寄主誘導的基因沉默在改良作物抗病蟲性方面的應用

劉友梅+薛敏峰+史文琦+黃薇+袁斌

摘要：根據RNA干擾（RNA interference，RNAi）原理，在生物體內表達雙鏈RNA（dsRNA）可以高效沉默生物體內基因的表達。在寄主中形成病原真菌和昆蟲特異基因的小RNA會進入其體內從而產生寄主誘導的基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）。病蟲害對全球糧食安全構成極大的威脅，利用HIGS技術為提高農作物抗病蟲性提供了有效的途徑。綜述了HIGS技術在提高農作物抗病蟲性中的應用，總結了沉默信號在寄主與病蟲間的可能的傳遞方式以及提出該技術存在的優缺點。

關鍵詞：RNA干擾（RNAi）；基因沉默；農作物；病害；蟲害

中圖分類號：S332.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4454-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.006

The Application of Host-induced Gene Silencing in Improving the Resistance

of Crop to Disease and Insect

LIU You-mei，XUE Min-feng，SHI Wen-qi，HUANG Wei，YUAN Bin

（Institute of Plant Protection and Clay Fertilizer，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management Crops in Central China， Ministry of Agriculture. P. R. China/Hubei Key Laboratory of Crop Disease， Insect Pests and Weeds Control，

Wuhan 430064， China）

Abstract： According to the principle of RNA interference（RNAi），the expression of double stranded RNA（dsRNA） in vivo can efficiently silence gene expression in organism. A small RNA that forms pathogenic fungi and insect specific genes in the host will enter its body and produce host-induced gene silencing（HIGS）. Crop diseases and insect pests pose a great threat to global food security，and the use of HIGS technology provides an effective way to improve crop disease and insect resistance. This paper summarized the application of HIGS technology on improving crop disease resistance and insect pests，and the possible transfer mode of silent signal between host and insect pest，and put forward the advantages and disadvantages of this technology.

Key words： RNA interference（RNAi）； host-induced gene silencing； crop； disease； pest

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高度保守且普遍存在的基因表達調控方式。它是由一種由雙鏈RNA（Double strand RNA）引起的基因沉默。RNA沉默不僅能夠阻止外源核苷酸的入侵，而且調控生物體的發育進程[1，2]。簡單的說，特異的dsRNA形成siRNA導致特定的mRNA降解，從而導致特定基因表達沉默。依據這個原理開發出了RNAi技術用于研究基因的功能。近年來，RNAi技術廣泛應用于基因功能的研究，并且在多種農作物中用于提高作物對生物或非生物脅迫的抵抗能力[3]。研究表明，體外施加dsRNA也能夠誘導生物體內目標基因產生基因沉默[4]。在寄主作物體內表達靶標生物特異基因的dsRNA則能夠幫助寄主免受被捕食或侵染。這種在寄主細胞中表達害蟲或病原菌基因dsRNA，以提高植物抗病蟲性的生物技術被稱之為寄主誘導基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）。與化學防治相比，這種稱為寄主誘導基因沉默的生物技術對靶標生物具有高度特異性。

隨著世界人口數量的增長，糧食需求也成倍增長，病蟲害是滿足糧食需求所面臨的主要挑戰。隨著dsRNA在昆蟲體內的吸收和擴展機制被闡明，從而使以RNAi為基礎的植物生物技術成為一種控制病蟲害的可行策略[5]。本文圍繞HIGS在病蟲害中已有的研究成果，論述其在生產上應用的可能和前景。

1 RNA沉默信號在寄主與靶標生物間的傳遞

HIGS要能夠取得抑制靶標生物目標基因的效果， 外源dsRNA必須進入靶標生物體內。研究表明，昆蟲吸收dsRNA主要有3條途徑：一是以SID-1蛋白和SID-2蛋白為基礎的跨膜通道吸收途徑。首先依賴SID-2蛋白將dsRNA從外環境運至體內，再由SID-1蛋白將dsRNA分子傳遞到整個昆蟲體內。二是選擇性內吞作用吸收途徑。三是依賴昆蟲免疫作用的吸收途徑[6]。endprint

