美洲大蠊提取物對肝癌皮下移植瘤裸鼠自噬和侵襲轉移的影響

張雪莎 ，周 杰 ，李彩琳 ，吳定宇 ，彭 芳

（1）大理大學藥學院，云南 大理 671000;2）云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000）

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍內發病率和死亡率均較高。據統計，我國肝癌死亡率居于亞洲國家首位[1]。目前，臨床上治療肝癌的手段通常有手術治療、肝癌消融治療、外放射治療和藥物治療等[2]，其中使用化療藥物治療是一種較常規的治療方式，但目前臨床上使用的多數化療藥物易誘導腫瘤細胞產生耐藥，甚至使腫瘤細胞具有多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）[3]。因此探索藥物對耐藥腫瘤細胞的作用及機制成為治療癌癥的研究熱點。

細胞自噬是一種依賴溶酶體的自我降解過程，有研究認為腫瘤細胞的自噬可促進癌癥的生長和生存[4]。對于耐藥腫瘤細胞，還可通過侵襲轉移途徑促進癌細胞的生存和擴散，這也是癌癥難以治愈的一個原因。中藥具有多靶點、多層次、低毒等優點，對腫瘤細胞及耐藥腫瘤細胞療效較佳。美洲大蠊作為一種動物中藥，具有修復肝損傷、抗腫瘤等作用，尤其對肝癌具有較好的療效，可逆轉肝癌多藥耐藥。但美洲大蠊提取物對肝臟腫瘤細胞的自噬和侵襲轉移的研究尚未見報道。故本文以裸鼠為實驗對象，給予CII-3 和脫脂膏進行干預，并以索拉菲尼為陽性對照，探討美洲大蠊提取物CII-3 與脫脂膏對肝癌細胞及肝癌耐藥細胞自噬和侵襲轉移力的影響。

開始采用適應性牽引，初始重量為頭顱、雙側股骨髁上各2 kg，若患者無不適，牽引重量可逐日增加，一般為頭顱、雙側股骨髁上每日各增加2 kg，最大重量可達體重的1/3～1/2，牽引過程中密切觀察神經功能［6，7］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌雄各半的標準體重的SPF 級Balb/c-nude裸鼠[動物合格證號：430727200101104518，許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。本實驗已經大理大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和設備

美洲大蠊提取物脫脂膏，系褐色粘稠糕狀，得率約為75.18%，批號為P14805-20171023，由美洲大蠊干燥蟲體的醇提物制備的浸膏制得。美洲大蠊脫脂膏進一步純化的粗提物CII-3 為黃褐色凍干粉末，得率約為0.2%，批號為17102125，以上2 種均由大理大學昆蟲生物醫藥研究院張成桂博士提供；5-氟尿嘧啶（5-Pentafluorouracil，5-FU）（批號WXBC0190V），購自美國 Sigma 公司；索拉非尼（批號819C021），購自北京索萊寶科技有限公司；谷草轉氨酶測試盒（AST）（批號20201112），谷丙轉氨酶測試盒（ALT）（批號20201113），肌酐測試盒（CRE）（批號20201109），尿素氮測試盒（BUN）（批號20201120），均購自南京建成生物科技有限公司；全波長酶標儀由Bio-Teck 公司生產；激光共聚焦顯微鏡由徠卡公司生產；人肝細胞癌敏感細胞株BEL-7402，耐5-FU人肝細胞癌細胞株BEL-7402/5-FU，生產批號均為MXC050，均由上海美軒生物科技有限公司提供。

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1.3 移植瘤模型的建立[5]

取密度為8×107的BEL-7402 或BEL-7402/5-FU 細胞懸液，用100 μL 的 PBS 和 Matrigel 基質膠包裹好后，接種于裸鼠左前肢腋下。敏感組接種BEL-7402 為肝癌敏感細胞模型，其他組均接種BEL-7402/5-FU 為耐藥肝癌細胞模型，接種第5 天開始，每2 d 1 次分別測量并記錄裸鼠腋下腫瘤長短徑。

