不同濃度納米氧化鐵對西瓜幼苗生長的影響

王運強，甘秋良，戴照義，陳 港，郭雅新，李俊麗*

(1.湖北省農業科學院經濟作物研究所，湖北 武漢 430064；2.武漢理工大學化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070)

不同濃度納米氧化鐵對西瓜幼苗生長的影響

王運強1，甘秋良2，戴照義1，陳 港2，郭雅新2，李俊麗2*

(1.湖北省農業科學院經濟作物研究所，湖北 武漢 430064；2.武漢理工大學化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070)

【目的】研究不同濃度納米氧化鐵對西瓜幼苗生長的影響。【方法】采用不同濃度納米氧化鐵對西瓜幼苗進行處理后，對植株根系生物量、抗氧化酶活性等進行測定。對比不同粒徑納米氧化鐵對西瓜葉片影響的研究，比較納米處理對植株地上地下部分影響的差異?！窘Y果】不同濃度的納米氧化鐵對西瓜根系生長有影響，低濃度時對植株生長起促進作用，高濃度時促進作用減弱或起抑制效果，呈現出一定的植物毒性。【結論】低濃度的納米氧化鐵有利于植物的生長，在弄清劑量、毒性及尺寸效應的基礎上，有望將納米氧化鐵作為納米肥料或植物生長調節劑用于農業生產上。

不同濃度；納米氧化鐵；根系生長；西瓜

【研究意義】鐵作為植物必需的營養元素，與光合作用密切相關，它不僅影響光合作用中的氧化還原系統，還參與葉綠素合成，影響葉片對光能的捕獲。缺鐵會導致葉綠體的結構受損，葉綠素無法生成，從而使植物新生的葉片會出現缺鐵黃化現象[1]。對植物而言，鐵的存在形式是實現其功能有效的關鍵。目前傳統方法使用的鐵強化劑對植物進行補鐵時，難以轉化為能有效利用的鐵，不能很好地發揮出改善植物黃化的功效，所以目前對植物正確施鐵的方法還有待研究?！厩叭搜芯窟M展】納米顆粒是一種空間結構上至少有一維介于1～100 nm的顆粒狀材料。由于其結構上的特殊性，納米粒子在多方面具備常規物質沒有的理化特性，例如團聚效應，表面效應等，使其在各個領域都有較好的功效和廣泛的應用前景。故而，對于納米顆粒本身及其在人類生活應用的研究已在全世界掀起了大波瀾[2]。γ-Fe2O3,針狀或紡錘狀,具亞鐵磁性，結構為陽離子缺位的尖晶石型[3]。有研究把納米氧化鐵與有機肥、腐殖酸配合施用，探究其對花生生長發育和吸收鐵肥的影響，結果表明,納米氧化鐵能夠顯著地促進花生的生長發育和光合作用[1]。近些年來,隨著納米科技的廣泛應用，關于納米顆粒對植物生長的影響,以及其在植物體的吸收遷移、生物可利用性以及生物富集的研究已經開始出現[4]。納米顆粒的尺寸大小和濃度都是造成這些生理影響差異的因素，特定的尺寸和濃度產生的作用效果更明顯[5]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究開展了對缺鐵處理的西瓜幼苗施用不同濃度納米 γ-Fe2O3的實驗。【擬解決的關鍵問題】結合本實驗室之前關于不同粒徑納米 γ-Fe2O3對西瓜葉片生理影響的研究[6]，通過觀察測量相關生長生理指標，探究不同濃度的納米 γ-Fe2O3處理對西瓜幼苗生長發育的影響，為進一步闡明納米 γ-Fe2O3在植物體內吸收、轉運機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

納米磁性氧化鐵(γ-Fe2O3)，顆粒粒徑20 nm，球形，純度為99.5 %，購自麥克林公司。納米氧化鐵懸液配制：將納米 γ-Fe2O3用超聲震蕩的方式分散到去離子水中形成均一穩定的懸浮液。

在超凈工作臺中將浸泡了3 h的去殼西瓜種子用75 %的乙醇洗滌30 s，再用8 %的次氯酸鈉浸洗10 min，用無菌水沖洗3次。將消毒處理好的種子包裹在已滅菌的濾紙中，并用無菌水潤濕濾紙，放在培養皿中置于32 ℃恒溫培養箱中培養，2 d后大部分種子露白，將萌發的種子播入潮濕的珍珠巖中，置于人工氣候箱中培養。

