后植株彎曲造成。不同菌種對毛棉杜鵑組培苗的生物量增重率也存在著差異。接種菌種后的生物量增重率均顯著高于對照組，接種菌種7號的生物量增重率最大，為83.62 %。其他的接種菌種處理組增重率為69.27 %～75.24 %。對照組生物量增重率僅為55.26 %。

圖1 不同菌種對毛棉杜鵑組培苗生長形態比較Fig.1 Comparative study on growth morphology of Rhododendron moulmainense after inoculated by different strains

圖2 接種7種菌種后毛棉杜鵑組培苗各處理組苗高增長率比較Fig.2 Comparative study on height growth rates of Rhododendron moulmainense after inoculated by different strains

2.3 7種菌種對毛棉杜鵑幼苗侵染特性與PAL和LOX酶活性的影響

所有菌種在MMN培養基上均能侵染毛棉杜鵑幼苗根系形成菌根，但不同菌種對毛棉杜鵑幼苗的侵染率存在顯著差異(表3)。菌種16號的菌根侵染率最高，高達95.5 %，其次是菌種3、7、14號，侵染率為81.82 %～88.00 %，均顯著高于其他菌種。1、5、17號侵染率最低，為60.00 %～70.00 %。病情指數是全面考慮發病率與嚴重度的綜合指標，不同菌種對毛棉杜鵑幼苗產生一定傷害作用。菌種7號的病情指數最低，與其他處理組呈顯著差異，其次是16、14、1、17號，病情指數介于37.50 %～47.50 %，接種菌種處理中病情指數較高的為5、3號，表明不同菌種對植株傷害作用各不相同，但各接菌處理組的病情指數均低于CK組，可能由于CK組缺乏營養而導致植物病態較為嚴重。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物苯丙烷途徑的關鍵酶和限速酶，與植物的抗逆境能力有著重要的關系。脂氧合酶(LOX)是植物合成愈創激素、愈創酸和茉莉酮酸等產物的限速酶，與植物的抗病性直接相關。試驗結果表明，不同菌種對毛棉杜鵑幼苗PAL酶與LOX酶活性存在差異，各菌種的PAL酶和LOX酶活性均高于CK組(表3)，表明菌根侵染誘導了PAL酶和LOX酶的產生。菌種侵染組中，16號PAL酶活性最高，為4.82 U/mg，其次是3、7、14號，為3.32～3.97 U/mg，PAL酶活性最低的為1、5、17號，為1.90～2.20 U/mg，16號LOX酶活性最高，為0.88 U/mg，其次是5、7、14、17號，為0.53～0.61 U/mg，LOX酶活性最低的為1、3號，為0.29～0.38 U/mg。從相關性分析看(表4)，侵染強度與PAL酶活性和LOX酶活性均有較為顯著的正相關性，而病情指數與侵染強度、PAL酶活性和LOX酶活性均呈顯著負相關關系，表明了侵染的越強，對PAL酶與LOX酶活性生成起到促進作用，PAL酶與LOX酶活性升高，可能會一定程度上減少植株的病情指數，但并不是PAL酶與LOX酶活性越高，病情指數就越高，因此病情指數與真菌種類也有一定關系。

圖3 接種7種菌種后毛棉杜鵑組培苗各處理組生物量增重率比較Fig.3 Comparative study on biomass growth rate of Rhododendron moulmainense after inoculated by different strains

