煙草黑脛病拮抗菌的篩選鑒定及其發酵工藝優化

張 濤，雷幫星，何 勁，文曉鵬

( 1．貴州大學 農業生物工程研究院/生命科學學院，貴州省生化工程中心，山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴陽學院，貴州 貴陽 550005)

煙草黑脛病拮抗菌的篩選鑒定及其發酵工藝優化

張 濤1，雷幫星1，何 勁2*，文曉鵬1

( 1．貴州大學 農業生物工程研究院/生命科學學院，貴州省生化工程中心，山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴陽學院，貴州 貴陽 550005)

【目的】為篩選出對煙草黑脛病具有拮抗作用的細菌菌株，為煙草黑脛病的生物防治及生物農藥的開發提供理論依據。【方法】采用平板對峙法篩選對煙草黑脛病有明顯抑制作用的細菌菌株，結合形態觀察、生理生化特征及分子生物學特征對該菌株進行鑒定，并利用菌餅法對該菌株的培養工藝進行優化。【結果】篩選出的菌株D1為革蘭氏陽性菌、短桿狀、產孢，且生理生化特征及16S rRNA基因序列與解淀粉芽孢桿菌具有極高的相似性(97 %)，因此確認菌株D1為解淀粉芽孢桿菌。篩選的最優培養基為PD液體培養基，最優碳源為蔗糖、氮源為蛋白胨、無機鹽為氯化鈣，最優配比為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %；最佳培養條件為pH 7～8、培養時間42 h和裝瓶量30 %。【結論】篩選得到的目的菌株通過發酵培養對煙草黑脛病有明顯的抑制作用，可作為生防菌開發利用。

煙草黑脛病；解淀粉芽孢桿菌；生物防治

【研究意義】煙草(Nicotianatabacum)是以收獲葉片為主的重要經濟作物，是世界上種植最廣泛的非食用的葉用經濟作物，同時，也是我國重要的經濟作物之一。煙草黑脛病(Phytophthoranicotianae)是煙草常見病害，屬藻物界(Chromista)、卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、腐霉目(Pythiales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)，是世界煙草栽培中毀滅性的土傳病害。煙草黑脛病發病率高、傳染快、不易控制，在苗期和大田期均可發生，受染煙草整株死亡[1]。【前人研究進展】據不完全統計，我國煙草黑脛病平均每年發病面積高達76 373 hm2，產量損失近3×107kg，產值損失超過1.23億元[2]。目前，對煙草黑脛病的防治措施以栽培管理、抗病品種及化學防治為主，常用的氨基甲酸酯類(Carbamtes)和羧酸酰胺類(Carboxylic acid amides)等是我國煙草黑脛病防治的主要藥劑[3]。【本研究切入點】隨著無公害農產品生產規模的逐步擴大，生物農藥的研究和開發越來越受到人們關注。利用微生物的拮抗作用開發新生物農藥已成為國內外研究的熱點[4]，對煙草產業有重要意義。劉暢等[5]通過實驗篩選得到1株哈茨木霉對煙草黑脛病有較好的拮抗效果，其抑菌率達84.34 %；馬冠華等[6]分離得到內生菌Itb57，對黑脛病溫室內防治效果為69.28 %，田間防治效果為61.25 %～72.49 %。【擬解決的關鍵問題】采用平板對峙法研究貴州省生化工程中心分離保存的具有抗菌作用的細菌菌株(D1、Hd13、He14、He41、Hd213、F2、H3)對煙草黑脛病的生物防治效果，以期為豐富煙草黑脛病生物防治的微生物資源及其生物農藥的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 拮抗菌株：D1、Hd13、He14、He41、Hd213、F2和H3等7株細菌菌株，由貴州省生化工程中心分離保存。病原菌株：煙草黑脛病菌(Phytophthoranicotianae)，購買于中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要培養基 PDA固體培養基、牛肉膏蛋白胨培養液、PD培養液、LB培養液、大米培養液和基礎培養液。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的菌株的篩選 采用平板對峙法，在PDA平板中央接種5 mm煙草黑脛病菌菌塊，同時在平板4個邊點接目的菌株，每個處理3次重復，28 ℃恒溫培養4～6 d后觀察抑菌效果。

