桑葚濃縮汁對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠脾臟的保護(hù)作用

劉亞飛，彭新顏,*，賀紅軍，金成武，蘇樹(shù)飛，楊曉帥

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

桑葚濃縮汁對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠脾臟的保護(hù)作用

劉亞飛1，彭新顏1,*，賀紅軍2，金成武1，蘇樹(shù)飛1，楊曉帥1

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

研究桑葚濃縮汁對(duì)D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）誘導(dǎo)氧化損傷大鼠脾臟的保護(hù)作用。采用D-Gal建立衰老模型，將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、D-Gal模型陰性對(duì)照組、D-Gal+VE陽(yáng)性對(duì)照組、D-Gal+桑葚濃縮汁（低、中、高）劑量組6組。檢測(cè)脾臟總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）的活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，血清中腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）的質(zhì)量濃度，并對(duì)脾臟指數(shù)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-9、Caspase-3）的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)桑葚濃縮汁對(duì)氧化損傷大鼠脾臟的影響。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，桑葚濃縮汁中、高劑量組均可提高脾臟組織T-SOD、GSH-Px、CAT的活力（P＜0.05），各劑量處理組均可降低MDA含量（P＜0.05）及TNF-α、IL-6的表達(dá)，提高脾臟指數(shù)。其中高劑量處理組的T-SOD、GSH-Px、CAT活力分別達(dá)到了113.22、90.17、7.67 U/mg pro，作用效果明顯；MDA含量降至13.59 nmol/mg，脾臟指數(shù)升至4.12 mg/g，均達(dá)到了正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組水平（P＞0.05）；TNF-α、IL-6水平下降至56.95、76.83 pg/mL。免疫組化結(jié)果顯示，桑葚濃縮汁處理組Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)均有減輕，其中高劑量組效果最好。蘇木素-伊紅染色結(jié)果也證實(shí)，桑甚濃縮汁可保護(hù)脾臟結(jié)構(gòu)，有效增加淋巴細(xì)胞數(shù)量，改善充血現(xiàn)象?？梢?jiàn)，桑葚濃縮汁對(duì)氧化損傷大鼠脾臟有一定的保護(hù)作用，并呈一定的量效關(guān)系。

桑葚濃縮汁；D-半乳糖；氧化損傷；脾臟

近年來(lái)，心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病、阻塞性肺部疾病、精神病等慢性疾病的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。研究表明，自由基過(guò)量是造成這些疾病的重要原因之一，過(guò)量的自由基會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能損傷，使機(jī)體組織細(xì)胞的新陳代謝功能紊亂，破壞機(jī)體的正常秩序，造成多種器官組織病變或功能異常[2]。因此，為減少過(guò)量自由基對(duì)機(jī)體的損傷及造成的衰老等病變，抗氧化物質(zhì)的研究越來(lái)越受到重視，天然抗氧化物的開(kāi)發(fā)已成為研究熱點(diǎn)[3]。

桑葚作為一種“藥食同源”的植物果實(shí)，含有人體必需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。國(guó)內(nèi)外研究表明，桑葚含有黃酮、多糖、花色苷、多酚等多種抗氧化成分，具有清除自由基、抗氧化、防衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等保健功效[4]。范金波等[5]研究發(fā)現(xiàn)，桑葚中總酚、黃酮含量最多，并測(cè)得其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）自由基清除能力和鐵離子還原能力較高。Lin等[6]分析桑葉、桑枝和果實(shí)主要抗氧化成分及含量差異，發(fā)現(xiàn)桑葚中東莨菪素含量最高，桑葉中蘆丁含量最高，黑果中槲皮素含量較高，桑枝中山奈酚的濃度較高。鄧秀婷等[7]用不同劑量的桑葚提取液灌胃大鼠40 d，發(fā)現(xiàn)其血清及肝臟中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力升高，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量下降。Liu Huan等[8]也證實(shí)，桑葚提取物可提高肝抗氧化蛋白的表達(dá)，加快硝基苯酚（nitrophenol，NP）的代謝和排泄，對(duì)NP誘導(dǎo)的大鼠毒性起解毒作用。Li Yuxian等[9]利用腹腔注射CCl4建立大鼠模型，對(duì)比各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸等含量，發(fā)現(xiàn)桑葚花青素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有很強(qiáng)的保護(hù)作用。Jiang Yan等[10]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)黑桑葚提取物可抑制大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，增強(qiáng)抗氧化活性，減少動(dòng)脈粥樣硬化病變。可見(jiàn)，桑葚中存在多種抗氧化功效成分。

