不同作物品種耐鋁毒基因型篩選試驗

邢承華++劉仲書++蔣紅英

摘要 采用營養液培養的方法，對水稻23個品種、大豆14個品種和苜蓿12個品種進行了耐鋁性篩選試驗，并對各品種的耐鋁性進行了評價和對各個品種根部和株高生長狀況進行了比較，得出耐鋁性和鋁敏感性品種。結果表明，耐鋁基因型具有植株相對生物量較高、種子根相對伸長率、蘇木精著色程度較低的共同特點。種子根相對伸長率、蘇木精染色指數與植株的耐鋁性具有顯著的相關性。鋁脅迫下耐鋁性不同的典型植物的根系形態具有明顯差異，耐鋁基因型明顯優于鋁敏感基因型。

關鍵詞 水稻；苜蓿；大豆；品種；耐鋁性評價；根系形態

中圖分類號 S511；S557.1；S565.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）17-0034-05

Abstract Using nutrition training methods，Al-tolerance test of 23 rice varieties，14 soybean varieties and 12 alfalfa varieties were did to evaluate the various species of Al-tolerance and contraste their root growth and plant height.The results showed that the Al-tolerant lines had lower hexnatoxylin dye index，higher RSRL and higher relative biomass in comparison with Al-sensitive lines.There were significant correlations between the relative seminal root length（RSRL），hematoxylin dye index，aril the Al-tolerance of the plant. There were significant difference of morphological and anatomical characteristics different patterns typical of the root system，Al-tolerant genotypes were distinctly better than Al-sensitive ones.

Key words rice；alfalfa；soybean；varieties；Al-tolerance estimation；root morphological

據估計，酸性土壤占世界可耕地的40%，主要分布在發展中國家集中的熱帶和亞熱帶。我國酸性土壤遍及南方15個省（區），總面積達2 030萬km2。在酸性土壤上影響作物生長的因素包括金屬陽離子濃度的降低和吸收的抑制（Mg、Ca、K的缺乏）、氫離子、鋁毒、錳毒、磷和鋁可溶性的降低、水分缺乏和淋溶作用增強（養分缺乏）。而鋁毒被認為是限制酸性上壤上作物生長的主要因素。鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素。在大多數情況下，土壤中的鋁是無毒性的。然而，在酸性土壤條件下，對大多數植物都會產生毒害作用。鋁對生物體顯示出特殊的毒性是與鋁存在的化學形態緊密相連的。一般認為，配合態鋁和固定態的鋁（稱低活性鋁）對植物和環境沒有毒害，只有離子態的鋁（僅需在微摩爾濃度下）才對環境和植物產生影響。其中，無機離子態鋁如Al3+和Al（OH）2+（稱高活性鋁）對植物根系的毒害作用最大，有機和無機鋁化復合物如Al（OH）3、Al（OH）4-、磷酸鋁復合體、氧化鋁復合體、有機酸鋁等，其毒性較小。許多人也注意到，環境中鋁的形態對植物根的吸收有很大影響。當含鋁的溶液與強堿發生中和反應時溶液中會產生有劇毒的Al3+聚合物。因此，研究植物耐鋁毒的機制已成為生物科學界一項重要而熱門的問題。