1.2.2 目的菌株的鑒定 ①菌株生理生化試驗。根據文獻[7]中對細菌的鑒定特征，對其進行生理生化鑒定。②細菌DNA提取。采用熱裂解法提取細菌DNA。用接種環挑取1個單菌落接種到15 mL試管中(裝液量為30 %)。置28 ℃、150 r/min振蕩培養18 h后，取1.5 mL細菌培養液，置于1000 r/min室溫離心1 min，取沉淀，用1 mL無菌水洗2次，1000 r/min離心1 min，取沉淀，加100 μl TE(pH 8.0)重懸細胞，98 ℃水浴10 min，冰上放置5 min，2000 r/min離心1 min，取上清液，即為細菌DNA，于-20 ℃保存待用。③16S rRNA基因序列的擴增。采用細菌通用引物27 F和1492 R對樣品的16S rRNA基因序列進行PCR擴增，引物序列：27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系25 μl：27 F和1492 R各0.5 μl，模析DNA 1 μl，ddH2O 10.5 μl，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min，循環1次；94 ℃ 1 min，循環30次；55 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃ 1.5 min，循環30次；72 ℃ 10 min，循環1次；-20 ℃保存備用。④特異PCR法對菌株的鑒定。根據3種芽孢桿菌全基因組中β-甘露聚糖酶基因上下游設計3種特異性引物[8](表1)。特異PCR反應擴增體系：引物各0.5 μl，DNA 1 μl，2×Mix 5 μl，ddH2O 3 μl。特異PCR擴增反應條件：94 ℃ 5 min，循環1次；94 ℃ 30 s，循環35次；50 ℃ 30 s，循環35次；72 ℃ 1.5 min，循環35次；72 ℃ 1.5 min，循環35次；72 ℃ 10 min，循環1次；-20 ℃保存備用。

1.2.3 培養基的優化 ①單因素試驗。培養基種類：選取1.1.2中5種不同培養液，28 ℃，120 r/min振蕩培養培養7 d，采用菌餅法做抑菌活性試驗，分析不同菌株培養液對抗煙草黑脛病菌抗菌活性的影響。碳源：分別以20 %的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、D-木糖、D-果糖和甘油替代基礎培養基中的碳源，28 ℃、120 r/min搖瓶培養7 d，比較不同碳源目的菌株抗煙草黑脛病菌活性的效果。氮源：在最佳碳源基礎上，分別以10 %的NH4NO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、脲素、CH3COO NH4、NaNO3和NH4Cl替代基礎培養基中的氮源，28 ℃、120 r/min搖瓶培養7 d，比較不同氮源目的菌株抗煙草黑脛病菌活性的效果。無機鹽：在最佳碳源和氮源基礎上，選擇MgSO4、檸檬酸鈉、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4和CaCl2無機鹽離子，28 ℃、120 r/min搖瓶培養7 d，考察無機鹽對目的菌株抗煙草黑脛病菌活性影響的因素及最佳的水平組合。②正交實驗。根據單因素試驗結果進行3因素3水平試驗，具體因素及水平見表1。

1.2.4 發酵培養條件篩選 ①培養基初始pH。用濃度分別為10 % NaOH和10 % HCl的溶液將培養基初始pH調為3、4、5、6、7、8和9，以自然pH為對照，121 ℃滅菌30 mim。冷卻后接種目的菌株，120 r/min搖瓶培養7 d，每個處理3次重復，計算抑菌率，篩選最優初始pH。②培養時間。分別取培養6、12、18、24、30、36、42、48和54 h的發酵液進行抑菌實驗，每個處理3次重復，篩選最適培養時間。③培養溫度。分別設置溫度20、28、32和40 ℃，恒溫培養7 d，考察菌株發酵液對煙草黑脛病菌活性的影響，每個處理3次重復，測量菌塊直徑，篩選最適培養溫度。④裝瓶量。用300 mL培養瓶分別以裝瓶量為6 %、12 %、18 %、24 %、30 %、36 %和42 %接種目的菌株，120 r/min搖瓶培養7 d，每個處理3次重復，得到目的菌株搖床培養最優裝瓶量。

表1 芽孢桿菌全基因組中β-甘露聚糖酶基因引物信息

表2 培養基正交試驗因素及水平

1.3 統計分析

PCR擴增產物由北京賽諾基因有限公司完成測序，將所獲得基因序列在NCBI網址上進行Blastn比對，利用Mega 5軟件進行DNA序列排序，再用PAUP 4.0軟件分析，以最大簡約法(Maximum parsimony，MP)構建分子系統發育樹。用Microsoft Excel 2007對所得原始試驗數據進行整理，用SPSS 19.0進行數據處理，采用Duncan新復極差法進行單因素試驗統計分析。

