柱前衍生GC-MS-SIM法分析煙草中西柏三烯醇

李小蘭，黃善松，賈海江，楊 俊，錢曉波，徐雪芹*

(1.廣西中煙工業有限責任公司， 廣西 南寧 530001；2. 中國科學技術大學煙草與健康研究中心，安徽 合肥 230051)

柱前衍生GC-MS-SIM法分析煙草中西柏三烯醇

李小蘭1，黃善松1，賈海江1，楊 俊2，錢曉波2，徐雪芹1*

(1.廣西中煙工業有限責任公司， 廣西 南寧 530001；2. 中國科學技術大學煙草與健康研究中心，安徽 合肥 230051)

【目的】研究煙葉中西柏三烯醇的分析測定方法，為研究煙葉中西柏三烯醇與煙葉品質的關系提供參考。【方法】建立一種雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化GC-MS-SIM測定煙草中2種西柏三烯二醇的方法，通過對提取試劑，試劑體積，提取方式和提取時間四個因素進行探討?！窘Y果】煙葉樣品中西柏三烯二醇的最佳提取溶劑為二氯甲烷，采用超聲方式，超聲時間為10 min；衍生化最佳條件為20 ℃下加入體積比為3∶2的吡啶：三氟乙酰胺(BSTFA)溶液，反應時間100 min。采用該方法，對不同產地煙葉進行樣品中的西柏三烯醇類物質定量檢測，結果表明不同產區煙葉中西柏三烯醇含量差異較大?！窘Y論】該方法重復性、精密度良好，且操作簡單，耗時少，可有效對不同產地的煙葉樣品中的西柏三烯醇類物質進行定量檢測。

西柏三烯醇；衍生化；GC-MS SIM；煙草

【研究意義】西柏三烯醇類物質是植物生長的調節劑以及煙草香氣物質的前體物，它最初是以無味物質存在于新鮮煙葉中。西柏三烯二醇在煙草調制、陳化及燃燒過程中易發生氧化和降解反應，產生多種降解產物，如茄酮、茄醇和降茄二酮等，而這些降解產物是非常重要的煙草香味成分。研究表明添加有西柏三烯二醇的卷煙與對照樣相比具有可可香味，余味干凈，吃味豐滿，較高含量的添加可產生輕微的花香韻，較低含量的添加則產生淡雅的粉香韻[1]，對研究煙葉的香型特征和烤煙品質具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有研究表明煙草腺毛的主要物質是類西柏烷和類賴百當二萜、表面蠟、糖脂和部分微量元素[2-4]，煙葉腺毛分泌物主要成分為類西柏烷類物質[5-6]。相關研究報道顯示鮮煙葉中西柏烷二萜醇含量占葉面總脂類物質的50 %，其占鮮葉重的0.7 %[7-8]。西柏三烯類物質中含有一個不同氧化程度的十四元“西柏烷”大環[9]。其中，煙葉中的西柏三烯類物質主要是(1S, 2E, 4R, 6R, 7E, 11E) 西柏-2, 7, 11-三烯-4, 6-二醇 (α-CBD)和 (1S, 2E, 4S, 6R, 7E, 11E) 西柏-2, 7, 11-三烯-4, 6-二醇 (β-CBD) (二者分子式均為C20H34O2)。Yilmaz等采用GC-MS對轉基因和非轉基因鮮煙葉中的西柏三烯醇類物質進行了半定量分析[10]?？坠廨x等采用氣質聯用方法，研究品種烤煙為K326的上中下不同部位成熟葉片中腺毛分泌物的變化情況[11]。吳云平等按照烤煙的品種不同，采用芳樟醇為內標，對腺毛分泌物進行了分析檢測[12]。錢曉波等采用加速溶劑萃取(ASE)氣質聯用法對萃取液中的目標物進行定性、定量檢測[13]。目前，煙草中西柏三烯醇的檢測方法主要有三種：高效液相色譜法、氣相色譜法、和氣質聯用法[14]。其中氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)是開發最早，儀器最完善、應用最廣泛的一種[15]?！颈狙芯壳腥朦c】從優化進樣方式著手，擬采用柱前衍生化的方法，提高煙草中西柏三烯醇的測定精度?！緮M解決的關鍵問題】建立一種雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化GC-MS-SIM測定煙草中兩種西柏三烯二醇的方法，應用所建方法對不同產地煙葉中的西柏三烯醇類物質進行了定量分析，為進一步研究西柏三烯醇與煙葉品質的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二氯甲烷為色譜純(天津賽孚瑞科技有限公司)。吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃均為分析純(上海德諾化工有限公司)。衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(內含1 %三甲基氯硅烷TMCS)、三甲基硅烷咪唑(TMSI)、以及N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)(日本東京化成工業株式會社公司)。

