瑞士乳桿菌調控小鼠腸道菌群變化規律的研究

臧凱麗，賈 彥，崔文靜，馬新穎，王 泳，趙林森，趙 培，葉 雷，閻亞麗,*，陳慶森,*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899）

瑞士乳桿菌調控小鼠腸道菌群變化規律的研究

臧凱麗1，賈 彥1，崔文靜2，馬新穎2，王 泳1，趙林森2，趙 培1，葉 雷1，閻亞麗1,*，陳慶森1,*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899）

為探究瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）TS206對小鼠腸道菌群的調控規律，更好地闡述益生菌維持腸道菌群穩態的機制，本研究以雄性BALB/c小鼠為實驗對象，將其分為L. helveticus TS206組、對照組、空白組。L. helveticus TS206組和對照組分別每天灌胃L. helveticus TS206菌懸液和等量的生理鹽水，連續灌胃7 周，空白組不灌胃。每周采集小鼠新鮮糞便樣品，通過試劑盒提取糞便細菌總DNA，利用Ion torrent個人化操作基因組測序平臺測序技術對16S rRNA基因的V6區進行高通量測序，最后通過生物信息學和多變量統計學方法對測序數據進行分析。結果顯示：所有測序序列在97%相似水平劃分得到1 617 個操作分類單位（operational taxonomic units，OTUs），被劃分為8 個門，硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為各組小鼠中的優勢菌門，占總序列數的97.49%，且硬壁菌門豐度最高，超過70%；優勢菌科主要為S24-7、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）和擬桿菌科（Bacteroidaceae），且與對照組相比L. helveticus TS206組腸桿菌科細菌數量較低并呈下降趨勢。經LEfSe分析有53 個關鍵OTUs與2 組小鼠腸道糞便菌群結構顯著相關，其中27 個OTUs在對照組中富集，分屬于腸桿菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科和梭菌目；26 個OTUs在L. helveticus TS206組中富集，分屬于梭菌目、毛螺菌科和擬桿菌屬，其中與對照組相比，梭菌目豐度水平高。經主成分分析，兩組樣品完全分離，菌群的整體結構存在差異，且富集的OTUs之間呈負相關關系。綜上所述，在實驗階段，灌胃雄性BALB/c小鼠一定劑量的L. helveticus TS206后，經擴增子測序分析獲得的初步結論為L. helveticus TS206能改變腸道菌群整體結構的功效，表現出了抑制腸道有害微生物生長的作用，并通過促進部分有益菌的增殖來維持腸道菌群結構的穩態。

瑞士乳桿菌TS206；腸道菌群；Ion torrent個人化操作基因組測序技術；生物信息學；多變量統計學分析

Lederberg等[1]提出了人是一種由自身細胞和腸道微生物組成的“超級生物體”。人體腸道菌群編碼的基因組可被視為“人的第二基因組”，人的基因組與人體腸道微生物宏基因組相互協調、和諧一致，共同參與人體的營養攝入、代謝和免疫的調控過程。到目前為止，眾多的研究表明腸道菌群的結構和功能與機體的健康狀況息息相關，腸道菌群影響宿主的代謝顯型[2]、營養物質的產生和吸收[3]以及調整和改善機體的免疫系統[4]。腸道內菌群的任何動態平衡的打破都會影響胃腸道內的正?；顒?，造成腸道內的疾病，如炎性腸病、腸應激綜合癥、過敏性反應等[5]，特別是與飲食不當造成的“現代文明病”如肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、結腸癌等發生發展具有密切的關系[6-9]。因此，腸道菌群結構可以忠實而精細地反映人體的健康狀況，而益生菌可以通過改變腸道內微生物結構，維持微生物區系的平衡來調控機體的代謝功能和腸黏膜屏障功能，這對腸道相關疾病的預防和治療具有重要意義[10]。目前，國內外常用的益生菌菌種主要集中在功能特性比較清晰的乳桿菌和雙歧桿菌屬，如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）以及雙歧桿菌（Bif i dobacterium）等[11-12]。

近年來，高通量測序技術是宏基因組學研究中應用最廣泛的測序技術[13]，主流的高通量測序技術主要包括454焦磷酸測序平臺、美國Illumina公司的Hiseq和Miseq測序平臺以及美國Life Technologies公司的Ion torrent個人化操作基因組測序儀（personal genome machine，PGM）和Ion proton測序平臺?；?6S rRNA基因可變區高通量測序的技術（擴增子測序）被廣泛用于腸道微生物群落結構分析中，為解析腸道菌群結構的變化與人體健康的關系提供了很好的技術平臺。