表3 不同菌種對毛棉杜鵑組培苗侵染特性與PAL和LOX酶活性的比較

表4 不同菌種對毛棉杜鵑幼苗侵染特性指標相關性分析

注：* 在置信度(雙測)為 0.05 時，相關性是顯著的。

3 討 論

3.1 不同菌種對毛棉杜鵑生長的影響

近年來組培技術得到推廣應用，但蘭科、杜鵑花類等菌根類植物組培苗在無菌條件下繁殖，缺少菌根真菌侵染導致生長緩慢且質地細弱，移栽到田間后對自然環境適應力差，雖然在自然界中雖然能感染菌根真菌，但延長了緩苗期，且增加了死亡率[17]。因此，本研究在已有的組培技術上進行了瓶內接菌實驗，以提高后期出苗成活率。試驗結果表明，7個菌種對植株生長影響各有差異，Bionectriaochroleuca(7號)、Aspergillussydowii(14號)和Paecilomycesjavanicus(17號)菌種對毛棉杜鵑幼苗促生作用較好，可作為毛棉杜鵑組培苗的高效菌種。菌根結構有助于提高植株營養吸收能力，使植株能在逆境中生長。本研究結果表明，未接菌的對照組在不適宜生長的MMN培養基上無法正常生長，而接菌組均能生長良好。可能由于MMN培養基成分中的營養成分難以被植株直接吸收應用，接種菌根有益于難分解的營養成分被植株吸收應用[18]，不同菌根對營養元素的利用率不同，有些杜鵑類菌根對無機氮的吸收率高，而有些對有機氮吸收率高[19]，且不同菌種對營養成分的吸收不同[20]，因此本研究中各植株呈現不同的生長情況。

3.2 不同菌種對毛棉杜鵑抗性影響

菌根結構能夠提高植物的抗性酶活，從而提高植物的抗性能力[21]。研究[22-23]表明病蟲感染，機械損傷等脅迫均能使植株的相關抗性酶增加[24]。本研究中菌根侵染與植物的抗病性與抗逆性酶活性具有顯著的相關性，與梁軍等[25]以楊樹為研究材料接種菌根后菌根侵染率與抗性酶活性的變化性相似。由此推測菌根侵染過程中真菌對根系的機械損傷可能會使植株的抗性酶增加。杜鵑科植物中，黃酮類的積累是植株葉片呈現紅色的重要次生物質[26]，而苯丙氨酸正是調控黃酮類化合物的重要酶[27]，因此本研究中PAL酶活性較高的7號與16號菌種處理組植株莖或葉出現明顯的紅色。不同菌種對植株的抗病性影響有所差異，雖與菌根侵染植株后植株產生的脂氧合酶有一定的關系，脂氧合酶在菌根真菌的影響下能夠提高植株的抗病力[28-29]，但真菌本身對植株的抗病能力影響較大。本研究中接種Bionectriaochroleuca菌組病情指數最低，此前在多種植物中均分離出此種菌種，此種菌所產生的抗生素類物質可以對某些病原菌起特異性拮抗作用，因此對枯萎病、赤霉病等有防御作用[30-31]，因此，雖然7號菌處理組LOX酶活性低于16號，但卻表現出較低的病情指數。

4 結 論

結果證實7個從毛棉杜鵑野生植物中分離的菌種均可與毛棉杜鵑形成菌根共生體，但不同菌種與宿主植物的親和力存在顯著差異，反映了不同的菌根真菌對毛棉杜鵑植物生長的有益性存在差異及高效菌種篩選的必要性。本次試驗菌種中7號(Bionectriaochroleuca)為最優的菌種，14號(Aspergillussydowii)與17號(Paecilomycesjavanicus)菌種為次優菌種。菌根侵染有益于PAL酶和LOX酶的產生，對植物的抗性與生長可能有一定程度的影響，但與真菌的種類有關。

[1]Read D J. The structure and function of the ericoid mycorrhizal root[J]. Annals of Botany, 1996, 77(4): 365-374.

[2]Jansa J, Vosatka M. In vitro and post vitro inoculation of micropropagated Rhododendrons with ericoid mycorrhizal fungi[J]. Applied Soil Ecology, 2000, 15(2): 125-136.

[3]Vohnik M, Albrechtova J, Vosatka M. The inoculation with Oidiodendron maius and Phialocephala fortinii alters phosphorus and nitrogen uptake, foliar C: N ratio and root biomass distribution in Rhododendron cv. Azurro[J]. Symbiosis, 2005, 40(2): 87-96.

[4]Allen T R, Millar T, Berch S M, et al. Culturing and direct DNA extraction find different fungi from the same ericoid mycorrhizal roots[J]. New Phytologist, 2003, 160(1): 255-272.

[5]Persoh D. Plant-associated fungal communities in the light of meta'omics[J]. Fungal Diversity, 2015, 75(1): 1-25.