標準品：α-西柏三烯二醇(10 mg)、β-西柏三烯二醇(10 mg)(美國LKT Laboratories公司，純度均為98 %)。內標物正十九烷(美國A Johnson Matthey公司，純度為99 %)。

烤煙樣品由廣西中煙工業有限責任公司提供，取自2012-2014年度廣西、云南、貴州3地的不同產區，品種為紅花大金元。煙葉用被研磨至60目，混合均勻后置于冷暗處儲藏，用于分析檢測。

1.2 試驗儀器

氣相色譜-質譜聯用儀Thermo ISQ GC/MS (ThermoFisher)，DB-5MS毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) (美國Agilent公司)，CQX25-12超聲儀(上海必能信超聲有限公司，80W)；EL204型電子分析天平：感量0.0001 g(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市友聯儀器研究所)；旋風精密粉碎機：1095 Cyclotec(XF-98B)型(美國)；KDM-1000型可調式電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標準工作溶液的配置 標準溶液的配置：用二氯甲烷分別溶解α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇，然后轉移到10 mL的量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，此溶液即為α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的標準溶液(濃度均為1.0 mg/mL)。

內標溶液的配制：準確稱取正十九烷250 mg，放置于50 mL的容量瓶中，用CH2Cl2稀釋至刻度，即為內標溶液。

1.3.2 標準曲線的繪制 分別移取1，50，100，150，200 和270 μl的α-西柏三烯二醇標準溶液至2 mL的色譜瓶中，再分別加入200 μl的內標液。分別移取1，30，50，80，120和160 μl的β-西柏三烯二醇標準溶液至2 mL的色譜瓶中，再分別加入200 μl的內標液。蒸干溶劑后，往色譜瓶中加入1 mL的衍生化試劑溶液。

對以上2組標準溶液進行衍生化反應，然后用上述GC-MS方法進行測定，并以濃度為橫坐標，目標分析物峰面積與內標物峰面積比(A/AIS)為縱坐標分別繪制α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的標準曲線。

1.3.3 樣品前處理及衍生化條件 準確稱取0.5 g 煙末(精確至0.001 g)，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL提取溶液(二氯甲烷)，超聲振蕩10 min后，用10 mL的移液管移取10 mL上清液置于濾管中，通過濾膜(有機系，13 mm×0.45 μm)注入樣品瓶中，加入200 μl內標液，在70 ℃的條件下水浴蒸發去除溶劑。加入吡啶：BSTFA的體積比為3∶2的溶液 1000 μl，洗滌樣品瓶器壁，將溶液分多次轉入色譜瓶。在75 ℃水浴中進行衍生化反應100 min，得到GC-MS分析溶液。

1.3.4 GC/MS分析條件 GC條件：進樣口溫度設為250 ℃，進樣量為1 μl；載氣為He，流速為1.2 mL/min；進樣方式為不分流進樣。柱溫箱的升溫程序：起始溫度160 ℃，保持2 min，后以10 ℃/min升到210 ℃，保持35 min，再以10 ℃/min升到250 ℃，保持15 min。MS條件：傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度280 ℃；電離源為EI，電離能70 eV，溶劑延遲7 min。質譜的掃描模式有2種：采用全掃模式對目標成分進行定性檢測，掃描范圍為40～600 amu；目標成分的定量檢測采用SIM模式，每種目標物選擇1個定量離子、3個定性離子。衍生化后的α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇以及內標物的特征掃描離子詳見表1。

表1 3種物質的保留時間、定性離子及定量離子

1.4 統計分析

質譜圖通過NIST 08 (National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD)標準譜圖庫的檢索定性。數據用Xcalibur 1.1 軟件 (Thermo Quest)記錄并處理。