到目前為止，就L. helveticus而言，國內外的研究主要集中在其發酵產生的生物活性物質（比如血管緊張素轉化酶抑制肽等）對機體健康的促進作用。有關L. helveticus調控小鼠腸道菌群為主題的國內外文獻及研究報道較少。王友湘等[14]采用選擇性培養基探討了L. helveticus TS206干預對小鼠腸道菌群結構的影響，發現小鼠腸道內乳酸菌、雙歧桿菌、腸球菌等有益菌的數量顯著增加，提示L. helveticus TS206能夠促進小鼠腸道內有益菌的增殖，能夠維持小鼠腸道微生態系統的平衡。而Frece等[15]通過傳統的平板計數法檢測小鼠糞便中相關細菌的數量，發現灌胃L. helveticus 8 d后小鼠腸道中乳酸桿菌數量增加而腸桿菌以及梭菌屬細菌減少，這也與王友湘等[14]的研究結論相吻合。Taverniti等[16]指出，一些體外研究表明L. helveticus表現出許多常見的益生菌特性，如腸胃中生存能力、定植上皮細胞和抵抗病原體的能力，體內小鼠模型研究表明L. helveticus可以預防胃腸道感染，增強其對病原體的抵抗力，調節宿主免疫反應，并影響腸道菌群的組成。

鑒于針對L. helveticus的這類研究方法較少，所以本研究參考Singh等[17]給小鼠灌胃Bifidobacterium bifidum MIMBb75，利用定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測小鼠腸道菌群變化的方法，以L. helveticus TS206為研究對象，利用擴增子測序技術對長期L. helveticus TS206干預小鼠的腸道菌群結構進行分析，探究L. helveticus TS206調控小鼠腸道菌群結構變化的規律并鑒定出與其干預顯著相關的關鍵菌屬。本研究將豐富L. helveticus TS206的益生功能，為該菌作為功能性食品改善人體健康提供可靠的理論依據，還為以腸道菌群為靶點通過益生菌的攝入來預防各類慢性疾病帶來了全新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. helveticus TS206，天津商業大學實驗室保藏。

110 只6 周齡BALB/c雄性小鼠，SPF級，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK（京）2009-0017。小鼠飼料為普通繁育飼料，SPF級，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

MRS液體培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；乳清粉液體培養基（質量分數10%的乳清粉液體培養基）、腸道菌計數瓊脂（violet red bile dextrose agar，VRBDA）培養基 青島海博生物有限公司；QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 德國QIAGEN企業；Pfu DNA聚合酶、Ion Plus Fragment Library Kit、Ion Xpress? Barcode Adapters Kit、Ion PGM?Template OT2 200 Kit、Ion PGM? Sequencing 200 Kit v2美國賽默飛世爾科技公司；MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司；TAE緩沖液（50×） 上海生物工程有限公司；High Sensitivity DNA Kit 美國安捷倫公司； Qubit?dsDNA HS Assay Kit 美國Invitrogen公司；Agencourt?AMPure?XP Kit美國貝克曼公司。

1.2 儀器與設備

900 SERIES超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司；SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；3K18高速冷凍離心機 美國Sigma公司；DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠；Ion torrent個人化操作基因組測序平臺、INS1005527模板制備系統（Ion One TouchTM2）、8441-21模板富集系統（Ion OneTouch? ES）美國賽默飛世爾科技公司；331-1生物分析儀 美國安捷倫公司；N8050200熒光定量PCR儀 美國ABI公司；Qubit 2.0核酸蛋白定量儀、12321D磁力架 美國Invitrogen公司；II-3DNA紫外-可見分光光度計 英國柏諾公司。

1.3 方法

1.3.1 L. helveticus TS206的培養和富集

將保藏的L. helveticus TS206于乳清粉液體培養基40 ℃活化2 代。將活化后的L. helveticus TS206液按體積分數1%的接種量接種在MRS液體培養基中，40 ℃靜置培養18 h至對數期，5 000 r/min 4 ℃離心10 min收集菌體細胞，無菌生理鹽水洗滌2 次，最后用10 mL無菌生理鹽水懸浮使菌體濃度為3×108～4×108CFU/mL，以備后續動物實驗灌胃使用。