目前有關植物耐鋁毒的機理已有報道[1]，其尤其在酸雨降沉頻率較高、人們長期施用酸性化肥的地區，土壤中與氧和硅結合的鋁易轉變為有毒的離子態Al3+ [2]，且Al3+很容易在土壤中發生遷移，造成大面積土壤酸化[3]。鋁通常是以難溶性硅酸鹽或氧化鋁的形式存在，對植物沒有毒害[4]，但pH<5時，這些難溶性的物質溶解，可溶性的鋁（主要是Al3+）對大多數植物都會產生毒害[5]。鋁毒的最初癥狀是抑制根系伸長，影響植株的物質和能量代謝[6]。重復施用含鋁量較高的等化學肥料，可以導致土壤鋁積累，土壤被鋁污染后可引起作物尤其是植物體內鋁的積累。稻米、大豆作為人類食物的直接來源，是人體攝入鋁的主要途徑，高含鋁量的稻米、大豆或者苜蓿通過食物鏈會嚴重危害人體健康，引起中毒或老年癡呆癥等癥狀。隨著我國經濟的不斷發展，污水灌溉、污泥、農藥及肥料的施用等導致土壤重金屬污染日趨嚴重，解決植物的污染問題迫在眉睫。鋁的污染也不例外。鋁的積累性很高，受鋁毒害的人越來越多，攝入過多的鋁會破壞某些酶的活性，引起消化功能紊亂，破壞正常鈣磷比。在鋁污染土壤上通過適當的方法限制鋁從土壤進入植物根系、控制植物對鋁的吸收是十分必要的。本課題主要研究同一植物種類不同品種間的耐鋁能力存在明顯的基因型差異。

本課題以苜蓿、大豆、水稻的多個品種為材料，研究其在生長過程中受鋁的脅迫導致生理形態的變化情況，以及受鋁脅迫后植物根尖鋁的含量，并選出同類植物中耐鋁能力較好的植物品種，為有效解決酸性土壤中的鋁毒害提供有效途徑，并為后續的通過轉基因技術培育耐鋁品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試作物品種及來源

試驗中共篩選23個水稻品種、12個苜蓿品種、14個大豆品種。

供試水稻品種：Ⅱ優92、菲優多系1號、Ⅱ優838、德龍2000、Ⅱ優3027、富優1號、Ⅱ優2070、協優92、Ⅱ優6216、Ⅱ優8220、明優98、Ⅱ優46、協優9019、Ⅱ優63、協優982、協優9308、金優987、e富豐優11、紅良優166、協優63、Ⅱ優8006、Ⅱ航優148、協優46。

供試苜蓿品種：阿爾岡金、巨人201、金皇后、WL-323HQ、WL-525HQ、周產紫花苜蓿、皇冠、飛馬、馴虎、WL-232HQ、胖多、獵人河。

供試大豆品種：矮腳青8901、引豆9707、春豐早、臺灣毛豆、日本青、科源1號、遼新1號、科源3號、028-289、浙秋2號、0290-236、029-15、029-238、029-290。水稻和大豆從金華種子公司購買，苜蓿從北京種子公司購買。

1.2 育苗培養與處理

種子用1%次氯酸鈉浸泡消毒30 min后，蒸餾水清洗6次，每次清洗5 min，以除去漂浮、膨脹、軟化和被污染的種子，然后在蒸餾水中浸泡（苜蓿24 h、大豆4 h、水稻24 h），將種子轉入培養皿內，倒掉蒸餾水，但要使種子保持濕潤，讓種子繼續催芽。待種子根長長到1 cm左右時，繼續使種子生長，待種子根長長到2 cm左右時，可以將其移入盆中對照培養。本試驗是在浙江師范大學的實驗室培養箱中培養，水稻、苜蓿、大豆的培養條件都有所不同。其中水稻的培養條件為白天14 h、30 ℃，夜間10 h、25 ℃，濕度為70%，苜蓿的培養條件為白天14 h、25 ℃，夜間10 h、20 ℃，濕度為70%，而大豆的培養條件為黑夜24 h、25 ℃，濕度為70%。選取根長相近的幼苗在外面包有2層黑色塑料薄膜的盆中進行隔離培養處理，盆內培養24株幼苗，溶液體積為1 L，在盆上放一泡沫，在每個泡沫上打24個洞，每個洞內移植1株幼苗。對照組的溶液氯化鈣的濃度為0.5 mmol/L，而試驗組的溶液氯化鋁的濃度和氯化鈣的濃度分別為0.05 mmol/L和0.5 mmol/L。所有溶液的pH值用HCl調到4.5（由于苜蓿本身營養不是很豐富，故苜蓿用營養液培養，其中試驗組要另外加氯化鋁，營養液中氯化鋁的含量為0.05 mmol/L）。營養液配制如表1、2所示。