2000年，Eberhardt等[11]在Nature上發(fā)表“營(yíng)養(yǎng)——新鮮蘋果的抗氧化劑活性”一文，受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，這些學(xué)者提出果蔬中所有成分的協(xié)同作用是其發(fā)揮抗氧化和防癌功效的重要原因。但目前有關(guān)桑葚抗氧化、防衰老及解毒的報(bào)道多集中在某種成分的研究[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)以建立D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）衰老模型為切入點(diǎn)，研究桑葚濃縮全汁對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟生化指標(biāo)和炎癥因子的影響，為桑葚濃縮汁在體內(nèi)抗氧化作用模式及其機(jī)制研究提供理論依據(jù)，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)、生活和開(kāi)發(fā)天然食物具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康Wistar雄性大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（京）2011-0011，使用許可證號(hào)SYXK（魯）20160022。

無(wú)籽大十黑桑葚（Fructusmori）購(gòu)自煙臺(tái)惠安市場(chǎng)。

D-Gal 北京索萊寶科技有限公司；總SOD（total superoxide dismutase，T-SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、GSH-Px、MDA試劑盒 上海通蔚生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）定量檢測(cè)試劑盒 上海生物技術(shù)有限公司；大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）試劑盒 上海恪敏生物科技有限公司；Caspase活力檢測(cè)試劑盒 海德創(chuàng)業(yè)（北京）生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA504B精密電子分析天平 浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋 浙江托普儀器有限公司；MB16-414酶標(biāo)儀 上海勝衛(wèi)電子科技有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海儀田精密儀器有限公司；JK21710電動(dòng)攪拌器 北京精凱達(dá)儀器有限公司；GTR16-2型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；XH-C微型混合器 江蘇省金壇區(qū)白塔安瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桑葚濃縮汁的制備流程及主要營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定

新鮮桑葚→洗凈晾干→榨汁（出汁率約70%）→4 層和8 層紗布分別過(guò)濾3 次→0.45 μm膜過(guò)濾→桑葚原汁→濃縮2 倍→4 ℃冷藏保存?zhèn)溆?/p>

分別測(cè)定濃縮汁的花青素（pH值示差法）、VC（碘量滴定法）、總酚（福林-酚試劑法）、黃酮（亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法）及總糖（斐林試劑法）含量[12]。

1.3.2 D-Gal致衰老模型大鼠的建立

參考彭新顏等[13]的方法，選擇健康雄性Wistar大鼠72只（體質(zhì)量260～340 g），將大鼠分籠、給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成6 組：正常對(duì)照組、D-Gal模型陰性對(duì)照組、D-Gal+VE陽(yáng)性對(duì)照組、D-Gal+桑葚濃縮汁（低、中、高）劑量組，期間有淘汰，最終每組10只。正常對(duì)照組大鼠頸背部皮下注射生理鹽水并于第2周給予50 mg/kg雙蒸水作為正常對(duì)照組。其他5 組于第2周頸背部注射D-Gal（120 mg/kg），每日注射一次，連續(xù)注射8周建立衰老模型；同時(shí)，于第2周每日分別灌胃等量雙蒸水、VE 50 mg/kg，低、中、高劑量組灌胃桑葚濃縮汁2.5、5.0、10.0 mL/kg。