1.3.2 動物實驗

1.3.2.1 動物分組與灌胃

110 只SPF級雄性BALB/c小鼠適應性喂養1 周后隨機分為L. helveticus TS206組、對照組和空白組，其中L. helveticus TS206組45 只，對照組45 只，空白組20 只；L. helveticus TS206組小鼠每天灌胃0.2 mL L. helveticus TS206菌懸液，對照組小鼠每天灌胃等量的生理鹽水，連續灌胃7 周，灌胃結束后再繼續自由飲食飲水飼養1 周，空白組不灌胃；實驗期間各組小鼠均飼喂普通繁育飼料，自由進食和飲水，同時對小鼠的毛發色澤、飲食狀況、活動程度進行記錄。

1.3.2.2 小鼠糞便采集

分別在實驗開始后第0、1、2、3、4、5、6、7、8周早上8 點，采用逼迫法采集L. helveticus TS206組和對照組小鼠新鮮糞便，在第2、4、6、8周采集空白組小鼠糞便，并立即放入冰盒保存后帶回實驗室進行后續實驗。

1.3.3 Ion torrent PGM測序技術探究L. helveticus TS206對小鼠腸道菌群結構的影響

1.3.3.1 小鼠糞便中細菌基因組DNA的提取

迅速稱取-80 ℃凍存的1.3.2.2節所采集小鼠糞便樣品0.2 g，按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit的使用說明提取細菌基因組DNA。用DNA紫外-可見分光光度計進行核酸質量濃度檢測，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

1.3.3.2 腸道細菌16S rRNA V6區的PCR擴增

利用細菌通用引物擴增1 6 S r R N A V 6區片段，上游引物為以下兩引物的等量混合：9 6 7 F（5’-CAACGCGAAGAACCTTACC-3’）和967F（5’-ATACGCGAGGAACCTTACC-3’），下游引物為1046R（5’-CGACARCCATGCASCACCT-3’）。PCR反應體系（50 μL）：5 μL緩沖液（10×）（無Mg2+）、3 μL 25 mmol/L MgSO4、1 μL 10 mmol/L的dNTP、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，50 ng腸道細菌基因組模板DNA，最后加入0.4 μL Pfu DNA 聚合酶（2.5 U/μL），加無菌水至50 μL。為避免非特異性擴增采用降落PCR的方法進行擴增，反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min；退火溫度從65～55 ℃，每個循環降0.5 ℃，55 ℃ 15 個循環，退火30 s；72 ℃延伸1 min，一共35 個循環；最后72 ℃延伸7 min。PCR產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit純化。純化后的擴增產物用Qubit?dsDNA HS Assay Kit進行PCR產物的定量。

1.3.3.3 Ion torrent測序

先用Ion Plus Fragment Library Kit和Ion Xpress?Barcode Adapters Kit進行測序文庫的構建。然后進行測序模板的制備，Ion OneTouch? ES儀器自動對攜帶有測序模板的Ion Sphere? Particles進行富集。最后在Ion torrent個人化操作基因組測序平臺上進行上機測序。

1.3.3.4 測序數據生物信息學和多變量統計學分析

原始數據利用Fast QC軟件進行質控，并利用NG Stoolkits過濾掉低質量序列，利用Usearch方法對所得的高質量序列，根據樣品條碼進行樣品的分選，在97%的相似水平下劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs），生成以序列數代表的每個樣本中每個OTUs豐度的OTU Table（biom文件）。然后按照微生物生態學定量分析（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）[21]的流程進行物種分類地位的確定，并進行稀疏曲線的繪制，計算觀測到的物種（observed species）指數和Shannon指數。最后，計算結果用R語言

3.1.3 軟件進行作圖?；谏鲜龅玫降腛TU Table應用基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）的LEfSe（linear discriminant analysis effect size）算法篩選組間差異OTUs。根據這些差異OTUs的豐度利用R語言3.1.3軟件進行豐度聚類熱圖的繪制和斯皮爾曼相關性系數的計算，并利用Cytoscape 3.2.1軟件繪制互作網絡圖。

1.4 數據統計分析

采用了R語言軟件的wilcox檢驗對數據進行了顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 L. helveticus TS206干預后小鼠腸道微生物整體特征