2 結果與分析

2.1 目的菌株的篩選

從圖1看出，D1、Hd13、He14、He41、Hd213和H3等6株細菌菌株對煙草黑脛病菌均有一定的抑制作用，菌株F2對煙草黑脛病無抑制作用。抑制效果依次為D1>Hd213>Hd13>He14>He41>H3>F2，其中，以菌株D1的抑菌效果最為明顯，形成的菌落能有效抑制煙草黑脛病菌餅的生長和菌絲形成。

a為Hd213，b為D1，c為Hd13，d為H3，e為He14，f為He41，g為F2，h為對照a.Hd213; b.D1; c.Hd13; d.H3; e.He14; f.He41; g.F2; h.CK圖1 不同細菌菌株對煙草黑脛病的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different bacterial strains against P.nicotianae

a和b為菌落，c為革蘭氏染色，d為芽孢染色a and b.Colony; c.Gram staining; d.Spore staining圖2 菌株D1的菌落及顯微結構Fig.2 The colony and microstructure of strain D1

2.2 目的菌株D1的鑒定

2.2.1 形態特征 LB平板上，菌落呈圓形，為乳白色，有透明膠狀分泌物，中央凸起；28 ℃恒溫培養72 h后表面略粗糙，邊緣凸起；培養后期邊緣產生不明顯羽狀分枝。革蘭氏染色后于10×100光學顯微鏡下觀察，目的菌株呈桿狀，紫色；有芽孢，經芽孢染色可見，芽孢呈綠色橢圓形，菌體呈紅色，初步鑒定為革蘭氏陽性菌(圖2)。

2.2.2 菌株D1生理生化及分子生物學特性 經生理生化試驗，菌株D1的過氧化氫酶、水解淀粉、乙酰甲基甲醇、硝酸鹽還原、D-葡萄糖和甘露醇等試驗結果均表現陽性，結合《常見細菌系統鑒定手冊》[7]，其生理生化特性與芽孢桿菌相符。

以菌株D1所提DNA為模板，用通用細菌引物(27F和1492R)進行PCR擴增，其目的條帶大小約1300 bp(圖3 A)，利用枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的特異引物進行特異PCR擴增，只有使用解淀粉芽孢桿菌特異引物能看條帶，且擴增片段與通用引物PCR結果相對應(圖3B)，在1300 bp左右。將PCR產物進行測序，將其序列提交GenBank得到登錄號為GenBank KU761585。經NCBI比對及構建發育樹，菌株D1與解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensHQ840645)具有97 %的相似性(圖3C)，結合生理生化試驗結果確認菌株D1為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.2.3 菌株發酵工藝優化 從圖4看出，PD培養液為最優培養基，其抑菌率達62.27 %；牛肉膏蛋白胨培養液其次，抑菌率為56.25 %。以PD培養液為基礎培養基，6種碳源培養液均能對煙草黑脛病菌產生抑制作用，其中蔗糖為最優碳源，其抑菌率達66.53 %。以蔗糖為最優碳源條件下，以蛋白胨為氮源的抑制效果最好，其抑菌率達69.36 %。不同無機鹽的培養基對煙草黑脛病均有明顯的抑制作用，其中以CaCl2的效果最好，其抑菌率達68.46 %。

從表3看出，3個因素對菌株D1抗煙草黑脛病菌的抑菌率活性影響為蔗糖>CaCl2>蛋白胨，其中蔗糖濃度對抗性顯著性(F=24.3>F0.05=19)影響。結合各影響因素得菌株D1抗煙草黑脛病的活性最優培養基配方為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %。

2.2.4 培養條件的優化 從圖5看出，初始pH、培養時間、培養溫度和裝瓶量均對菌株D1發酵濾液抗煙草黑脛病菌活性有影響。

A為PCR 電泳圖，B為特異PCR電泳圖，C為16S rDNA序列構建的系統發育樹，M為DNAmarkerA.PCR electrophoretogram; B.Specific PCR electrophoretogram; C.Phylogenetic tree for 16S rDNA sequence; M.DNA marker圖3 菌株D1的分子生物學鑒定結果Fig.3 Molecular biological identification of D1 strain