采用SPSS 17.0 軟件處理數據，正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，單因素方差分析有意義后各組兩兩比較采用q檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

1.4 動物分組、給藥與取材[6]

隨著人們對環保意識的增強以及國家政策的要求、移動破碎篩分設備在城市建筑垃圾、礦山等方面應用越來越廣泛。

1.5 裸鼠生化指標檢測[7]

按照試劑盒要求測定各組血清中AST、ALT、CR、BUN 等生化指標。

1.6 裸鼠的臟器指數和抑瘤率的檢測[8]

將肝臟和腫瘤組織常規處理，分別進行石蠟包埋、切片、染色、封片，并于光學顯微鏡下觀察病理組織變化。

作者是科學研究的主體，通過對發文作者及其合作網絡的結構特征進行分析，可以反映該領域研究的核心作者群及合作關系。本文將獲取的文獻數據導入CiteSpace V中，選擇網絡節點(node types)為Author，以關鍵路徑(pathfinder)算法，數據抽取對象為Top50，設置時間區間(time slicing)的值為1，生成了作者共引聚類知識圖譜(如圖3)。

1.7 肝臟和腫瘤組織病理學檢測[10]

臟器指數=臟器重量（mg）/動物體重（g）。

1.8 腫瘤組織中自噬和侵襲轉移相關mRNA 的檢測[11]

CII-3 組心臟指數高于空白組、敏感組和耐藥組（P<0.05）。與空白組、敏感組、耐藥組相比，索拉菲尼組提升肝臟指數，CII-3 組和脫脂膏組則降低肝臟指數。各藥物處理組均升高脾臟指數，尤其是CII-3 組。脫脂膏組心臟指數較索拉菲尼組高（P<0.05），其他組變化不明顯。各組對肺臟指數影響，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表1 自噬相關因子引物序列表Tab.1 Primers sequence of autophagy related factors

表2 侵襲轉移相關因子引物序列表Tab.2 Primer sequence of invasion and metastasis related factors

1.9 統計學處理

梯度氣象觀測站是一個低層大氣綜合探測系統，集多層、多參量觀測系統于一體，實現一定高度內的風溫梯度信號參量的綜合自動觀測。氣象數據為研究大氣污染、大氣邊界層物理提供高質量的觀測資料，同時提升公共氣象服務能力、提高氣象預報預測準確率也起著重要作用。

取未接種腫瘤細胞的裸鼠作為空白組；接種BEL-7402 并造模成功的裸鼠為敏感組；接種BEL-7402/5-FU 并造模成功的裸鼠隨機分為30 mg/kg 索拉菲尼組、200 mg/kgCII-3 組和200 mg/kg 脫脂膏組，每組12 只。在接種后的第8 天分別按上述劑量給藥（0.1 mL/10 g），連續給藥14 d。末次給藥24 h 后，各組眼眶靜脈叢取血用于生化指標監測；剝取瘤塊以及心、肝、腎、脾等重要臟器，用于臟器指數、腫瘤體積和抑瘤率的計算、肝臟和腫瘤組織病理學檢測以及腫瘤組織相關指標的檢測。

2 結果

2.1 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠體重及腫瘤抑制的影響

前期各組裸鼠體重變化不大，CⅡ-3 組和脫脂膏組在后期有降低裸鼠體重的趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。敏感組瘤體積增長速度較快，耐藥組趨于穩定。索拉菲尼組、CII-3 組和脫脂膏組在給藥9 d 后瘤體積明顯減小。敏感組瘤重顯著高于其余4 組，耐藥組明顯高于索拉菲尼組、CII-3 組和脫脂膏組（P<0.01），索拉菲尼組、CII-3 組、脫脂膏組之間瘤重，差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