2.1.1 各樣品中序列和OTUs數目概況

22 個樣本中除去2 個誤差較大的樣本，余下的20 個樣本共獲得3 001 460 條高質量序列，每個樣品的序列分布情況如表1所示。全部序列的長度均在80～120 bp的范圍內，由于細菌16S rRNA基因的V6區平均長度為100 bp，所以本次實驗的測序長度基本能覆蓋V6區。

表1 各樣品中序列和OTUs（97%相似水平）分布Table 1 Numbers of reads and OTUs (97% similarity level) in the library of each sample

在本實驗中，根據16S rRNA基因序列相似度與細菌分類地位之間的對應關系，在97%的序列相似性水平上經過Usearch的方法劃分OTUs。每個樣本的OTUs分布如表1所示，20 個樣本一共獲得了1 617 個OTUs。

2.1.2 L. helveticus TS206干預后小鼠腸道微生物整體結構的改變

通過97%相似水平劃分得到1 617 個OTUs，OTUs的代表序列與Greengene 1308軟件的數據庫進行比對注釋得到每個OTU的物種注釋情況，最后統計各個樣本中各分類水平相對豐度，結果如圖1所示。

圖1 L. helveticus TS206對小鼠腸道菌群門水平上相對豐度的影響Fig. 1 Effect of L. helveticus TS206 on relative abundance of dominant bacterial phyla in the intestine of mice

圖1顯示所有OTUs被劃分為8 個門，其中硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為各組小鼠糞便中的優勢菌門，占總序列數的97.49%。其中硬壁菌門的含量最豐富，約占總序列數的70.66%，含有1 147 個OTUs，其中99.3%的序列屬于Clostridia綱，含有1 135 個OTUs。而擬桿菌門則占總序列數的26.83%，含有313 個OTUs全部屬于Bacteroidales目，其中54.9%的序列是S24-7科細菌，分屬177 個OTUs；其次是擬桿菌科（Bacteroidaceae）占17.8%，分屬37 個OTUs；理研菌科（Rikenellaceae）含有36 個OTUs，占11%；其他序列分屬于普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、Odoribacteraceae科、Paraprevotellaceae科和紫單孢菌科（Porphyromonadaceae），含有63 個OTUs。其余的如放線菌門（Actinobacteria）3 個OTUs、藍細菌門（Cyanobacteria）9 個OTUs、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）1 個OTU、變形菌門（Proteobacteria）17 個OTUs、無壁菌門（Tenericutes）59 個OTUs和疣微菌門（Verrucomicrobia）3 個OTUs，它們的相對豐度較低，在各樣品中所占比例基本都不足1%，另外，還有0.5%左右的無法確定具體分類地位的細菌。

從圖1可以看到，L. helveticus TS206灌胃組小鼠腸道擬桿菌門（Bacteroidetes）細菌的相對豐度隨著灌胃L. helveticus TS206時間延長有降低的趨勢，在灌胃第6周擬桿菌門細菌相對豐度降到最低，由最初的27.5%降到17.8%；對照組小鼠腸道擬桿菌門細菌豐度雖然在第2、3周（B2、B3）有所波動，但實驗期間基本維持在同一水平。伴隨著擬桿菌門細菌相對豐度的降低，L. helveticus TS206灌胃組小鼠腸道硬壁菌門細菌相對豐度相應升高，由起初的71.4%增加到第6周的80.7%。

圖2 L. helveticus TS206對小鼠腸道菌群科水平上相對豐度的影響Fig. 2 Effect of L. helveticus TS206 on relative abundance of major bacterial families in the intestine of mice

各組小鼠腸道菌群在科水平上主要物種相對豐度的變化如圖2所示。在科的水平上豐度占優勢地位的主要為S24-7、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）和理研菌科（Rikenellaceae）的細菌。經過干預后，對瘤胃球菌科細菌作用持續性較好，對動物的生理影響也比較持久。而毛螺菌科細菌在灌胃L. helveticus TS206后相對豐度波動較大，但是總體上都高于對照組。同時，在灌胃L. helveticus TS206后有顯著變化的理研菌科從起初的2.9%降低到第7周（A7）的0.7%，也顯著低于對照組（4.1%）；S24-7科細菌從最初的27.5%降低到第6周（A6）的11.3%，也低于對照組的平均水平（17.4%）。綜合在門水平上的比較結果，可以得知灌胃L. helveticus TS206后小鼠腸道菌群擬桿菌門細菌豐度的降低可能是由于理研菌科和S24-7科細菌的降低引起的。