1.3.3 血清的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取大鼠眼球取血，血樣于4 ℃冰箱放置12 h，然后4 ℃、3 000 r/min離心10～15 min，收集上清液，即為血清。

1.3.4 脾臟指數(shù)測(cè)定和組織勻漿的制備

參考范楨亮等[14]的方法并稍作修改，8 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量大鼠體質(zhì)量，斷頸處死，摘取脾臟并用濾紙吸干表面血液，電子天平精確稱其質(zhì)量，根據(jù)下式計(jì)算其脾臟指數(shù)。

測(cè)定脾臟指數(shù)后，除去脾臟周圍的脂肪及結(jié)締組織，置于生理鹽水中洗凈臟器表面黏附的血污，用潔凈的濾紙吸干表面水分，取1 g置于小燒杯中，并加入10 mL生理鹽水，在4 ℃水浴中用眼科小剪迅速剪碎組織塊，冰浴勻漿，低溫3 000 r/min離心15 min，取上清液，制成10%組織漿液。

1.3.5 生化指標(biāo)測(cè)定

抗氧化酶系中T-SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量的檢測(cè)，炎癥因子TNF-α、IL-6水平的測(cè)定，都按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.6 脾組織形態(tài)學(xué)觀察

采用石蠟切片觀察病理變化，取大鼠脾組織，厚度大約為4～5 mm。在4 ℃環(huán)境下以4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)各梯度體積分?jǐn)?shù)酒精脫水（75%、80%、85%、90%、95%、100%）、石蠟包埋、切片機(jī)切片（厚度約4 μm）、蘇木素-伊紅法（hematoxylin and eosin，HE）染色、封片等步驟制成切片，在顯微鏡下觀察病理變化。

1.3.7 對(duì)大鼠脾組織蛋白Caspase-9、Caspase-3表達(dá)的測(cè)定

經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，滴加Caspase-9、Caspase-3一抗、二抗，按試劑盒說(shuō)明對(duì)切片標(biāo)本進(jìn)行染色，3,3-四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺顯色，蒸餾水洗、脫水、封片，顯微鏡觀察，免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果均以 ±s表示。采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過(guò)SigmaPlot 12.0和Excel 6.0軟件作圖，差異顯著性分析使用Tukey HSD程序，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚濃縮汁主要成分含量

實(shí)驗(yàn)測(cè)得桑葚濃縮汁中主要營(yíng)養(yǎng)成分及其含量為：花青素0.98 g/L、VC 44 mg/L、總酚534 mg/L、黃酮1.17 g/L、總糖6.7%。

2.2 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟T-SOD活力的影響

圖1 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠脾臟T-SOD活力的影響Fig. 1 Effect of mulberry juice concentrate on T-SOD activity in spleen of rats with D-Gal-induced injury

從圖1可看出，造模后，陰性對(duì)照組大鼠脾臟T-SOD活力顯著低于其他各組（P＜0.05），說(shuō)明造模成功，陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組和桑葚濃縮汁高劑量組的T-SOD活力分別為（114.86±1.93）、（111.89±3.84）、（113.22±2.85）U/mg pro，三者間差異不明顯（P＞0.05），桑葚濃縮汁高劑量組比陰性對(duì)照組、低劑量組分別提高了26.4%、26.6%（P＜0.05），并達(dá)到了正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的水平，而且桑葚濃縮汁中劑量與高劑量組效果相當(dāng)（P＞0.05）。

2.3 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟GSH-Px活力的影響

圖2 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠脾臟GSH-Px活力的影響Fig. 2 Effect of mulberry juice concentrate on GSH-Px activityin spleen of rats with D-Gal-induced injury

如圖2所示，桑葚濃縮汁低、中、高劑量組GSH-Px活力分別為（68.01±3.40）、（76.36±2.45）、（90.17±4.69）U/mg pro，其中低劑量組與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），中劑量組與陰性對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。桑葚濃縮汁高劑量組效果最好，比低、中劑量組和陰性對(duì)照組分別提高了32.6%、18.1%、39.3%（P＜0.05），并與正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.4 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟CAT活力的影響

圖3 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠脾臟CAT活力的影響Fig. 3 Effect of mulberry juice concentrate on CAT activity in spleen of rats with D-Gal-induced injury

從圖3可以看出，桑葚濃縮汁低、中、高劑量組的CAT活力分別為（6.18±0.25）、（7.27±0.07）、（7.67±0.10）U/mg pro，與陰性對(duì)照組相比分別增加了15.1%、35.4%、42.8%（P＜0.05），其中，桑葚濃縮汁中、高劑量組與低劑量組差異顯著（P＜0.05），但3種桑葚濃縮汁處理組均未達(dá)到正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組水平（P＜0.05）。

2.5 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟MDA含量的影響

圖4 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠脾臟MDA含量的影響Fig.4 Effect of mulberry juice concentrate on MDA level in spleen of rats with D-Gal-induced injury

由圖4可知，MDA含量在陽(yáng)性對(duì)照組中最低，其次為桑葚濃縮汁高劑量組和正常對(duì)照組，三者分別達(dá)到（13.07±0.99）、（13.59±1.39）、（15.40±1.38）nmol/mg，三者之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），中、高劑量組顯著低于低劑量組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），桑葚濃縮汁高劑量組達(dá)到了正常對(duì)照組的效果，說(shuō)明桑葚濃縮汁對(duì)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化有較好的效果。

2.6 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟指數(shù)的影響

圖5 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠脾臟指數(shù)的影響Fig. 5 Effect of mulberry juice concentrate on spleen index in rats with D-Gal-induced injury

如圖5所示，與正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組的脾臟指數(shù)明顯下降，表明D-Gal誘導(dǎo)大鼠脾臟指數(shù)降低，影響了機(jī)體免疫力。經(jīng)桑葚濃縮汁低、中、高劑量處理后，大鼠脾臟指數(shù)均有增加，其中高劑量組的效果最為明顯，含量為（4.12±0.29）mg/g，與低、中劑量組和陰性對(duì)照組相比分別增加了43.6%、26.0%、46.6%（P＜0.05），并達(dá)到正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的水平（P＞0.05），說(shuō)明桑葚濃縮汁對(duì)維持氧化損傷的大鼠脾臟指數(shù)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力起到重要作用。

2.7 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟TNF-α、IL-6的影響

如圖6所示，桑葚濃縮汁各處理組均可降低TNF-α水平。桑葚濃縮汁低劑量組的TNF-α質(zhì)量濃度為（74.22±2.29）pg/mL，與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），中、高劑量組質(zhì)量濃度分別為（68.19±3.56）、（56.95±6.14）pg/mL，相比于陰性對(duì)照組分別降低了16.5%、30.3%（P＜0.05），但均未達(dá)到正常對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組的水平。

圖6 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠TNF-α的影響Fig. 6 Effect of mulberry juice concentrate on TNF-α expression in spleen of rats with D-gal-induced injury

圖7 桑葚濃縮汁對(duì)D-Gal誘導(dǎo)大鼠IL-6的影響Fig. 7 Effect of mulberry juice concentrate on IL-6 expression in spleen of rats with D-Gal-induced injury

由圖7可知，在I L-6方面，桑葚濃縮汁低、中、高劑量組質(zhì)量濃度分別為（109.66±2.60）、（94.21±6.36）、（76.83±5.87）pg/mL，與陰性對(duì)照組相比分別降低了17.3%、29.0%、42.1%（P＜0.05），三者存在明顯的量效關(guān)系，其中高劑量組效果最佳，達(dá)到了正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的水平。