[6]歐 靜, 韋小麗, 何躍軍, 等. 接種ERM真菌對桃葉杜鵑幼苗的促生效應及生理生化影響[J]. 林業科學, 2013(7): 48-56.

[7]Starrett M C, Blazich F A, Shafer S R, et al. In vitro colonization of micropropagated Pieris floribunda by ericoid mycorrhizae. II. Effects on acclimatization and growth[J]. Hortscience, 2001, 36(2): 357-359.

[8]歐 靜, 韋小麗, 何躍軍, 等. 接種ERM真菌對桃葉杜鵑幼苗的促生效應及生理生化影響[J]. 林業科學, 2013(7): 48-56.

[9]Kosola K R, Workmaster B A, Spada P A. Inoculation of cranberry(Vaccinium macrocarpon) with the ericoid mycorrhizal fungus Rhizoscyphus ericae increases nitrate influx[J]. New Phytol, 2007, 176( 1):184-196.

[10]陳 可, 孫吉慶, 劉潤進, 等. 叢枝菌根真菌對西瓜嫁接苗生長和根系防御性酶活性的影響[J]. 應用生態學報, 2013(1): 135-141.

[11]吳 志, 劉 念, 王定躍, 等. 深圳市小梧桐毛棉杜鵑種群現狀分析[J]. 林業資源管理, 2009(5): 96-72.

[12]洪文君, 王 盼, 劉 強, 等. 毛棉杜鵑接菌苗對干旱脅迫的生理響應研究[J]. 西南農業學報, 2016(4): 805-809.

[13]宋慧娟, 趙富群, 洪文君, 等. 杜鵑花屬植物內生真菌對毛棉杜鵑幼苗生長的影響[J]. 廣東林業科技, 2015(4): 47-51.

[14]Xiao G, Berch S M. The ability of known ericoid mycorrhizal fungi to form mycorrhizae with Gaultheria shallon[J]. Mycologia, 1995, 87(4): 467-470.

[15]Mclean C, Lawrie A C, Blaze K L. The effect of soil microflora on the survival of cuttings of Epacris impressa[J]. Plant and Soil, 1994, 166(2): 295-297.

[16]Usuki F, Abe J P, Kakishima M. Diversity of ericoid mycorrhizal fungi isolated from hair roots ofRhododendronobtusumvar.kaempferiin a Japanese red pine forest[J]. Mycoscience, 2003, 44(2): 97-102.

[17]王真輝. 菌根真菌在植物組培苗生產技術中的應用[J]. 熱帶農業科學, 2001(5): 71-78.

[18]Kerley S J, Read D J. The biology of mycorrhiza in the Ericaceae. XVIII. Chitin degradation by Hymenoscyphus ericae and transfer of chitin-nitrogen to the host plant[J]. New Phytologist, 1995, 131(3): 369-375.

[19]尹麗娟，張春英，楊 兵. 云錦杜鵑菌根真菌吸收氮源特性及其接種效應[J]. 中國農業科學, 2010(4): 868-872.

[20]Talbot J M, Treseder K K. Controls over mycorrhizal uptake of organic nitrogen[J]. Pedobiologia, 2010, 53(3): 169-179.

[21]趙 忠, 王真輝. 菌根真菌與根際微生物間的關系及其對宿主植物的影響[J]. 西北林學院學報, 2001(1): 70-75.

[22]張 麗, 常金華, 羅耀武. 不同高粱基因型感蚜蟲前后POD、PPO、PAL酶活性變化分析[J]. 中國農學通報, 2005(7): 40-42.

[23]王 祎, 張月玲, 蘇建偉, 等. 施鉀提高蚜害誘導的小麥茉莉酸含量和葉片相關防御酶活性[J]. 生態學報, 2014(10): 2539-2547.

[24]吳 瓊, 方吳云, 王文杰. 機械損傷對茶樹苯丙氨酸解氨酶活性及茶多酚含量的影響[J]. 安徽農業科學, 2016(5): 11-14.

[25]梁 軍, 張 穎, 賈秀貞,等. 外生菌根菌對楊樹生長及抗逆性指標的效應[J]. 南京林業大學學報(自然科學版), 2003(4): 39-43.