1.2 實驗方法

幼苗長到2葉1心時，選取長勢近似的植株移植于7組水培盆中，每盆18株，用去離子水適應培養1周后，開始改澆缺鐵的Hoagland營養液，1周后進行納米氧化鐵處理。將上述納米 γ-Fe2O3懸液與營養液混勻，使得最終營養液中納米 γ-Fe2O3濃度為0、20、50、100、200 mg/L，對7組幼苗分別澆灌含不同濃度 γ-Fe2O3的營養液，以在50 mg/L的納米 γ-Fe2O3具有相同鐵元素含量的Fe2+和Fe3+溶液作為對照，在相同的條件下置于人工氣候箱中培養。環境條件設計為：每天在28 ℃下光照培養16 h，18 ℃下黑暗培養8 h，連續培養14 d。期間，每天需將營養液超聲分散，以免納米粒子發生聚沉。

1.3 實驗測定

1.3.1 根生物量測量 在每個培養盆中隨機選取6株幼苗，于根莖相接處剪去地上部分，用去離子水沖洗根部，并用吸水紙吸干后分別測量根長及根重[7]。

1.3.2 根系活力的測定 采用TTC法測定根系活力[4]：取上述已稱重的根放入15 mL離心管中再加入0.4 % TTC和PBS(pH 6.0)各5 mL，使根完全浸沒在溶液中，于37 ℃下保溫2 h，此后加入2 mL(1 mol/L)硫酸以終止顯色反應。向已顯色的根加10 mL甲醇，于40 ℃下保溫7 h。取其溶液于485 nm測定吸光度值。

1.3.3 脂質過氧化作用的測定 丙二醛(MDA)是膜脂質過氧化作用的最終分解產物，是常用的膜脂過氧化指標。取0.1 g剪碎的根，加入少量PBS(pH 6.0)快速研磨至勻漿，4000 r/min離心10 min后將上清全部轉移并定容至10 mL得到提取酶液。吸取1 mL粗提液加入2 mL TBA(0.6 %)沸水浴反應15 min，冷卻后分別測定532、600和450 nm下的吸光度值。

1.3.4 抗氧化酶系統活力測定 取1.3.3粗提液進行抗氧化酶系統的活力測定[8]。SOD采用氮藍四唑法測定；POD采用愈創木酚法測定；CAT采用比色法測定。

1.4 統計分析

所有實驗設計3次重復。所得數據用IBM SPSS Statistics 21進行單樣本t-檢驗和方差分析，用Origin 75進行圖片制作。

2 結果與分析

2.1 納米 γ-Fe2O3對根系生長發育的影響

根系長度和根重是反映植物根系生長發育狀況的一個指標。Fe2+處理組是適宜西瓜幼苗生長的處理組，在此處理下根長和鮮重指標最高。以缺鐵處理組作為對照組，從圖1可以看出，在不同濃度納米 γ-Fe2O3處理下西瓜根系長度和鮮重均有明顯變化：低濃度的納米 γ-Fe2O3對西瓜根系伸長和生物量積累有一定促進作用，高濃度的納米 γ-Fe2O3處理對生物量積累的促進作用有所下降。當濃度達較適宜濃度50 mg/L時，促進作用較為顯著，優于其他濃度下的處理組，而且該濃度下納米 γ-Fe2O3對西瓜根伸長和生物量積累的促進作用和Fe2+組的效果接近，這表明納米 γ-Fe2O3在該濃度下有和Fe2+相近的補鐵作用。此外，與Fe3+處理組實驗結果呈現的毒害現象相比較，納米 γ-Fe2O3對西瓜幼苗根系產生作用的方式并非通過釋放Fe3+，而是通過其他的方式對植物生理產生影響。在0～200 mg/L納米 γ-Fe2O3暴露下，沒有發現納米 γ-Fe2O3對根系伸長有明顯抑制作用，但從根重在高濃度時受抑制這一現象可以推測納米 γ-Fe2O3對西瓜種子根系細胞生長發育的影響可能作用于細胞壁結構上，主要作用是促使細胞縱向伸長，而非增加細胞質量。

圖1 不同處理下西瓜幼苗根系長度和鮮重變化Fig.1 Variability of root length and weight of the watermelon under different treatments