2 結果與分析

圖1 提取溶劑Fig.1 Extraction solvent

圖2 試劑體積Fig.2 Reagent volume

2.1 提取條件選擇

本研究對提取煙草樣品西柏三烯二醇的萃取劑、溶劑體積、提取方法和提取時間等4個條件進行探討和優化。從二氯甲烷、三氯甲烷和乙腈3種提取溶劑提取效率比較(圖1)可以看出，二氯甲烷的提取效果要好于其他2種溶劑。因此，最佳提取溶劑為二氯甲烷。從圖2可以看出，隨著提取溶劑增加，提取出的目標物量逐漸增加。提取溶劑超過50 mL時達到穩定，因此提取溶劑體積確定為50 mL。從機械振蕩和超聲振蕩兩種提取方式的提取效率比較(圖3)可見，采用超聲振蕩的提取效果明顯高于所采用的的機械振蕩。因此，提取方式為超聲振蕩。從圖4可看出，對大部分目標物而言，提取時間對目標物的萃取效率影響不顯著，綜合考慮各目標物的提取效率，本研究選擇的最佳提取時間為10 min。

圖3 提取方式Fig.3 Extraction method

圖4 靜態提取時間Fig.4 Static time

2.2 衍生化條件

2.2.1 衍生化前后對比 直接將所配置的西柏三烯二醇標準溶液進行GC-MS分析(質譜掃描方式為全掃模式)，圖5～6分別為α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇標準溶液(1000 μg/mL)的色譜圖。對圖5～6色譜圖的每一個峰進行質譜檢索，在圖5中，檢測到36.03，36.40，39.43 min所對應的色譜峰的物質為西柏三烯二醇(匹配度為40 %左右)。在圖6中，檢測到36.01 min所對應的色譜峰的物質為西柏三烯二醇(匹配度為39.66 %)。其余色譜峰均視為雜質峰(檢索出物質的匹配度都在20 %以下)。這可能是由于西柏三烯二醇沸點高(431.8 ℃)，而在色譜圖上出現了多時間保留。根據文獻[10,15]，對標準溶液進行衍生化反應，然后將衍生化后的溶液進行GC-MS分析(質譜掃描方式為全掃模式)，得出衍生化后α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的色譜圖(圖7)。

從上述色譜圖中可以看出，衍生過后，色譜圖比較純凈，僅保留所要檢測的3種物質，解決了衍生前出現的多時間保留問題。衍生化反應后標準溶液的色譜圖出峰單一，且衍生后的α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇彼此間分離較好，因此，本研究采用樣品進柱前進行衍生化處理。

康師傅控股有限公司執行長韋俊賢在采訪中誠摯地說：“康師傅本身就是改革開放的成果，也是改革開放的見證者、親歷者和受益者。沒有改革開放，就沒有康師傅。”

圖5 衍生化前α-西柏三烯二醇標準品色譜圖Fig.5 Before derivatization α-Cembranoids

圖6 衍生化前β-西柏三烯二醇標準品色譜圖Fig.6 Before derivatizationβ-Cembranoids standard chromatogramtandard chromatogram

2.2.2 衍生化條件優化 衍生化反應主要受衍生化試劑、衍生化溶劑、衍生化溫度、衍生化試劑與溶劑的比例、衍生化時間等因素的影響[16]。本研究對以上各因素分別進行探討。從采用的BSTFA、MSTFA和TMSI3種衍生化試劑的效果看(圖8)，從中可以看出，3種衍生化試劑對西柏三烯二醇的衍生化效果差異不大，從經濟角度出發，考慮使用BSTFA或者TMSI，但目前商品化的N，O-雙( 三甲硅基) 三氟乙酰胺( BSTFA )(其中加入了1 %的催化劑TMCS)的使用最廣泛[20]，因此，選用BSTFA作為衍生化試劑。

衍生化介質是衍生化反應的外部環境，衍生化介質的選擇至關重要，結合文獻報道[17-19]，本研究選用二甲基甲酰胺DMF，吡啶，四氫呋喃THF，二氯甲烷作為介質進行探討，從圖9中可以看出，不同的衍生化介質對衍生化效果影響較大。根據4種介質的極性，選用吡啶作為衍生化應介質。