當將植物寄生線蟲被浸潤在siRNA/dsRNA溶液中，siRNA/dsRNA可通過線蟲的分泌腺、排泄器官或受化學興奮劑刺激的咽部進入線蟲體內，從而誘導靶基因發生沉默，進一步影響線蟲的生長和發育。近年來，在活體條件下植物寄生線蟲RNAi信號的傳遞方式也被大量研究，植物寄生線蟲主要通過取食點攝取植物傳遞的siRNA或未被加工的dsRNA[7]。

小RNAs從植物細胞進入真菌細胞的轉移途徑尚不十分明確。植物與真菌的相互識別主要發生在植物與真菌的交界面上。真菌營養物質的吸收、酶的轉移、分泌毒素進入植物細胞、真菌效應蛋白和植物病程相關蛋白的分泌以及細胞表面感受器的相互識別均發生在這個界面上[8，9]。當植物遭受病原菌攻擊時，植物擁有專門的分泌系統將防衛分子傳遞到被攻擊的位置。而這種分泌途徑調控免疫反應所需的低分子質量化合物的運輸，例如細胞表面蛋白，它們通過細胞的外吐作用到達作用位點[10]。植物能夠活躍的輸出各類分子物質到植物和真菌界面，可能包括siRNAs。siRNAs存在的可能傳遞途徑包括通過胞外/胞吞作用在植物和真菌界面進行雙向傳遞；當真菌獲取營養物時隨著特定的轉運蛋白進行真菌細胞；通過各種跨膜通道進行被動穿越[11]。

2 HIGS在作物蟲害防治中的應用

農作物病蟲害造成巨大的損失，其中動物蟲害每年造成約15%～20%的產量損失[12]。長期使用化學農藥防治害蟲，有超過500種昆蟲和螨類對一種以上的殺蟲劑存在耐藥性[13]。這意味著需要有新的方法來防治農作物蟲害。

棉鈴蟲是世界性的害蟲之一，能夠為害超過360種植物。通過HIGS策略增強昆蟲對植物毒素的敏感性，從而間接抑制昆蟲的取食。棉鈴蟲細胞色素P450基因在棉鈴蟲幼蟲的中腸中表達，其對棉花中的棉子酚具有耐受作用。Mao等[14]通過構造出能夠表達棉鈴蟲P450基因dsRNA的棉花，使棉鈴蟲體內的P450基因表達量下降，從而減低其對棉酚的耐受性，最終導致其生長緩慢甚至死亡。來自棉鈴蟲的其他細胞色素P450基因已被作為HIGS的靶點用于防治那些對擬除蟲菊酯類殺蟲劑具有抗性的棉鈴蟲，同時解決了擬除蟲菊酯在田間的濫用問題。表達棉鈴蟲CYP9A14基因dsRNA的擬南芥能夠克服那些對溴氰菊酯具有抗性的棉鈴蟲幼蟲的取食[15]。Mamta等[16]以棉鈴蟲的幾丁質酶基因（HaCHI）為靶標基因，構造出HaCHI-RNAi煙草和土豆，實現了對棉鈴蟲的有效控制。Luo等[17]以影響黑盲蝽卵巢發育的AsFAR基因作為靶標，利用農桿菌介導的遺傳轉化得到了高量表達靶標基因dsRNA的轉基因棉花，創制的轉基因棉花對中黑盲蝽表現出較強的抵抗能力，降低了對棉花危害程度。