2.2 納米 γ-Fe2O3對根系活力的影響

根作為植物吸收營養的主要器官，根系活力代表的是植物整體的生長情況、吸收營養的能力大小。通過對比納米 γ-Fe2O3處理對西瓜葉片產生影響的實驗[6]，發現納米 γ-Fe2O3的粒徑不同，濃度不同都是造成納米顆粒對根系生長影響結果不同的關鍵因素[9]，可借此來研究納米顆粒與西瓜根系細胞的相互作用方式。如圖2所示,低濃度的納米 γ-Fe2O3對植物根系活力有促進作用，可能是因為植物為維持自身生長需求需從外界吸取足夠的鐵元素，在游離鐵含量不高的情況下，植物通過提高根系活力以加大對營養液中納米 γ-Fe2O3的吸收，與此相伴的營養元素的跨膜運輸等耗能過程也是促進根系活力提高的動力；高濃度納米 γ-Fe2O3處理對植物根系活性表現出一定的抑制作用，該現象可解釋為高濃度的納米顆粒發生團聚堵塞了西瓜根系毛孔，影響根毛細胞對水分和營養的吸收，使得根系活力呈現下降趨勢。該趨勢與我們之前的研究用9和18 nm的納米 γ-Fe2O3對葉片處理取得的結果相符[6]，相對于對照組，20 mg/L的納米 γ-Fe2O3處理有促進根系活力的積極作用，而50 mg/L的納米處理組的根系活力明顯下降。另外，在粒徑上對比，納米顆粒粒徑20，18，9 nm處理下對西瓜根系活力產生抑制的濃度稍有不同，粒徑越小產生抑制效果所需濃度越低，說明小粒徑的納米顆粒因更易發生團聚堵塞根毛，在低濃度時便會對根系活力產生抑制作用[6]。在適宜西瓜幼苗生長的Fe2+處理組中，西瓜根系細胞并沒有表現出較高的根系活力，這很可能與溶液中游離鐵的含量較高有關，西瓜根系細胞吸收這些鐵并不需要很高的能量，相應的根系活力也就較弱。葉綠素是植物光合作用必不可少的物質，它的含量直接反應植物的生長活力，從西瓜葉片實驗[6]中發現低濃度下隨著納米 γ-Fe2O3的施加，葉綠素含量有輕微上升的趨勢，這從另一角度說明納米 γ-Fe2O3有可能為植物缺鐵黃化防治提供新的途徑，為高效納米復合肥料的推廣與運用奠定基礎。

2.3 納米 γ-Fe2O3對根系抗氧化系統的影響

為了更好地生長發育，植物會形成多種抵抗外界脅迫的防御機制，抗氧化系統就是植物抵抗活性氧自由基對自身傷害的機制之一[10]。超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化物酶(POD)，過氧化氫酶(CAT)都是抗氧化保護酶，這些抗氧化酶的活性變化有利于維持體內活性氧的動態平衡。通常情況下，當外界脅迫刺激導致平衡破壞時，酶活性的變化直接反映了西瓜根系細胞受脅迫的程度。從圖3(A)的結果與之前關于不同粒徑納米 γ-Fe2O3對西瓜幼苗葉片抗氧化系統的影響相比較發現[6]，不同粒徑的納米 γ-Fe2O3處理西瓜幼苗根和葉片中SOD活性變化均呈平緩趨勢，并且總體水平高于Fe2+處理組。說明，納米 γ-Fe2O3通過刺激ROS積累誘導氧化應激提高抗氧化酶活性。從圖3(B)中可看出，粒徑20 nm納米 γ-Fe2O3處理下的西瓜幼苗根細胞中POD活性變化不顯著，與葉片實驗[6]中粒徑18 nm納米 γ-Fe2O3處理下西瓜葉片細胞中POD活性相比較發現，根細胞中POD酶活性整體高于葉片中的酶活性，這可能與納米 γ-Fe2O3在西瓜幼苗中的轉運量有關，根最先接觸納米 γ-Fe2O3產生較強的氧化應激，隨后納米 γ-Fe2O3部分轉運到上部組織，因而產生的影響不及根部細胞的強烈。此外，葉片實驗[6]中粒徑9 nm的納米 γ-Fe2O3處理下POD酶活性稍高于18 nm納米 γ-Fe2O3處理中的，這說明小粒徑的納米 γ-Fe2O3更有機會被吸收運輸到植物上部組織中。已知CAT酶和POD酶主要作用是清除細胞內過多的H2O2，減少H2O2對膜脂質的過氧化作用，穩定膜的結構。從圖3(C)中可看出，施加了納米 γ-Fe2O3后根中CAT酶活性均比對照組有所提高。隨納米顆粒濃度的增加，CAT酶活性變化不大。這與葉片中CAT酶活性變化趨勢一致。對比根和葉片中CAT酶活性值發現，葉片中CAT酶活性整體高于根細胞酶活，說明葉片在清除脂質過氧化物的能力上更優于根細胞，究其原因，可能是根細胞最先接觸較高濃度的納米 γ-Fe2O3發生較強氧化應激反應，從而刺激了細胞自身的保護機制，抑制了酶活力，而納米 γ-Fe2O3經吸收轉運再到葉片時，較每個濃度下根細胞所接觸的濃度低，葉片中酶活力較高處于活躍狀態為機體清除自由基，從而造成葉和根中酶活性的區別。這側面說明納米 γ-Fe2O3在植株中有一定的運輸。