圖1 CII-3 和脫脂膏對皮下移植瘤裸鼠體重、腫瘤體積及瘤重的影響Fig.1 Effects of CII-3 and defatted ointment on body weight，tumor volume and tumor weight of nude mice with subcutaneously transplanted tumor

2.2 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠臟器指數的影響

取腫瘤組織進行常規處理后，再按照相應試劑盒操作流程進行逆轉錄（RT-PCR）反應，確定自噬和侵襲轉移相關因子引物，見表1，表2，觀察RT-PCR 反應并計算各基因的相對表達量。計算公式：

表3 CII-3 和脫脂膏對皮下移植瘤裸鼠臟器指數的影響（，n=12）Tab.3 Effects of CII-3 and defatted ointment on organ index in nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

表3 CII-3 和脫脂膏對皮下移植瘤裸鼠臟器指數的影響（，n=12）Tab.3 Effects of CII-3 and defatted ointment on organ index in nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

與空白組比較，▲P <0.05，▲▲P <0.01；與敏感組比較，*P <0.05，**P <0.01；與耐藥組比較，#P <0.05，##P <0.01；與索拉非尼組比較，△P <0.05，△△P <0.01。

2.3 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠血清生化指標的影響

與空白組相比，敏感組裸鼠的AST 升高，索拉菲尼和脫脂膏組能降低AST，CII-3 組則升高AST。對ALT 的影響，也存在索拉菲尼和脫脂膏組降低其含量，CII-3 組則升高其含量。各給藥處理組均提升CR 的含量，而各給藥組對BUN 含量影響則不明顯，見表4。

腫瘤體積=1/2（長徑×短徑×短徑），腫瘤的相對體積=每次測量計算后的腫瘤體積/接種后第4 天的體積[9]。

表4 CII-3 和脫脂膏對皮下移植瘤裸鼠生化指標的影響（，n=12）Tab.4 Effects of CII-3 and defatted ointment on biochemical indexes of nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

表4 CII-3 和脫脂膏對皮下移植瘤裸鼠生化指標的影響（，n=12）Tab.4 Effects of CII-3 and defatted ointment on biochemical indexes of nude mice with subcutaneously transplanted tumor（，n=12）

與空白組比較，▲P <0.05，▲▲P <0.01；與敏感組比較，*P <0.05，**P <0.01；與耐藥組比較，#P<0.05，##P <0.01；與索拉非尼組比較，△P <0.05，△△P <0.01。

2.4 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠肝臟組織病理學的影響

空白組肝組織細胞排列整齊、形狀規則，而敏感組和耐藥組肝組織的細胞核排列不整齊且出現皺縮現象，索拉菲尼組、CⅡ-3 組和脫脂膏組對肝損傷的改善雖有一定作用，但效果不凸顯，肝細胞排列部分仍存在不規則且多核現象，見圖2。

2.5 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠腫瘤組織病理學的影響

敏感組和耐藥組腫瘤組織呈現鵝卵石或不規則形態，索拉菲尼組腫瘤組織細胞為片狀壞死，細胞形態難以看清；CⅡ-3 組大部分細胞呈不規則形態，成片狀壞死，細胞核出現縮小甚至碎裂；脫脂膏組腫瘤細胞壞死不明顯，見圖3。

近年來，浙江省金華市人大常委會探索開展財政專項支出第三方績效評價工作，先后完成了保障性住房建設、科技創新支出等6個項目的第三方績效評價，今年又開展了農村生活污水治理、居家養老服務機構補助等4個項目的第三方績效評價，取得了良好效果。今年8月，該項工作獲評“浙江人大工作與時俱進獎”提名獎。

圖3 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠腫瘤組織病理學的影響（HE 染色）Fig.3 Effects of CII-3 and defatted ointment on tumor histopathology in nude mice with transplanted tumor（HE staining）