圖4 不同影響因子對發酵菌株D1的抑菌率Fig.4 Effect of different influencing factors on inhibition ratio of D1 strain against P.nicotianae

(1)初始pH。 pH 3～6(酸性條件)時抑制效果較差，7～9(中性或弱堿條件)時抑制效果較好，其中以pH 7.6(自然)對煙草黑脛病的抑制作用最好，因此以pH 7～8為解淀粉芽孢桿菌D1的初始pH。

(2)培養時間。隨著發酵時間延長培養液對煙草黑脛病的抑菌率呈先上升后下降趨勢，到42、48 h具有顯著的抑菌作用，54 h后抑菌活性下降。原因是發酵時間短，其生長周期不夠，處于遲緩期，產生的活性物質較少，抑制效果較低；發酵時間長，由于底物濃度降低或細菌生長到衰亡期，所產活性物質減少，因此選取42 h作為最佳培養時間。

(3)培養溫度。當溫度為28 ℃時抑制效果最好，抑菌率達72.66 %；40 ℃時抑菌活性明顯降低。表明，溫度偏高不利于菌株生長，也不利于其抑菌活性物質的產生，因此選擇28 ℃為菌株D1的最佳發酵溫度。

(4)裝瓶量。不同裝量對菌株D1發酵濾液抗煙草黑脛病菌活性的影響不顯著，其中以300 mL培養瓶裝瓶30 %的效果最好。

3 討 論

煙草黑脛病的病原菌為煙草疫霉菌，最早由VAN Breda de Haan 于1896年在印度尼西亞發現，20世紀20年代開始在美國發現，并迅速流行。我國煙草黑脛病分布范圍廣，福建發病率最高，此外，廣西、湖南、四川、貴州、云南等煙草產區發生較為普遍[9]。煙草黑脛病菌菌絲最適生長溫度為28～32 ℃，4 ℃時可存活2個月，其孢子可在不良環境中存活3年以上，在煙株殘余組織上腐生時間在2年以上[10]。

本研究篩選得到對煙草黑脛病有拮抗作用的菌株D1為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌，其抗逆性強，快速繁殖，在短時間內可在有限的空間和營養競爭中占據優勢，有效抑制病原菌的侵染；解淀粉芽孢桿菌主要通過分泌聚酮類、多肽類、脂肽類及抗菌蛋白等多種抗菌物質，對病原菌起抑制作用[11]。胡忠亮等[12]概述了解淀粉芽孢桿菌在農業生產和環境保護上的應用，并指出解淀粉芽孢桿菌具有分布廣泛、對人畜無害和不污染環境等優點而成為生防菌的重要研究對象。

表3 菌株D1培養基的正交試驗結果

圖5 不同條件下菌株D1發酵濾液對煙草黑脛病菌的影響Fig.5 Inhibition effect of strain D1 fermented filtrated liquor on P.nicotianae under different culture conditions

菌株D1的最優培養基為PD液體培養基，最優碳源為蔗糖、氮源為蛋白胨、無機鹽為CaCl2，最優配比為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和10 % CaCl2，最優發酵條件為初始pH 7～8、培養時間42 h、溫度28 ℃和裝瓶量30 %。與洪鵬等[13]對解淀粉芽孢桿菌HF-01發酵條件的優化結果存在差異，可能是菌株來源不同所致。

在生物防治中解淀粉芽孢桿菌已成為研究熱點的生防菌株，通過對菌株發酵工藝的優化，使其處于最佳代謝期，產生較多抗菌活性物質。本研究只是在搖床條件下對菌株D1 發酵培養基的類型、成分及其培養條件進行了優化，今后還需進行小試、中試，以驗證和完善發酵工藝，獲得適合發酵罐的發酵工藝，在實際工業化生產中對發酵條件的控制方法還有待進一步深入研究。

4 結 論

本研究篩選到對煙草黑脛病有拮抗作用的菌株D1，其形態觀察、生理生化特征與解淀粉芽孢桿菌相似，分子生物學鑒定結果顯示菌株D1與解淀粉芽孢桿菌菌株B.amyloliquefaciensHQ840645具有97 %的序列同源性，并經分子生物學鑒定，確定拮抗細菌菌株D1為解淀粉芽孢桿菌。菌株D1發酵的最優培養基為PD液體培養基，最優碳源為蔗糖、氮源為蛋白胨、無機鹽為CaCl2，最優配比為蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %，最優發酵條件為初始pH 7～8、培養時間42 h、溫度28 ℃和裝瓶量30 %(100 mL/300 mL)。

[1]王 巖.煙草黑脛病菌、青枯病菌拮抗放線菌的篩選及控病研究[D].重慶：西南大學，2009.