1.3 測定內容與方法

1.3.1 植株生長量測定。植株生長2 d后測定對照組和Al處理的試驗組植株的株高和根長度變化，以及株高、根長的增加量。并計算相對根伸長量和相對株高伸長量。根系相對伸長量可用于估計耐鋁的基因型差異。計算方法如下：

根相對伸長量（%）=試驗組的根伸長量/對照組的根伸長量×100；

株高相對伸長量（%）=試驗組的株高伸長量/對照組得株高伸長量×100；

相對Al含量（%）=試驗組的OD值/對照組OD值×100。

1.3.2 根尖相對鋁含量的測定。經過培養48 h后，試驗組用氯化鈣溶液沖洗，去除植物根部表面上的Al，再用蒸餾水清洗，對照組直接清洗，洗后切下2 cm的根尖，用0.5 mmol/L 0.2%的蘇木精和0.02%的KIO3混合液染色15 min，用蒸餾水洗脫15 min，對照組和試驗組的根各分3組（每組8根），經3 mL 1 mol/L的HCl脫色1 h后，用UV-7504紫外可見分光光度計在490 nm下測植物根尖的分光光度值（這步非常重要，也是估計耐鋁的基因型差異的關鍵一步）。

2 結果與分析

2.1 對水稻幼苗根長和株高及根尖相對鋁含量的影響

水稻幼苗經50 μmol/L的鋁處理后，鋁對水稻株高、根長的影響不同。在Al濃度為50 μmol/L時，對水稻幼苗株高和根長都有影響。對根長的抑制作用則更大（圖1）。孔繁翔等[7]、郝魯寧等[8]認為，鋁對植物毒害作用最明顯的特征是抑制了根尖細胞伸長和細胞分裂，根比地上部分對鋁更敏感。本試驗也反映低濃度鋁處理時，水稻幼苗受鋁的影響，根較植株受鋁的影響要更顯著，鋁對根有較大的抑制。然而有極少數品種在低濃度下，株高呈現刺激植物的生長。秦瑞君等[9]指出，少量鋁的存在可刺激植物的生長。本試驗也證實了這一觀點（圖2）。

由圖1可知，富優1號、Ⅱ優63、協優9308和紅良優166這幾個品種的根相對伸長率比較低，說明這幾個品種受Al的影響比較大，受Al毒的抑制造成的，而根相對伸長率比較高的品種則是菲優多系1號和Ⅱ優838，說明這2個品種受Al毒的影響比較小，這也正是本試驗篩選所要的品種。通過Spass分析可知，水稻各品種的根相對伸長率存在顯著性差異。

由圖2可知，株高相對的伸長率基本都在60%以上波動，只有Ⅱ優3027、富優1號品種的株高受Al毒的影響比較大，而Ⅱ優8220、明優98和Ⅱ優8006的株高相對伸長率則出現大于100%，可能是由于低濃度的Al反而刺激了株高的伸長。結合圖1和圖2可知，富優1號受Al毒的影響很大，對其株高和根的抑制都很大，該水稻品種則不適于在酸性土壤種植，且該水稻品種中的Al含量可能大于其他品種的水稻。

試驗對23個水稻品種的根部染色，測得它們的相對Al含量，如圖3所示。菲優多系1號、Ⅱ優838、協優92、Ⅱ優6216、明優98、協優9019這5個品種的相對Al含量最小，說明它們根尖的鋁含量較低，是比較耐鋁的品種，而富優1號、Ⅱ優46、協優9308和e富豐優11的相對Al含量較大，則說明試驗的較對照的易吸收鋁，試驗較對照根尖的鋁含量多，因此它們是不耐鋁的品種，即不是所要選擇的品種。富優1號、Ⅱ優46、協優9308和e富豐優11的相對Al含量都是Ⅱ優838的4倍左右，因此這2個品種水稻不適于種植在酸性的土壤中，農民盡量不要種這種水稻，因為這種水稻含有很多的鋁，對人的身體有害，長時間食用鋁導致其在人身體內積累，也許會破壞人體的內分泌系統，損傷神經，甚至會導致老年癡呆癥。結合圖1、圖2和圖3所得出的結論，可知菲優多系1號、Ⅱ優838是所有篩選品種中耐鋁性最好的，這為廣大的農民種植何種水稻提供了有效的參考。通過Spass分析可知，水稻各品種的株高相對伸長率和根尖的相對Al含量存在顯著性差異。