另外，對各組小鼠腸道中豐度較低的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌的相對豐度也進行了比較，發現雖然它們在各組小鼠腸道中的總體相對豐度較低，且在各個樣本中的個體差異也比較大，但是總體而言在L. helveticus TS206組小鼠腸道中腸桿菌科細菌的相對豐度要比對照組低一個數量級。這一結果通過傳統的平板計數的方法得到了驗證，結果如圖3所示。在整個實驗過程中，L. helveticus TS206組小鼠腸道中腸菌科細菌數量具有降低趨勢，到灌胃第4周（A4）降到最低，相比于對照組，隨后一直處于較低水平；而對照組小鼠腸桿菌科細菌則是隨著實驗時間的延長而增加。雖然在L. helveticus TS206灌胃前兩周時，對照組小鼠腸桿菌數量都低于L. helveticus TS206組，差異極顯著（P＜0.01），但是從第3周開始一直到實驗結束，L. helveticus TS206灌胃組小鼠腸道內腸桿菌數量一直顯著地低于對照組（P＜0.05）。

圖3 瑞士乳桿菌對小鼠腸道中腸桿菌科細菌數量的影響Fig. 3 Effect of L. helveticus TS206 on the number of intestinal Enterobacteriaceae in mice

2.2 L. helveticus TS206對小鼠腸道微生物α多樣性的影響

為了進一步研究L. helveticus TS206對小鼠腸道微生物整體結構的影響，從各樣本腸道菌群的豐富度和均勻度的層面研究小鼠腸道微生物的多樣性。以各樣品在97%相似水平上劃分的OTUs數據為對象，通過QIIME分析了各樣本的α多樣性，首先通過稀釋曲線和反映樣本物種豐富度的observed species指數來研究兩組樣本物種多樣性的差異，其次通過反應微生物多樣性和均勻度的Shannon指數來研究兩組樣本的多樣性和均勻度的差異，發現L. helveticus TS206對小鼠腸道微生物α多樣性造成了一定程度的影響。

圖4 對照組和益生菌組各樣本稀釋曲線Fig. 4 Rarefaction curves of OUT diversity for control and probiotic groups

圖5 L. helveticus TS206對腸道微生物α多樣性指數的影響Fig. 5 Effect of L. helveticus TS206 on α diversity index of gut microbiota

圖4結果表明各組樣本的OTUs數目隨著測序深度的增加基本達到飽和，說明當前測序深度足以發現各樣本生境中的大部分物種。而2 組樣本的稀釋曲線交錯，說明2 組小鼠腸道物種多樣性并沒有大的差異；這與圖5a兩組小鼠腸道微生物observed species指數差異分析箱圖的結果一致，雖然差異分析箱圖顯示對照組要略高于L. helveticus TS206組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖5b中兩組小鼠腸道微生物Shannon指數的差異分析也出現同樣結果，在灌胃L. helveticus TS206后α多樣性指數與對照組相比較低，但是差異不顯著（P＞0.05），以上說明L. helveticus TS206對小鼠腸道微生物整體多樣性沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.3 與2 組小鼠腸道糞便菌群結構差異顯著相關的腸道關鍵OTUs

上述腸道微生物整體結構的分析發現，2 組小鼠腸道微生物具有一定程度的差異。采用LEfSe差異分析算法篩選出L. helveticus TS206組與對照組間具有顯著差異的OTUs，結果如圖6所示。

圖6 與L. helveticus TS206灌胃相關的腸道關鍵OTUsFig. 6 Key OTUs of gut microbiota responding to L. helveticus TS206

通過LEfSe分析尋找到53 個OTUs是造成L. helveticus TS206組和對照組小鼠腸道菌群結構差異的關鍵物種。相對于對照組，27 個OTUs在L. helveticus TS206組中豐度較低，26 個OTUs在L. helveticus TS206組豐度富集（圖6a）。

從圖6b中可以發現，共有3 個OTUs（OTU1 488、OTU1 588、OTU1 598）屬于腸桿菌科和1 個屬于瘤胃球菌科的OTUs均在對照組中富集；同時，在這53 個差異OTUs中，有15 個OTUs屬于梭菌目（Clostridiales），而7 個屬于梭菌目的OTUs以及部分屬于擬桿菌屬的OTUs在L. helveticus TS206組豐度更高。在53 個差異OTUs中一共有10 個OTUs屬于毛螺菌科，其中有5 個（OTU1 248、OTU801、OTU771、OTU1 355、OTU 1 295）在L. helveticus TS206組富集，另外5 個（OTU468、OTU462、OTU1 238、OTU952、OTU659）在對照組中富集，這些均說明即使屬于同一分類水平的物種在腸道中可能會發揮不同的功能。