2.8 桑葚濃縮汁對(duì)大鼠脾臟Caspase-9、Caspase-3的影響

圖8 各處理組大鼠脾臟組織Caspase-9表達(dá)Fig. 8 Expression of caspase-9 in spleen tissues

圖9 各處理組大鼠脾臟組織Caspase-3表達(dá)Fig. 9 Expression of caspase-3 in spleen tissues

Caspase-9、Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)部位均是在細(xì)胞的胞漿、胞質(zhì)中，經(jīng)免疫組化染色后出現(xiàn)棕黃色顆粒。由圖8、9可知，在正常組中，Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)率低。而陰性對(duì)照組與正常組比較，具有明顯差別，Caspase-9、Caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)明顯增高，出現(xiàn)深棕黃色顆粒。桑葚濃縮汁處理組與模型陰性對(duì)照組相比，中、高劑量組中Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)均明顯降低，低劑量組與陰性對(duì)照組比較，差異不明顯。

2.9 大鼠脾臟組織HE染色結(jié)果

圖10 各處理組大鼠脾臟病理學(xué)切片F(xiàn)ig. 10 Histopathological observation of spleen tissues

如圖10所示，正常組脾臟在低倍鏡下觀，形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整、清晰，表面被膜伸入實(shí)質(zhì)內(nèi)形成小梁，可見(jiàn)白髓及紅髓區(qū)，白髓由脾小體及動(dòng)脈周圍淋巴鞘組成，脾小體結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)中央動(dòng)脈。陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，脾臟結(jié)構(gòu)消失、欠清，紅髓髓竇擴(kuò)張、充有大量的紅細(xì)胞，白髓淋巴細(xì)胞減少，脾小結(jié)體積變小，紅髓髓索變窄，脾竇擴(kuò)張淤血。桑葚濃縮汁處理組病變與陰性對(duì)照組比較，脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯改善，紅髓、白髓分界較清晰，紅髓區(qū)可見(jiàn)少量淤血，白髓淋巴小結(jié)數(shù)量均有不同程度增多，生發(fā)中心較明顯，細(xì)胞分布均勻。其中以中、高劑量組較好，陽(yáng)性對(duì)照組治療效果最佳，低劑量組療效欠佳。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射外源性的D-Gal造模后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成組織器官的氧化性應(yīng)激損傷，是目前公認(rèn)的建立動(dòng)物衰老模型的方法[15]。T-SOD、GSH-Px、CAT是生物抗氧化防御體系中重要的抗氧化酶類[16]，分別通過(guò)清除超氧陰離子自由基、脂類自由基、過(guò)量的H2O2來(lái)維持細(xì)胞正常功能，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷的能力，提高機(jī)體免疫功能[17-18]。MDA是生物膜中內(nèi)源性脂質(zhì)過(guò)氧化的主要指標(biāo)，它反映了脂質(zhì)過(guò)氧化所產(chǎn)生的自由基含量，通常用于分析脂質(zhì)過(guò)氧化程度[19]。本實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組與正常組相比，大鼠脾臟T-SOD、GSH-Px和CAT活力均顯著下降（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明D-Gal能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的活性自由基，使抗氧化體系紊亂，說(shuō)明造模成功。經(jīng)桑葚濃縮汁處理可明顯提高氧化損傷大鼠脾臟的3種抗氧化酶活力，顯著降低MDA含量，結(jié)果與鄧秀婷等[7]用不同劑量的桑葚提取液灌胃大鼠40 d后一致。其中以高劑量組作用效果最明顯，表明桑葚濃縮汁可以增強(qiáng)抗氧化酶活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，抑制D-Gal所致的氧化損傷，從而起到延緩大鼠衰老的作用。Liu Huan[8]、Li Yuxian[9]和Jiang Yan[10]等也證實(shí)，桑葚提取物對(duì)氧化應(yīng)激大鼠損傷有較好的改善作用。