衍生化試劑與衍生化介質比例可以提高衍生化反應的效率，本研究固定衍生化介質與衍生化試劑的總體積為1000 μl，改變兩者的量得到不同衍生化介質與衍生化試劑的比例?？疾炝?∶1，3∶2，1∶1，2∶3和1∶3(v/v)對衍生化反應的影響，從圖10可知，當衍生化介質與衍生化試劑的比例為3∶2時，衍生化效果最好。因此，選擇衍生化介質與衍生化試劑比例為3∶2。

圖7 衍生化后西柏三烯二醇標準品色譜圖Fig.7 After derivatization Cembranoid standard chromatogram

圖8 衍生化試劑Fig.8 Derivatization reagent

圖9 衍生化介質Fig.9 Derivatization media

圖10 衍生化試劑與介質比例Fig.10 Ratios of derivatization medium to derivatization reagent

本研究分別選10、20、30、45、60和75 ℃衍生化溫度進行分析，從圖11可看出，溫度的影響不明顯，綜合考慮兩種目標物的衍生化效果，本研究選擇的最佳衍生化溫度為20 ℃。溫度高低對該衍生化反應的影響并不是非常明顯，這可能與所用的衍生化試劑里加了1 %的催化劑三甲基氯硅烷有關。

一般情況下，衍生化時間越長衍生化進行越完全，衍生化效果也就越好。本研究選擇20、40、60、80、100和120 min對衍生化反應時間進行探討，從圖12可看出，當衍生化反應時間為100 min時，衍生化反應基本完成，故選擇的衍生化反應時間為100 min。

2.2.3 方法評估 ①方法的線性范圍、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。定量分析時所用的質譜掃描模式為SIM模式，圖7為標品的色譜圖，其中15.83，30.62，35.08 min所對應的色譜峰的物質分別為內標正十九烷，衍生后的α-西柏三烯二醇和衍生后的β-西柏三烯二醇。對色譜圖上的目標峰進行積分，以目標分析物峰面積與內標物峰面積比(A/AIS)與被測目標物濃度(C)作標準曲線，以S/N分別等于3和10時計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結果見表2。從表2可以看出，目標成分α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的線性關系良好，線性范圍分別為1.0～270.0和1～160 μg/mL，相關系數(R)分別為0.9991和0.9996(相關性好，可用于準確定量分析)。目標物的LOD和LOQ分別為0.25和0.2 μg/mL以及0.825和 0.66 μg/mL。②方法的準確性和精密度。由于煙草樣品基質的復雜性，為了驗證本精密度，分別對烤煙、香料煙、白肋煙樣品做了3個濃度的加標回收實驗，每組實驗重復測定3次。精密度測定每組實驗重復測定5次。結果如表3所示，2種目標分析物的回收率分別在95.10 %～99.80 % 和92.50 %～98.60 %之間。RSD(n=5)則分別為2.19 %～4.96 %和2.75 %～4.09 %。以上結果表明本方法準確性好，精密度高，滿足復雜煙草基質中西柏三烯醇類物質的準確定量檢測要求?？捎糜跓煵輼悠分形靼厝┒己康臏y定。

圖11 衍生化溫度Fig.11 Derivatization temperatures

圖12 衍生化時間Fig.12 Derivatization time

表2 方法的線性范圍和檢測限

表3 方法的回收率和精密度

表4 煙草樣品中西柏三烯二醇含量測試結果

2.2.4 樣品測定 采用本研究所建立的方法對煙草樣品中兩種西柏三烯二醇含量進行測定，從實際測量中煙草樣品的色譜圖(圖13)可以看出，其中 15.83，30.62，35.08 min所對應的色譜峰的物質分別為內標正十九烷，衍生后的α-西柏三烯二醇和衍生后的β-西柏三烯二醇。通過計算目標物峰面積與內標峰面積之比，代入標準曲線方程，算出各煙草樣品中α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇的含量，從表4中可見，不同產地煙葉中2種西柏三烯二醇的含量差異較大。

3 討 論

氣相色譜中應用化學衍生反應是為了增加樣品的揮發度或提高檢測靈敏度。進行化學衍生反應應該滿足如下要求：對反應條件要求不苛刻，且能迅速、定量地進行；對樣品中的某個組份只生成一種衍生物，反應副產物及過量的衍生試劑不干擾被測樣品的分離和檢測；化學衍生試劑方便易得，通用性好[18]。