2.4 與L. helveticus TS206相關的腸道關鍵物種對各組樣本腸道微生物整體結構差異的影響

為了探究通過LEfSe分析尋找到53 個關鍵OTUs對2 組樣本的整體分布情況，基于53 個關鍵OTUs進行主成分分析，結果如圖7所示。

圖7 關鍵OTUs對2 組樣本菌群結構分布的影響Fig. 7 Effect of key OTUs on gut microbiota structures

通過主成分分析可以發現，基于53 個關鍵OTUs的相對豐度進行降維分析，L. helveticus TS206組所有樣本聚為一類，對照組所有樣本也聚為一類，并且2 組在圖7中差異顯著（P＜0.05），這從另一層面上說明這53 個差異顯著OTUs可能是造成L. helveticus TS206組與對照組小鼠腸道菌群結構差異的關鍵物種。

2.5 關鍵OTUs在2 組樣本間互作網絡的特征

為了進一步研究53 個差異OTUs在2 組樣本間的互作關系的特征，根據53 個OTUs在2 組樣本中的豐度信息計算斯皮爾曼相關性系數，根據各個OTUs間的相關系數大小繪制互作網絡圖，如圖8所示。在對照組富集的和在L. helveticus TS206組富集的OTUs之間互作關系緊密，并且在2 組富集的OTUs之間均呈負相關關系，這也充分說明這些差異OTUs在兩組樣本的腸道中可能存在競爭抑制的關系。并且，只在對照組富集的屬于腸桿菌科的OTUs與L. helveticus TS206組多個OTUs具有負相關關系，最為明顯的是與屬于梭菌目的OTU41有負相關關系，這也提示該梭菌目的OTUs可能是L. helveticus TS206組中關鍵的OTUs，并能抵制腸桿菌科物種的增殖作用。另外，只在對照組中富集的屬于瘤胃球菌科的OTUs也與L. helveticus TS206組多個OTUs呈現負相關關系；此外，在L. helveticus TS206組富集的豐度較高的擬桿菌屬的OTUs也與對照組多個OTUs呈現負相關關系。這些在互作網絡圖中呈現了豐富連接關系的OTUs節點可能是與L. helveticus TS206組和對照組小鼠腸道微生物結構差異有關的關鍵OTUs，有待于更深入的探討。

圖8 關鍵OTUs間互作關系網絡圖Fig. 8 Interaction network among key OTUs

3 討 論

人體腸道有種類繁多的微生物，而這些微生物與機體一直處于相互作用的動態平衡中，一旦這種平衡失調就會造成腸道疾病甚至是系統性的慢性疾病。在腸道微生物與宿主相互作用的過程中，宿主自身的基因型、年齡和免疫系統以及飲食結構和營養的攝入等因素共同影響著腸道菌群的形成及多樣性組成[18-20]。食品的攝入一方面會改變腸道菌群的結構，另一方面食品中難以被人體吸收的成分通過腸道菌群的作用影響食品的營養。而益生菌作為當前人們日常生活中常用的食品，能夠有效地維持機體與腸道菌群處于相互作用的動態平衡中。

本研究發現各組小鼠腸道菌群在門水平上的組成基本無差異，都以擬桿菌門和硬壁菌門為主，相對豐度超過95%，且硬壁菌門豐度最高，超過70%。有其他研究發現，在正常人和小鼠腸道中擬桿菌門和硬壁菌門是兩大優勢菌門，幾乎占腸道所有細菌的90%以上[21-22]，并且硬壁菌門是最為優勢的一類菌，大多數屬于梭菌綱[23]，其次是豐度較低的放線菌門和變形菌門[24-25]。在本實驗中，L. helveticus TS206組小鼠腸道菌群隨著灌胃時間的延長，擬桿菌門豐度有降低的趨勢，而硬壁菌門有升高的趨勢。