2.6 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠自噬相關因子mRNA 的影響

與敏感組相比，耐藥組6 個自噬相關因子（ATG5、ATG7、BECLIN、LC3B、PIK3C3、P62）均呈現高表達。與耐藥組相比，索拉菲尼組、CⅡ-3 組和脫脂膏組均能抑制上述6 個自噬相關因子的表達，見表5。

表5 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠自噬相關因子mRNA 的影響（，n=12）Tab.5 Effects of CII-3 and defatted ointment on autophagy related factor mRNA in nude mice with transplanted tumor（，n=12）

與敏感組比較，*P <0.05，**P <0.01；與耐藥組比較，#P <0.05，##P <0.01；與索拉非尼組比較，△P <0.05，△△P <0.01。

2.7 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠侵襲轉移相關因子mRNA 的影響

與敏感組相比，耐藥組5 個侵襲轉移相關因子（MMP2、MMP9、mTOR、AKT、4EBP1）均呈現高表達。與耐藥組相比，索拉菲尼組除提升4EBP1 較為明顯外，其余均降低；而CⅡ-3 組和脫脂膏組均能抑制5 個侵襲轉移相關因子的表達，見表6。

2) 污染土中Pb賦存形態的改變是改性磷礦渣和普通硅酸鹽水泥穩定土Pb變化的主要原因，普通硅酸鹽水泥可促進Pb從弱酸提取態向可還原態轉化，而改性磷礦渣可促進Pb從弱酸提取態向可氧化態轉化.

表6 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠侵襲轉移相關因子mRNA 的影響（，n=12）Tab.6 Effects of CII-3 and defatted ointment on the mRNA of invasion and metastasis related factors in nude mice with transplanted tumor（，n=12）

表6 CII-3 和脫脂膏對移植瘤裸鼠侵襲轉移相關因子mRNA 的影響（，n=12）Tab.6 Effects of CII-3 and defatted ointment on the mRNA of invasion and metastasis related factors in nude mice with transplanted tumor（，n=12）

與敏感組比較，*P <0.05，**P <0.01；與耐藥組比較，#P <0.05，##P <0.01；與索拉非尼組比較，△P <0.05，△△P <0.01。

3 討論

肝癌作為一種惡性腫瘤疾病，嚴重威脅著人民的身體健康和生命安全。化療藥由于毒性強，易產生MDR，療效不顯著等缺點限制了其在臨床上的使用。多種中藥因作用靶點多、不良反應小等優點被臨床用于腫瘤的治療[12]。美洲大蠊作為一種動物藥，自開發為藥物以來備受關注，已有大量研究表明美洲大蠊提取物可通過抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡、逆轉多藥耐藥等機制對多種癌癥組織產生抑制作用[13]。細胞自噬和侵襲轉移是腫瘤細胞的重要生命活動，許多中藥發揮抗腫瘤作用就是通過調節腫瘤細胞的自噬、侵襲轉移途徑[14]。細胞自噬的調控對肝癌的作用至今仍是國內外的研究熱點[15-16]，例如有研究報道了RNA 結合蛋白PNO1 和類固醇原件結合蛋白2SREP2 等就是通過調節肝癌細胞的自噬和侵襲轉移從而抑制細胞凋亡成為肝細胞癌的治療靶點[17-18]。此外，已有研究發現美洲大蠊提取物脫脂膏和CⅡ-3 有一定的對抗腫瘤MDR 的作用[19]，但對于CⅡ-3 和脫脂膏是否影響腫瘤的自噬和侵襲轉移則沒有深入研究。本研究通過動物實驗檢測美洲大蠊提取物對裸鼠瘤體積、臟器指數、生化指標，腫瘤細胞病理學及自噬和侵襲轉移相關因子的表達來探討脫脂膏和CⅡ-3 對肝癌耐5-氟尿嘧啶細胞（BEL-7 402/5-FU）自噬和侵襲轉移能力的影響。