2.2 對苜蓿幼苗根長和株高及根尖相對鋁含量的影響

苜蓿幼苗經過處理后各個品種對照和試驗的根長都有一定的抑制作用，但抑制作用不是很大且這種影響相比水稻來說要小一點，這說明Al毒對苜蓿的影響不太強，表明苜蓿是一種耐鋁性較強的植物。因此，應該大力推廣這種植物作為動物的飼料。由圖4可知，12個苜蓿品種除了阿爾岡金和巨人201之外，其他品種的根相對伸長率都在60%以上，其中金皇后、WL-323HQ、馴虎、WL-232HQ、胖多、獵人河這幾個品種根相對伸長率都在80%以上，受Al毒的影響比較小，而阿爾岡金和巨人201受Al毒的影響比較大都在50%以下，這2個品種在酸性土壤中則根部含有的Al含量較多，對動物來說食用這種植物對它們的身體是有害的，另外通過食物鏈的作用對人類也是有一定影響的。因此，應該大力發展金皇后、WL-323HQ、馴虎、WL-232HQ、胖多、獵人河等這些耐鋁的苜蓿品種。通過分析可知，苜蓿各品種的根相對伸長率存在顯著性差異。

苜蓿的株高受Al毒的影響相比根受Al毒的影響來說還要小，一方面說明苜蓿是耐鋁的，另一方面更說明Al毒對植物的作用主要體現在植物的根部，而不是地上部分，對地上部分的影響很小。由圖5可知，所有苜蓿品種的株高相對伸長率都在70%以上，WL-323HQ、皇冠和獵人河3個品種株高相對伸長率都接近100%，說明Al對這3個品種的株高幾乎沒有影響，此外金皇后的株高相對伸長率也在90%以上，受Al的影響也十分小。結合圖4和圖5可知，金皇后、WL-323HQ和獵人河這3個品種最優，一是因為它們的相對根伸長率都比較高，受鋁的影響小；二是因為它們的株高相對伸長率也都在90%以上，受鋁的影響十分小，再加上因為株高的大小就是這種植物提供給動物食物的多少，結合這幾點可認為金皇后、WL-323HQ和獵人河這3個品種是最優的，是耐鋁性品種。另外，通過對相對Al含量的測定來進一步確認耐鋁性苜蓿品種。通過分析可知，苜蓿各品種的株高相對伸長率存在顯著性差異。

苜蓿的株高受Al毒的影響相比根受Al毒的影響來說還要小，一方面說明苜蓿是耐鋁的，另一方面說明Al毒對植物的作用主要體現在植物根部，而不是地上部分，對地上部分的影響很小（圖5）。

由圖6可知，金皇后的相對Al含量最小，接近100%，也就是說對照和試驗的金皇后根尖吸收的鋁含量相差不多，WL-323HQ次之，相對Al含量最大的是巨人201，為330%左右，是金皇后的3倍多、WL-323HQ的2倍多。大部分品種的相對Al含量范圍在150%左右。由圖4、圖5、圖6可知，最耐鋁的苜蓿品種是金皇后和WL-323HQ，敏感性品種是巨人201。通過分析可知，苜蓿各品種的相對Al含量存在顯著性差異。