[26]張 梅. 杜鵑黃酮類化合物活性成分的動態變化及誘導子對其含量和相關酶活性影響的研究[D]. 福建農林大學, 2012.

[27]張寬朝, 金 青, 蔡永萍, 等. 苯丙氨酸解氨酶與其在重要次生代謝產物調控中的作用研究進展[J]. 中國農學通報, 2008(12): 59-62.

[28]Christensen S A, Nemchenko A, Borrego E, et al. The maize lipoxygenase, ZmLOX10, mediates green leaf volatile, jasmonate and herbivore-induced plant volatile production for defense against insect attack[J]. The Plant Journal, 2013, 74(1):59-73.

[29]Bruinsma M, van Broekhoven S, Poelman E H, et al. Inhibition of lipoxygenase affects induction of both direct and indirect plant defences against herbivorous insects[J].Oecologia, 2010, 162(2): 393-404.

[30]陳 秀, 李景富, 張麗莉, 等. 一株淡色生赤殼菌的生防作用分析及系統發育樹構建[J]. 生物技術通報, 2014(5): 184-189.

[31]宋福強, 王占斌, 王倡憲, 等. 引進菌種Bionectria ochroleuca對幾種植物病原真菌的拮抗效應[J]. 中國農學通報, 2014(18): 166-170.

ImpactofInoculationwithMycorrhizalFungiinvitroonGrowthandResistantEnzymesofRhododendronmoulmainense

ZHOU Yu-jie, HONG Wen-jun, HUANG Jiu-xiang, TANG Guang-da

(South China Limestone Plants Research Center, College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China)

【Objective】The study ofRhododendronmoulmainenseinoculation with mycorrhizal fungi was conducted to select the better strains, and to provide the reference for improving breeding efficiency, also to reveal the mechanism of improving plant resistance by mycorrhizal fungi. 【Method】7 kinds ericoid mycorrhizal fungis, separated from wildRhododendronmoulmainense, were used to inoculateRhododendronmoulmainensetissue culture seedling. Growth situation was observed regularly, and height growth rate, biomass growth rate, mycorrhizal infection rate, disease index, PAL and LOX activity were determined.【Result】(i) Plants of control group were wizened after 2 weeks, but plants of mycorrhizal inoculation treatment were viable.(ii) Height growth rates and biomass growth rates of No.7 treatment were the highest, 71.81 % and 83.62 % respectively, No.17 and No.14 treatment fllowed. Mycorrhizal infection rates of No.16 treatment were the highest, No.1 treatment were the lowest. Disease indexes of No.7 were the lowest, No.5 and No.3 were the highest. PAL and LOX activity of each mycorrhizal inoculation treatment all higher than control group. PAL and LOX activity of No.16 treatment were the highest, 4.82 and 0.88 U/mg respectively, PAL activity of No.1, No.5, No.17 were the lowest, 1.90-2.20 U/mg, LOX activity of No.1, No.3 were the lowest, 0.29-0.38 U/mg. The correlation analysis showed that, colonization intensity were positively correlated with PAL and LOX activity significantly, but disease index were negatively correlated with PAL and LOX activity. 【Conclusion】Each of the 7 kinds ericoid mycorrhizal fungi could form mycorrhizal symbionts withRhododendronmoulmainense, but different fungis had different impact on growth of host plants, the result showed that, No.7(Bionectriaochroleuca) was the optimal fungi, No.14(Aspergillussydowii)and No.17(Paecilomycesjavanicus) were the second choices. Higher mycorrhizal infection rate helped to improve PAL and LOX activity. It may have an impact on resistant and growth of plants, but resistant and growth of plants were more impacted by species of fungi.

Rhododendronmoulmainense; Ericoid mycorrhizal fungi; Seedling of mycorrhizal fungi; Growth effect; Disease resistance; Stress resistance

1001-4829(2017)12-2687-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.012

2017-02-17

廣州市科技計劃項目(11C12100776/L1110887)

周玉潔(1992-)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事園林植物運用研究；*為通訊作者：黃久香(1975-)，女，副教授，E-mail：137877360@qq.com。

S685.21

A

(責任編輯李 潔)