[2]孔凡玉，朱賢朝，石金開，等.我國煙草侵染性病害發生趨勢原因及防治對策[J].中國煙草，1995(1):31-34.

[3]汪漢成，李文紅，馮勇剛，等.煙草黑脛病化學防治的歷史與現狀[J].中國煙草學報，2011(5):96-102.

[4]李 勇，楊慧敏，李銘剛，等.微生物農藥的研究和應用進展[J].貴州農業科學，2003，31(2):62-63.

[5]劉 暢，許家來，郭 凱，等.煙草黑脛病生防菌的篩選鑒定及發酵條件優化[J].江蘇農業科學，2016，44(5):167-170．

[6]馬冠華，周常勇，肖崇剛，等.煙草內生菌Itb57的鑒定及其對煙草黑脛病的防治效果[J].植物保護學報，2010，37(2):148-152.

[7]東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[8]劉 勇，李 輝，李金霞，等.特異PCR方法對枯草芽孢桿菌群的鑒定區分[J].飼料工業，2010(4):52-54.

[9]陳瑞泰，朱賢朝，王智發，等.全國16 個主產煙省(區)煙草侵染性病害調研報告[J].中國煙草科學，1997(4):1-7.

[10]王晶晶.兩株生防菌對煙草黑脛病的抑制活性及其特性研究[D].鄭州：河南農業大學，2011.

[11]陳中義，張 杰，黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機制與遺傳改良研究[J].植物病理學報，2003，33(2):97-103.

[12]胡忠亮，鄭催云，田興一，等.解淀粉芽孢桿菌在環境保護和農業生產中的應用[J].農藥，2016，55(4):241-245.

[13]洪 鵬，安國棟，胡美英，等.解淀粉芽孢桿菌防治果蔬采后病害研究進展[J].中國農學通報，2013，29(12):168-173.

ScreeningandIdentificationofAntagonisticStrainsagainstPhytophthoranicotianaeandItsFermentationProcessOptimization

ZHANG Tao1，LEI Bang-xing1，HE Jin2*，WEN Xiao-peng1

(1.Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education)，Guizhou Center for Biochemical Engineering，Institute of Agro-bioengineering/College of Life Sciences，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China; 2.Guiyang University，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】 The study aimed to screen bacterial strains with an antagonism againstPhytophthoranicotianaeand to provide the theoretical basis for biological control and bio-pesticide development ofPhytophthoranicotianae.【Method】The bacterial strains with an obvious inhibition effect againstPhytophthoranicotianaewere screened by the plate confrontation culture method. The screened strain was identified by morphological observation, physiological and biochemical property, and biological characteristics. The culture process of the screened strain was optimized.【Result】The screened D1 strain was a Gram-positive bacterium with a short bacilliform and spore-production. The similarity in physiological and biochemical property and 16S rRNA gene sequence between D1 stain andBacillusamyloliquefacienswas up to 97 %, which indicated that D1 strain wasBacillusamyloliquefaciens. The optimum medium for strain screening was PD + 20 g/L sucrose + 10 g/L peptone + 10 g/L CaCl2.The optimum culture conditions include pH 7-8, 42 hours and 30 % medium volume (100mL/300mL).【Conclusion】D1 strain with an obvious inhibition effect againstPhytophthoranicotianaecan be used for development and utilization of biological control bacteria.

Phytophthoranicotianae;Bacillusamyloliquefaciens; Biological control

1001-4829(2017)12-2717-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.017

2017-08-01

中國煙草公司貴州分公司技術開發項目“煙草白粉病生物防治及其田間關鍵配套技術”[(2014)2]

張 濤(1990-)，女，貴州遵義人，碩士，主要研究方向：發酵工程，E-mail:420636545@qq.com，Tel：18798009305，*為通訊作者：何 勁，E-mail:jhe633@163.com

S435.72

A

(責任編輯馮 衛)