3 HIGS在作物病害防治中的應用

近年來，已有多個報道表明利用HIGS技術可以實現對真菌病害控制的研究。Panstruga[18]研究表明，某些植物病原真菌與寄主間通過吸器互作促進了病原菌對dsRNA的吸收或siRNA從寄主植物細胞進入真菌體內，使寄主植物產生以RNA沉默為基礎的抗性。Nowara等[19]將小麥白粉病菌效應子基因Avra10作為靶標基因，以不含抗性基因Mla10的小麥品種Pallas作為轉化親本，創制出表達Avra10基因dsRNA的轉基因小麥品種。該品種能使小麥白粉病菌在侵染時的吸器數目大幅減少，可以顯著提高感病品種的抗性。Koch等[20]研究表明，沉默真菌麥角固醇生物合成必需基因CYP51是限制禾谷鐮刀菌生長和發育最為有效的方法。將禾谷鐮刀菌參與合成的CYP51A、CYP51B和CYP51C 3個基因的片段構建成嵌合的長791個核苷酸dsRNA（CYP3RNA）進行生物測定，CYP3RNA對禾谷鐮刀菌的生長具有抑制作用，且CYP3RNA在擬南芥和大麥中表達使易感病植株提高了對真菌侵染的抗性[21]。這些結果均證實了真菌CYP51基因的寄主誘導沉默是抑制菌絲體形成和侵染植物的有效方式。Govindarajulu等[22]以萵苣霜霉病菌的HAM34和CES1基因為目標基因，構造出能夠專門抑制上述基因表達的轉基因萵苣品種，從而大大抑制萵苣霜霉病菌的生長和孢子形成。Zhang等[23]成功利用HIGS技術實現了對棉花黃萎病的防控，以真菌疏水蛋白VDH1編碼基因作為靶標分子，構建獲得RNAi（Vdh1i）轉基因棉花，通過致病性檢測表明該轉基因棉花對棉花黃萎病表現出較高的抗性。

植物寄生線蟲在2003年對全球作物造成嚴重損失[24]，絕大部分為害是由根結線蟲和孢囊線蟲引起的。Yadav等[25]利用南方根結線蟲剪接因子和整合酶基因創制的dsRNA轉基因煙草品種；Charlton等[26]將兩個分別表達Mispc3和Miduox基因dsRNAs的轉基因擬南芥品種進行了雜交，獲得了能夠同時表達Mispc3和Miduox基因dsRNAs的轉基因擬南芥新品種；Niu等[27]以南方根結線蟲的Rpn7基因作為靶基因，構造出能夠表達出南方根結線蟲Rpn7基因dsRNA的菊科植物。以上利用dsRNA創制的轉基因植株都顯著提高對目標病蟲的抗性。

4 HIGS在作物病蟲害防治中的利弊

HIGS 技術在應用中的優點：對于尚未克隆到抗病蟲基因的農作物，利用HIGS技術可以加速培育出抗病蟲的農作物；若選取的靶基因序列在多種害蟲或病原菌中具有高度同源性，則改造出的農作物可展示出抗多種蟲害或病害的特點；與化學防治對環境造成巨大的污染相比，HIGS對環境的副作用最小。

HIGS技術在應用中的不足：HIGS選取靶基因中的一段基因用于沉默，這有可能會造成其他同源的非目標基因的沉默；HIGS載體在寄主基因組上是隨機插入的，當插入到寄主某個關鍵基因中時，可能會造成寄主表型發生改變；HIGS不僅需要構建HIGS載體，而且需要較成熟的作物轉化體系，因此，并不是所有的寄主病原互作系統均能達到理想的效果[28]。endprint

選擇合適的靶基因是HIGS能夠成功的關鍵步驟，而致死表型基因被證實能夠最有效的用于HIGS。而通過cDNA文庫和利用下一代測序技術（如轉錄組測序）篩選到的顯著差異表達水平基因也可作為合適的靶基因。需值得注意的是，目標基因的dsRNA和相應的siRNA不會發生非靶效應，即對非目標寄主、哺乳動物和寄主植物的生理不會產生不良影響。綜上所述，HIGS技術的應用在創制作物抗病蟲新種質上有著廣闊的應用前景，使得農作物獲得持久抗病蟲性成為可能[29]。

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