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，能清除衰老血細(xì)胞、細(xì)菌和異物，還可分泌多種免疫因子，在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[20]。脾指數(shù)是代表脾臟形態(tài)大小的重要指標(biāo)，其值大小與功能之間有著密切聯(lián)系，多種疾病均可引起脾臟大小的變化，如感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病及免疫性疾病等[21]。因此，脾臟指數(shù)的測(cè)定對(duì)于氧化損傷和抗氧化的評(píng)估有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中，衰老陰性對(duì)照組大鼠的脾臟指數(shù)顯著下降，桑葚濃縮汁低、中、高劑量組大鼠的脾臟指數(shù)均有不同程度的增加，其中以高劑量組效果最好，已達(dá)到正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的水平，提示桑葚濃縮汁可緩解脾細(xì)胞衰老，保護(hù)脾臟的組織結(jié)構(gòu)和功能，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力。

炎癥細(xì)胞因子主要包括促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10等，這些細(xì)胞因子的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能在脾臟免疫功能中發(fā)揮著重要的作用[22]。促炎與抗炎網(wǎng)絡(luò)失衡可影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使免疫功能紊亂甚至低下，導(dǎo)致炎性衰老，從而引發(fā)多種衰老相關(guān)性疾病[23]，如動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森病、心臟病等[24]。研究表明，促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等水平升高會(huì)使機(jī)體維持高促炎癥反應(yīng)狀態(tài)，當(dāng)組織器官長(zhǎng)時(shí)間處于這種炎性環(huán)境中時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致衰老及與衰老相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生[25-26]。本實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組D-Gal大鼠的促炎因子TNF-α、IL-6水平較正常對(duì)照組明顯升高，桑葚濃縮汁處理后的大鼠，兩者表達(dá)水平都有所下降，提示桑葚濃縮汁可抑制促炎因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中含有半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[27]，包含兩大家族：起始Caspase和執(zhí)行Caspase，兩大蛋白家族通過(guò)內(nèi)外多種因子的復(fù)雜作用被激活，經(jīng)過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)使細(xì)胞解體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]。Caspase-9是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)性蛋白酶，位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，可在外來(lái)蛋白輔助因子的作用下被切割激活，通過(guò)自我活化再激活其下游的Caspase-3，它可通過(guò)裂解特異性底物使細(xì)胞凋亡得以完成[29]。本實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)均有明顯增高，說(shuō)明D-Gal誘導(dǎo)大鼠氧化損傷后存在細(xì)胞凋亡，桑葚濃縮汁處理后，兩者的表達(dá)均有降低，特別是中、高劑量組2種蛋白的表達(dá)都明顯降低，這表明桑葚濃縮汁可通過(guò)抑制凋亡級(jí)聯(lián)通路中Caspase-9、Caspase-3活性的表達(dá)，減少脾細(xì)胞凋亡，從而減輕D-Gal所致大鼠脾臟的氧化損傷。脾臟HE染色實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，桑甚濃縮汁處理組大鼠脾臟病變有明顯改善，白髓淋巴小結(jié)均有不同程度的增加，生發(fā)中心明顯，脾竇和脾索結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，提示桑葚濃縮汁可提高大鼠脾臟的免疫功能。李海杰[30]和Gor?ca[31]等也發(fā)現(xiàn)具有抗氧化功效的物質(zhì)可改善大鼠脾臟組織形態(tài)及其衰老的變化。

桑葚具有廣泛的生理功能，如清除自由基、抗癌作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗高脂血癥[32-33]。江巖等[34]通過(guò)測(cè)定藥桑葚花青素烷基自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力，分析了其體外抗氧化作用，并與白桑葚、黑桑葚花青素的體外抗氧化作用進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑葚清除自由基能力與花青素含量呈正相關(guān)。Bao Tao等[35]用高效液相色譜法和質(zhì)譜分析了桑葚中多酚成分主要有矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、蘆丁和槲皮素，而且桑葚的抗氧化活性與其含有的酚類物質(zhì)密切相關(guān)。可見(jiàn)，桑葚含有總酚、黃酮、東莨菪素、花青素多種抗氧化成分，本研究中桑葚濃縮汁之所以能夠?qū)-Gal所致衰老大鼠脾臟有保護(hù)作用，可能是由于桑葚各種不同的抗氧化成分之間存在相互補(bǔ)充、互相協(xié)調(diào)的關(guān)系，在體內(nèi)通過(guò)作用于抗氧化和氧化酶系統(tǒng)，降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，影響Caspase家族基因表達(dá)等多種途徑聯(lián)合發(fā)揮抗氧化、防衰老作用。