圖2 不同處理下西瓜根系活力變化Fig.2 Variability of root activity of the watermelon under different treatments

A：超氧化物歧化酶活性(SOD) ;B：過氧化物酶活性(POD) ;C：過氧化氫酶活性(CAT);D：過氧化氫酶抗氧化機理方程式圖3 不同處理下西瓜幼苗根系抗氧化酶活力變化Fig.3 Variability of antioxidant enzyme activity of the watermelon under different treatments

2.4 納米 γ-Fe2O3對根系丙二醛(MDA)含量的影響

當細胞內產生過量的活性氧時，會引發膜脂過氧化，丙二醛是膜脂過氧化的主要產物之一，其含量可以表示膜脂過氧化的程度[11]。MDA含量越高，說明細胞膜系統受損越嚴重。和葉片實驗中MDA含量水平對比，從圖4中可看出，根細胞中MDA水平整體高于葉片中MDA水平。這說明根細胞膜脂過氧化程度較葉片中的高，根作為直接和最先接觸納米顆粒的器官，其細胞膜受損的程度大于納米顆粒經轉運后對葉片造成損傷的程度，這和上文抗氧化系統中酶活性在根細胞和葉細胞中的差異一致。較低的MDA含量對于保護細胞膜的結構和功能很有必要，正常鐵供給的Fe2+處理組的MDA水平不低，分析原因極有可能是缺鐵脅迫處理的逆境下已對植物細胞膜產生影響，補鐵有一定的恢復效果但不能完全抵消缺鐵造成的損傷。在缺鐵處理組中，由于缺鐵導致植物內囊體膜受到一定的損傷，植物體內的MDA的含量較高，在不同濃度納米 γ-Fe2O3處理下MDA含量稍有下降但變化不顯著，說明納米 γ-Fe2O3的補鐵效果和其產生的氧化損傷程度之間有一定的競爭關系。在葉片[6]中9 nm粒徑的納米 γ-Fe2O3在50 mg/L時使MDA呈現反常的下降趨勢可能歸結于納米顆粒小粒徑的團聚效果，使其不易穿過細胞壁和細胞膜，避免對細胞造成強烈的氧化損傷，這啟發可以繼續設計不同粒徑和濃度梯度納米顆粒處理，并找到最佳補鐵效應和最低氧化損傷的處理方案。

圖4 不同濃度納米γ-Fe2O3處理下西瓜幼苗根系MDA含量變化Fig.4 Variability of MDA content of the watermelon under different treatments