2.3 對大豆幼苗根長和株高及根尖相對鋁含量的影響

本試驗結果表明，經過鋁處理的大豆的根長要明顯矮于未經過鋁處理的大豆，而且經過鋁處理后的大豆的根部都呈現一定的紅色，可見鋁毒能夠抑制大豆根部的生長，影響大豆植株對營養成分的吸收。大豆的根相對伸長率基本分布在70%以下，這說明鋁毒對大豆根部的影響還是比較大的，根部受影響最大的品種是遼新1號，根相對伸長率在40%以下，相對影響最小的品種是029-236，它的根相對伸長率在75%左右，大約是遼新1號根相對伸長率的2倍，其次是029-15、029-238、029-290和矮腳青，它們的根相對伸長率也都在65%左右。因此，在這些大豆品種中根部比較耐鋁的品種是029-236、029-15、029-238、029-290和矮腳青（圖7）。大豆根系迅速吸收和積累A1但地上部分鋁累積并沒有明顯的變化，受鋁毒的影響和地上部分相差很大，它們的相對株高伸長率基本上都在80%以上（圖8），其中臺灣毛豆、科源1號、科源3號和029-289的株高相對伸長率都接近100%，幾乎不受任何影響，日本青和遼新1號也都在90%以上，影響最大的是春豐早、029-15、029-238和029-290，也都在75%以上。大豆株高相對伸長率都比較接近，相差不多，差距最大的是臺灣毛豆和029-15，相差25%以上，株高相對伸長率相對根長的伸長率的波動要小得多，可見鋁毒對株高的影響相比根要小得多。大豆的根部是吸收鋁毒的主要部位。從植物的株高來看，臺灣毛豆、科源1號、科源3號和029-289這4個品種最好，日本青和遼新1號2個品種次之，株高相對伸長率較好的是029-15、029-238和029-290。在綜合考慮中要把大豆根相對伸長率因素放在第1位。通過分析，大豆各品種的根相對伸長率和株高相對伸長率存在顯著性差異。

大豆品種受鋁毒的影響和水稻、苜蓿基本相同，都是根部的鋁含量明顯大于地上部分。根部是植物吸收營養最主要的部位，植物根部的鋁含量多少對植物的影響很大。在篩選的大豆品種中，相對Al含量最少的品種是遼新1號，僅為130%左右，較大的品種是引豆9701和春豐早，分別為500%和400%以上，分別是遼新1號的4倍、3倍左右。除遼新1號外，029-289、浙秋2號和029-15也都在250%以下，029-238和029-290較大，它們的相對Al含量在350%左右，相對Al含量越大，說明根部鋁含量越大，越不耐鋁，反之則越耐鋁。引豆9701和春豐早的根部相對Al含量最大，029-289、浙秋2號、029-15和029-290較小，遼新1號最小（圖9）。綜上考慮，結合圖7和圖8可知，029-15是耐鋁品種，是試驗最終所要的品種。敏感性品種是春豐早。通過Spass分析，大豆各品種的相對Al含量存在顯著性差異。

3 結論與討論

本試驗結果表明，在50 μmol/L的鋁溶液處理下，鋁毒被植物根部吸收明顯大于地上部分的吸收，根據各個品種對鋁毒的吸收情況，來篩選出耐鋁性好的品種，對提高它們的質量起到了非常重要的參考價值。鋁離子是酸性土壤上作物生長最主要的限制因子[10]。不同的作物、同一作物的不同品種間，其耐鋁性可能存在差異。在玉米、大豆、水稻、大麥、小麥、苜蓿、馬鈴薯、番茄等作物中都觀察到耐鋁性的基因型差異[11-12]，在本試驗中也發現，不同品種的水稻、苜蓿和大豆對鋁的耐性具有基因型差異[13-14]。肉眼可見的鋁毒癥狀包括根伸長生長的抑制[15]、根尖膨大[16]、表皮脫落[17]等。由于根尖比成熟的根部組織積累更多的鋁，因此根尖被認為是鋁毒的最初作用部位[18-19]。在含鋁營養液中。種子根凈增長度和種子根相對伸長長率可用于玉米耐鋁性的早期鑒定[20-11]。蘇木精染色廣泛用于細胞遺傳研究，也可用少水稻、苜蓿和大豆早期無損傷性的耐鋁性鑒定[21-22]。本文研究結果顯示，所用篩選材料對鋁脅迫的反應具有基因型差異。耐鋁基因型具有植株相對生物量較高、根系生長受抑制程度相對較低和的蘇木精著色程度較低等共同特點。