3.1 CⅡ-3 和脫脂膏的抑癌作用

本研究觀察到CII-3 和脫脂膏有降低耐藥肝癌裸鼠體重趨勢，且可減少裸鼠皮下移植瘤體積和重量，表明美洲大蠊提取物CII-3 和脫脂膏可抑制耐藥性肝癌細胞的生長。此外，本研究還在鏡下觀察到敏感組和耐藥組腫瘤細胞呈鵝卵石或不規則形態，而索拉菲尼組和CII-3 組腫瘤細胞呈片狀壞死，表明CII-3 與抗肝癌藥物索拉菲尼均對腫瘤細胞有殺傷作用，這進一步證明了CII-3 具有抗腫瘤及抗腫瘤耐藥效果。而脫脂膏組腫瘤細胞片狀壞死情況不夠明顯，說明了美洲大蠊提取物CII-3 的抗腫瘤及抗腫瘤耐藥的效果比脫脂膏更佳。先前的研究也證明了脫脂膏和CⅡ-3可逆轉人肝癌細胞HepG2/ADM 細胞的多藥耐藥性，且CⅡ-3 的效果優于脫脂膏[20]。

3.2 CⅡ-3 和脫脂膏引起肝腎損傷

雖然先前大多研究認為美洲大蠊提取物可改善肝功能，減輕肝纖維化[21-22]，但本研究發現裸鼠接種肝癌敏感細胞和耐藥細胞后會對肝臟組織產生一定影響，誘發肝損傷，且索拉菲尼、美洲大蠊提取物CII-3 均不能有效改善這種損傷。提示我們還應進一步加強對CII-3 在抗腫瘤方面的作用機制和安全性研究。此外該研究也發現了CII-3 和脫脂膏能提高脾臟指數，可升高血清CR 值，一定程度也說明了CII-3 和脫脂膏有一定的肝腎損傷，有必要進行進一步的分離純化。

3.3 CII-3 和脫脂膏影響肝癌細胞的自噬和侵襲轉移

近年來研究發現細胞自噬和侵襲轉移與肝細胞癌的發生、轉移及耐藥等方面有密切的關系[23-24]。細胞自噬和侵襲轉移過程是由許多基因共同參與完成，其中參與細胞自噬的基因主要包括ATG5、ATG7、P62。其中ATG5 主要參與自噬體形成，促進自噬前體膜延伸，ATG7 參與調控自噬體的形成，P62 主要依賴自噬進行降解。參與侵襲轉移的主要有MMP 家族（MMP2 和MMP9表現最明顯）、AKT、PI3K 等[25-26]。在研究各組自噬和侵襲轉移相關因子的表達時發現，耐藥腫瘤組織中P62、ATG5、ATG7、MMP2、MMP9、AKT 等均呈高表達，說明耐藥肝癌細胞具有更強的自噬和侵襲轉移能力，但P62 作為自噬負相關因子卻呈現出高表達，可能是由于P62 作為自噬過程的最后階段，受自噬影響較小。脫脂膏組和CII-3 組中除P62 外，其余自噬和侵襲轉移相關因子的mRNA 均明顯降低。表明CII-3 和脫脂膏可降低這種自噬和侵襲轉移能力，且CII-3 的作用效果優于脫脂膏，但二者對不同的自噬和侵襲轉移相關因子可產生不同程度的影響，其中對自噬相關因子ATG5 影響最為明顯，而對ATG7 和P62 影響較小。證明美洲大蠊提取物可能只能作用于自噬的某些階段。

綜上所述，本研究從動物水平入手，在前期的實驗基礎上進一步研究了美洲大蠊提取物CII-3 和脫脂膏對肝癌耐5-氟尿嘧啶細胞（BEL-7402/5-FU）自噬和侵襲轉移能力的影響，為該藥的物質基礎研究和臨床應用提供了實驗依據。但由于動物樣本有限等問題，未能進一步監測腫瘤組織中相關蛋白的表達，還需要進一步的研究。