3 討 論

整個實驗通過對缺鐵處理的西瓜幼苗施用不同濃度納米 γ-Fe2O3進行處理的方法，結合實驗室關于不同粒徑納米氧化鐵對西瓜葉片生理影響的研究[6]，分析納米 γ-Fe2O3對西瓜根系生長的影響。實驗結果表明，不同濃度納米 γ-Fe2O3對西瓜根系的長度、鮮重有一定的影響，濃度從低到高的納米 γ-Fe2O3對西瓜根系伸長和生物量積累的促進作用呈現下降趨勢，其中出現的根伸長但根重增加不明顯的現象，對納米 γ-Fe2O3的作用機制有參考意義，納米顆粒是否只是與根細胞壁相互作用，破壞其某些結構刺激細胞伸長，具體機制需制定新的方案進一步進行探究。此外，納米顆粒的團聚效應堵塞根毛，一方面體現在高濃度納米處理時對植物根系活性表現出一定的抑制作用，另一方面體現在納米顆粒粒徑越小產生抑制效果所需濃度越低[6]。相比較而言，低濃度的納米 γ-Fe2O3對植物根系活力的促進作用在一定程度上優于其他處理組。與之前的研究關于納米鐵對西瓜葉片影響的實驗[6]聯系起來，不同濃度不同粒徑的納米 γ-Fe2O3對植物不同組織部位產生的影響既有相同點又有不同之處[9]，一定程度上說明納米 γ-Fe2O3對植物作用的機制有可能是通過外部生理壓力，也可能是吸收轉運，這需進一步進行實驗驗證。西瓜植株在受到納米氧化鐵脅迫時，會啟動相應的防御機制來對抗氧化脅迫，使機體的生理狀態正常進行，減少機體受損害的可能性，這表明西瓜對納米 γ-Fe2O3有一定的生物適應能力。而高濃度下的納米 γ-Fe2O3都沒有出現與Fe3+相似的強毒害作用，可以說明納米γ-Fe2O3對植物生理產生的影響并非是通過釋放Fe3+來起作用，而且一定程度上納米 γ-Fe2O3有和Fe2+相同的改善缺鐵癥狀的效果，某些指標上甚至更優，也說明納米 γ-Fe2O3運用于西瓜缺鐵改善方面有一定的研究可能性。進一步研究納米 γ-Fe2O3在西瓜幼苗根系附近和根細胞內的賦存狀態，及體內生物物質表達含量的差異性，并加深到相關調控機制的分子層面可能會有新突破。同時考慮到納米顆粒對環境問題和人類健康問題的未知風險，在實際應用之前需仔細開展納米顆粒安全性的研究。

4 結 論

綜上所述，不同濃度的納米氧化鐵對西瓜根系生長有影響,較低濃度的納米氧化鐵能被植物根吸收并轉運到植物上部，并有效的促進植物的生長發育，而隨著納米氧化鐵濃度的增高，其積極作用逐漸減弱。此外在相同濃度下，較小尺寸的納米氧化鐵表現出更大的植物毒性。這些結果評估了合適的劑量和尺寸的納米氧化鐵在植物缺鐵黃化病上的修復效果，為探究納米材料的植物分子毒性機制提供了重要的依據，也為其作為新型的納米肥料或植物生長調節劑在農業上的應用提供了參考，一定程度上促進了納米肥料在農業和園藝領域的發展。

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EffectofDifferentConcentrationsofIronOxideNanoparticlesonGrowthofWatermelon

WANG Yun-qiang1,GAN Qiu-liang2, DAI Zhao-yi1,CHEN Gang2,GUO Ya-xin2,LI Jun-li2*

(1.Institute of Economic Crops, Hubei Academy of Agricultural Science, Hubei Wuhan 430064，China；2.School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, Wuhan University of Technology,Hubei Wuhan 430070，China)

【Objective】The research was designed to evaluate the influence of γ-Fe2O3NPs with different concentration on the growth of watermelon seedlings. 【Method】Root biomass and antioxidant enzyme activity were measured in plants exposed to different concentrations of γ-Fe2O3NPs. By comparing the results with the impact on leaves of watermelon of γ-Fe2O3NPs with different particle size, different impact on aerial and underground part of watermelon seedlings was also discussed. 【Result】Effects of γ-Fe2O3NPs were related with concentration. The effects of γ-Fe2O3NPs at lower concentration was positive on plant growth, while at high concentration the effects were weakened or inhibited, which presented phytotoxicity. 【Conclusion】 Low concentration of γ-Fe2O3NPs has positive effects on plant growth. Based on further understanding of dose, toxicity and size effects, γ-Fe2O3NPs are expected to be used as a nano-fertilizer or plant growth regulator in agricultural production.

Different concentrations; γ-Fe2O3NPs; Root growth; Watermelon

1001-4829(2017)12-2782-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.028

2017-02-18

國家現代農業產業技術體系專項資金資助項目(CAR S-26-34)；湖北省技術創新專項(2016AHB028)；中央高校基本科研業務費專項資金資助(WUT: 2017IB006)；國家大學生創新創業訓練計劃(20161049720006)

王運強(1977-),男，湖北武漢人,碩士,從事西甜瓜育種與栽培,E-mail:wangyunqiang0909@sina.com,Tel:13387601706，*為通訊作者：李俊麗(1980-),女，湖北武漢人，博士，主要研究方向，納米生物效應，E-mail:lijunli0424@sina.com，Tel：18971243840。

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(責任編輯李 潔)