圖13 煙草樣品西柏三烯醇色譜圖Fig.13 Chromatogram of Cembranoids in tobacco samples

針對目標物質，本研究所選擇的4種介質，二甲基甲酰胺和吡啶的衍生化效果要明顯好于二氯甲烷和四氫呋喃，但從四種溶劑的極性DMF6.4、吡啶5.3、THF4.2和二氯甲烷3.4可以看出，二甲基甲酰胺的極性大，由于本研究采用的毛細管柱為DB-5 MS柱為弱極性柱，從防止柱流失角度選擇吡啶為衍生化介質。

三甲基硅烷是GC分析最常用的通用硅烷化基團。引入此基團可改善色譜分離，并使得特殊檢測技術的應用成為可能。因此，通過試驗選用雙( 三甲硅基) 三氟乙酰胺( BSTFA )為衍生化試劑，引入硅烷化基團，可實現衍生化，提高目標物的檢測精度。

衍生化溫度是影響衍生化反應的一個重要因素。衍生化溫度過低，衍生化反應速率太慢，反應時間過長。衍生化溫度過高，可能會引起衍生化試劑或被衍生化物質的分解。本研究通過實驗，確定了最佳衍生化溫度。

本研究通過對衍生前后西柏三烯二醇色譜圖的對比，強調了用GC-MS檢測西柏三烯二醇時進行柱前衍生化反應的必要性。分別對衍生化試劑、衍生化溶劑、衍生化溫度、衍生化試劑與溶劑的比例、衍生化時間這幾個條件進行了優化，結果確定衍生化條件為：20 ℃下加入吡啶：BSTFA體積比為3∶2(v/v)，反應時間為100 min最佳。

4 結 論

本研究采用柱前衍生化的方法測定煙草及煙草制品中西柏三烯二醇，該方法所建立的標準曲線線性相關性好，檢出限遠低于樣品的最低濃度，方法的重復性和精密度均良好，且操作簡單，耗時少，可應用于煙草樣品的分析檢測。

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AnalysisofCembranoidsinTobaccobyGC-MS-SIMwithPre-columnDerivatization

LI Xiao-lan1，HUANG Shan-song1，JIA Hai-jiang1，YANG Jun2，QIAN Xiao-bo2，XU Xue-qin1*

(1.China Tobacco Guangxi Industrial Co.,Ltd, Guangxi Nanning 530001, China;2.Research Center of Tobacco and Health, University of Science and Technology of China,Anhui Hefei 230051, China)

【Objective】To provide a reference for the study of relationship between cembranoids in tobacco and the quality of tobacco, the determination method of analysis of cembranoids in tobacco had been studied.【Method】This study established a GC-MS-SIM method for the determination of two kinds of tobacco cembranoids by derivatization with a double (3-methyl silicon alkyl) 3-fluoroacetamide (BSTFA).The relationship between the quality of tobacco and the oil quality of tobacco was studied. The extraction solvent, its volume and extraction time as well as the derivatization conditions were investigated.【Result】The best extraction could be achieved with dichloromethane as solvent, through 10 mins ultrasonic treatment. The optimum derivatization conditions would be 100 minutes reaction with the mixed solution of pyridine and 3-fluoroacetamide (BSTFA) in the volume ratio 3∶2 under the temperature of 20 centigrade. Using the method, the content of cembranoids in different origin of tobacco was analyzed, the results showed that the content had significant difference in different tobacco aroma.【Conclusion】Cembranoids quantitative analysis were then carried out for samples from different areas with different oil content, and the relevance between the content of tobacco leaf oil and cembranoids were also studied, revealing an obvious positive correlation. The method is reproducible, the precision is good, and the operation is simple and time consuming；At the same time, the method was used to quantitatively detect the cembranoids in different tobacco leaves.

Cembranoids；Derivative process；GC-MS SIM；Tobacco

1001-4829(2017)12-2698-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.014

2017-06-07

廣西壯族自治區工信委科技攻關項目(201731616141 7)

李小蘭(1971-)，女，廣西桂平人，高級工程師，主要從事產品質量分析及研究工作，E-mail:173337153@qq.com；*為通訊作者：徐雪芹，E-mail:xueqin.hg@163.com。

S572

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(責任編輯溫國泉)