根部性狀作為耐鋁性的評價指標為大量研究所采用。測定溶液培養中根長（主根）對Al3+的反應已成為植物耐鋁性鑒定的通用方法。Magnavaca研究認為，在營養液培養中，采用根長法評價玉米自交系耐鋁性的最佳鋁濃度為6 mg/L，目前已發展成為熱帶玉米種質耐鋁性篩選的有效方法，且與其他篩選技術具有很好的相關性[11]。在本試驗中0.05 mmol/L Al3+為適宜的鋁處理濃度。在這種脅迫條件下，種子根凈增長度（NSRL）和相對伸長率（RSRL）變幅較大。本文將水稻、苜蓿和大豆種子根相對伸長率（RSRL）定義為鋁脅迫與對照的種子根凈增長之比，由于考慮了各品種根系生長的自身特性，因此較種子根凈增長度（RSRL）更適宜于耐鋁性的評價。在本研究中RSRL與植株地上部及整株相對生物量之間相關顯著，各品種的耐鋁性評價結果與以前土培試驗中的耐酸性篩選結果[13]基木一致。而RSRL與植株相對生物量相關不顯著，這與Magnavaca等的研究結果一致，他們的分析表明，在鋁（0.185 mmol/L，Al3+）處理條件下，最初（鋁處理前）種子根長（RSRL）與NSRL存在極顯著的相關關系，但與RSRL相關不顯著[19]。因此，測定RSRL可作為一種快速簡便、準確可靠的耐鋁性鑒定方法。關于高等植物鋁毒的機理目前知之甚少，許多方面尚停留在假說階段[23-24]。一般認為，鋁毒癥狀是由于Al3+與根尖的相互作用導致根的發育被抑制所引起的。Morinmla等[19]用1 mol/L AlCl3處理洋蔥根尖，2 h后即可觀察到細胞分裂受阻，8 h后細胞分裂完全停止。本研究結果顯示，鋁處理2 d后，根尖明顯膨大，根系表皮脫落，而耐鋁基因型根系受抑制程度則明顯較輕。李德華、賀立源等研究發現，耐鋁品種在鋁處理3 d后的根尖有膠狀物質，估計這是植物耐鋁的機制之一。也許附著在植物根尖上膠狀物質可與上壤中的鋁結合，減少根尖對鋁的接觸機會[25]。研究發現，有膠狀物質附著的根經過鋁處理后分別測定保留和除去膠狀物質的根尖含鋁量，結果前者大于后者。這說明根系分泌的膠狀物質可以和鋁結合[26]。

根際環境中鋁的生態化學行為、根系分泌物和微生物的生態毒理效應受多種因素影響，且這此因素之間又相互影響、相互制約。本試驗沒有對這些進行深入研究。隨著學科的發展以及研究技術手段的進步，可望從宏觀向微觀乃至分子、基因水平在以下幾方面開展深入研究：一是完善根系分泌物的收集、分離和鑒定技術，建立根系分泌物原位收集方法。二是運用生物工程技術，揭開鋁脅迫對植物根細胞膜酶活性的變化規律，耐鋁酶活性與根系分泌物種類和濃度之間的關系，根尖釋放的分泌物與根尖細胞膜選擇透性之間的關系，酶在根系分泌物與鋁絡合反應中的催化機理等。三是運用基因工程技術，加強植物抗鋁基因反應機制以及植物遭受鋁毒時基因組變化的研究，積極運用抗鋁基因的定位克隆和轉基因等技術選育抗鋁性強的植物新品種。

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