屬于硬壁菌門的梭菌目的球形梭菌和柔嫩梭菌亞群中，大多數細菌是產丁酸鹽細菌[26]，主要通過丁酸激酶或通過丁酰CoA、乙酰CoA轉移酶的作用產生丁酸[27]。丁酸是腸上皮細胞能量的主要來源，而且在調節炎癥性反應、細胞增殖和凋亡及抗結直腸癌方面也有重要作用[28-29]，例如Faecalibacterium prausnitzii就是典型的丁酸產生菌，具有明顯的抗炎作用[30]。本研究發現各組小鼠腸道中豐度最高的是梭菌目細菌，通過LEfSe分析發現梭菌目是L. helveticus TS206造成小鼠腸道菌群結構差異的關鍵菌屬，且在L. helveticus TS206組小鼠腸道中豐度更高，這表明L. helveticus TS206可能會通過增加腸道中梭菌目中丁酸產生菌的數量來維持腸道菌群結構的穩定和腸道的健康。另外，也有研究顯示梭菌在機體腸道中可以通過分泌短鏈脂肪酸來誘導和調節調節性T細胞的增殖和分化來塑造腸道內穩定的免疫系統[31-32]，在本實驗中，L. helveticus TS206誘導的腸道梭菌目細菌的增加可能會對穩定腸道免疫平衡有重要作用。但是由于測序片段較短、分類地位不夠明確，有待進一步研究這些梭菌目細菌的具體分類地位。

此外，本實驗還發現在L. helveticus TS206灌胃后，豐度顯著增加的菌屬中大部分是對腸道健康有益的菌屬，而在對照組中一些對機體健康不利的細菌豐度較高。例如，由LEfSe分析得知L. helveticus TS206組中跟丁酸產生相關的梭菌目細菌具有更高的豐度，而瘤胃菌科只在對照組中富集。另一方面，在對照組中小鼠腸道中腸桿菌科細菌豐度顯著高于L. helveticus TS206組，這個結果也通過傳統的平板培養計數實驗得到驗證。腸桿菌科細菌是常見的內毒素產生菌，能夠誘導機體產生炎癥性反應，是典型的條件致病菌[21]。王友湘[14]、Frece[15]等在先前的研究中也發現L. helveticus灌胃能夠顯著增加腸道內乳酸菌和雙歧桿菌的數量，抑制腸桿菌的增殖，這與本研究得到的結論相似。

在本研究中，還鑒定出與L. helveticus TS206灌胃顯著相關的其他菌屬。目前對這些菌屬的研究較少，而且對這些菌屬的具體作用也不明確。例如，分屬于毛螺菌科和瘤胃菌科的OTUs與2 組小鼠腸道菌群差異都顯著相關，而且在L. helveticus TS206組小鼠腸道中豐度顯著增加的毛螺菌科OTUs數更多。有研究顯示，瘤胃菌科細菌在結直腸癌高風險人群腸道內要高于低風險人群[33]。另一項研究也描述了毛螺菌科細菌與結直腸癌的相關性，研究者在評估結直腸癌與腸道菌群的相關性是發現腺瘤患者的一些OTUs相對豐度較高，包括與瘤胃菌科、假單胞菌屬和紫單胞菌科相關的OTUs，而與擬桿菌屬、毛螺菌科、梭菌目及其他梭菌屬相關的OTUs則相對豐度較低[34]。但是，瘤胃菌科和毛螺菌科細菌都是宿主腸道中常見菌屬，因此在本研究中2 組小鼠腸道中都有與之相關的OTUs的相對豐度增高，它們在腸道中的具體功能還應進一步通過功能分析來驗證。

4 結 論

本研究通過給健康小鼠長期灌胃L. helveticus TS206，利用Ion torrent PGM測序技術和多變量統計學方法分析得知L. helveticus TS206組與對照組小鼠腸道菌群結構具有顯著差異。根據測序的數據分析，得到了以下幾點提示：從門的水平上分析，各組小鼠腸道糞便中的主要菌群主要由硬壁菌門和擬桿菌門組成，同時L. helveticus TS206能夠一定程度上增加腸道微生物中硬壁菌門的相對豐度，并伴隨著擬桿菌門相對豐度的降低；從科水平上分析，豐度占優勢地位的細菌主要為S24-7、毛螺菌科、瘤胃球菌科、理研菌科和擬桿菌科；此外，結合門水平分析結果，L. helveticus TS206組擬桿菌門細菌豐度的降低是由理研菌科和S24-7科豐度降低引起的；同時，與對照組相比，L. helveticus TS206組腸桿菌科細菌數量具有降低趨勢。另外，經LEfSe分析篩選出L. helveticus TS206組與對照組間具有顯著差異的53 個關鍵OTUs，其中腸桿菌科和瘤胃菌科在對照組中富集，梭菌目在L. helveticus TS206組中具有更高的豐度；經主成分分析證實這53 個關鍵OTUs可能是造成L. helveticus TS206組與對照組小鼠腸道菌群結構差異的關鍵物種；且通過互作網絡圖可知，2 組富集的OTUs之間均呈負相關關系，可見這些差異OTUs在2 組樣本的腸道中可能存在競爭抑制的關系。因此，研究經生物信息學分析，初步顯示L. helveticus TS206可以通過抑制腸道有害微生物的生長、促進有益菌的增殖來維持腸道菌群結構的穩態。然而，研究尚需進一步的定量PCR等驗證工作，以充分證實L. helveticus TS206對腸道菌群的調控能力。