綜上所述，桑葚濃縮汁可以減輕大鼠脾臟的氧化損傷，具體表現(xiàn)為增加抗氧化酶T-SOD、GSH-Px、CAT的活力，降低MDA含量及TNF-α、IL-6水平，減少Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)，明顯提高脾臟指數(shù)。此外，組織病理學(xué)切片也證實(shí)桑葚濃縮汁可以改善D-Gal誘導(dǎo)的大鼠脾臟損傷，對(duì)增強(qiáng)免疫力、緩解機(jī)體衰老有良好的促進(jìn)作用。

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Protective Effect of Mulberry Juice Concentrate on D-Galactose-Induced Oxidative Damage in Spleen of Rats

LIU Yafei1, PENG Xinyan1,*, HE Hongjun2, JIN Chengwu1, SU Shufei1, YANG Xiaoshuai1
(1. College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China;2. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China)

The intention of this study was to explore the protective effect of mulberry juice concentrate (MJC) on D-galactose-induced damage in the rat spleen. A rat model of aging was induced by D-galactose. Wistar rats were randomly divided into 6 groups: normal control, model, positive control (VE), and low-, medium- and high-dose MJC treatment groups. The activities of total superoxide dismutase (T-SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT), and malondialdehyde (MDA) level of spleen homogenate were measured by using test kit. The levels of tumour necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum were determined; the spleen index and the expression levels of caspase-9 and caspase-3 were measured as well. Moreover, histomorphological examination was performed to evaluate the effect of MJC on oxidative damage in the rat spleen. The results showed that compared to the model group, the medium- and high-dose MJC groups could improve the activity of T-SOD, GSH-Px and CAT in spleen tissue (P ＜ 0.05). MJC at all three doses decreased MDA level (P ＜ 0.05) and TNF-α and IL-6 expression levels, and increased spleen index. High-dose MJC could signif i cantly increased T-SOD, GSH-Px and CAT activity to 113.22, 90.17 and 7.67 U/mg protein, decreased MDA level to 13.59 nmol/mg, and enhanced spleen index to 4.12 mg/g compared to the model group, all of which reached the levels of the normal control group and positive control group (P ＞ 0.05). In addition, the expression levels of TNF-α and IL-6 in thehigh-dose group were decreased to 56.95 and 76.83 pg/mL. The results of immunohistochemistry showed that the expression of caspase-9 and caspase-3 was attenuated by MJC at all doses, and the best effect was found at high dose. Hematoxylin and eosin staining also indicated that MJC could protect spleen structure, increase the number of lymphocytes and improve hyperemia. These results showed that mulberry juice concentrate has a signif i cant protective effect on oxidative damage in the spleen of rats.

mulberry juice concentrate; D-galactose; oxidative damage; spleen

10.7506/spkx1002-6630-201801029

TS201.4

A

1002-6630（2018）01-0192-08

劉亞飛, 彭新顏, 賀紅軍, 等. 桑葚濃縮汁對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷大鼠脾臟的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1):192-199.

10.7506/spkx1002-6630-201801029. http://www.spkx.net.cn

LIU Yafei, PENG Xinyan, HE Hongjun, et al. Protective effect of mulberry juice concentrate on D-galactose-induced oxidative damage in spleen of rats[J]. Food Science, 2018, 39(1): 192-199. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801029. http://www.spkx.net.cn

2017-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401491）；城新創(chuàng)新獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

劉亞飛（1994—），女，本科生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物功能因子。E-mail：1633212456@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：彭新顏（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物功能因子。E-mail：pengxinyan2006@163.com