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Modulation of Probiotic Lactobacillus helveticus on Gut Microbiota in Mice

ZANG Kaili1, JIA Yan1, CUI Wenjing2, MA Xinying2, WANG Yong1, ZHAO Linsen2, ZHAO Pei1, YE Lei1, YAN Yali1,*, CHEN Qingsen1,*
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China; 2. Hebei Inatural Biological Technical Company, Shijiazhuang 050899, China)

Objective: To explore the role of the probiotic strain Lactobacillus helveticus TS206 in regulating the intestinal microf l ora in mice and to unravel the mechanisms by which probiotics can maintain intestinal fl ora homeostasis. Methods:Male BALB/c mice were divided into probiotic, control and blank groups. The probiotic and control groups were respectively gavaged with L. helveticus suspension and an equal volume of normal saline once a day for 7 consecutive weeks, respectively. The blank group did not receive gavage. Stool samples were collected every week for extracting genomic DNA by means of a commercial kit. The V6 variable region of the 16S rRNA gene was subjected to highthroughput sequencing by using the Ion torrent personal genome machine system and the obtained data were analyzed using bioinformatic tools and multivariable statistical analysis. Results: All sequence reads were delineated into 1 617 operational taxonomic units (OTUs) at a 97% similarity level, belonging to 8 major bacterial phyla, with Firmicutes and Bacteroidetes being the dominant ones in all groups, accounting for 97.49% of the total number of sequences, amongwhich Firmicutes showed the highest abundance of more than 70%. The strain S24-7, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae,Rikenellaceae, and Bacteroidaceae were the dominant bacterial families, and the Enterobacteriaceae population in the probiotic group was lower than in the control group and fell during the administration period. Totally 53 key OTUs were signif i cantly associated with the bacterial community structure in the intestine of the two groups of mice as determined by linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis, of which, 27 OTUs were enriched in the control group, belonging to Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae and Clostridium, and 26 OTUs in the L. helveticus TS206 group,belonging to Clostridium, whose abundance level was higher than in the control group, Lachnospiraceae and Bacteroides.Principal component analysis showed that the fecal microbial communities of the probiotic group were completely separated from those of the control group. Overall there were signif i cant differences in the structure of intestinal fl ora between the two groups, and the OTUs in the groups showed a negative correlation. Conclusion: L. helveticus TS206 can change the structure of intestinal fl ora, inhibiting the growth of harmful microbes, promoting the proliferation of benef i cial bacteria proliferation and consequently maintaining the structure of the intestinal fl ora at a steady state.

Lactobacillus helveticus TS206; gut microbiota; Ion torrent personal genome machine sequencing technology;bioinformatics; multivariate statistical analysis

10.7506/spkx1002-6630-201801024

TS201.3

A

1002-6630（2018）01-0156-09

臧凱麗, 賈彥, 崔文靜, 等. 瑞士乳桿菌調控小鼠腸道菌群變化規律的研究[J]. 食品科學, 2018, 39(1): 156-164.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801024. http://www.spkx.net.cn

ZANG Kaili, JIA Yan, CUI Wenjing, et al. Modulation of probiotic Lactobacillus helveticus on gut microbiota in mice[J]. Food Science, 2018, 39(1): 156-164. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801024. http://www.spkx.net.cn

2017-04-10

國家自然科學基金面上項目（31071522）

臧凱麗（1993—），女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質與腸道健康。E-mail：1623249305@qq.com

*通信作者簡介：閻亞麗（1962—）女，副教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、微生物學。E-mail：yyali@tjcu.edu.cn

陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、食源性生物活性物質與腸道健康。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn