間接共培養(yǎng)下柔嫩艾美耳球蟲對(duì)MDBK細(xì)胞凋亡抑制的研究

鄭新楓 ， 王黎霞 ， 趙晨璐 ， 王 靜 ， 張建軍 ， 安 健

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)示范中心 ， 北京 昌平 102206 ；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 ， 北京 房山 102442)

雞球蟲病是畜禽生產(chǎn)中的危害最為嚴(yán)重的寄生蟲病之一，長(zhǎng)期以來(lái)一直沒有得到有效根治，深入探究球蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用及其機(jī)制是未來(lái)有效防控該病的基礎(chǔ)保障[1]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，然而有的病原體則會(huì)通過(guò)某些特殊的機(jī)制延緩宿主的凋亡從而能保證其能在宿主內(nèi)的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖，直至其轉(zhuǎn)移至其他宿主或環(huán)境中。據(jù)報(bào)道，弓形蟲可以影響宿主的凋亡，促進(jìn)或抑制宿主細(xì)胞凋亡[2]。球蟲的子孢子會(huì)在其發(fā)育初期抑制宿主細(xì)胞的凋亡，在其發(fā)育中期和后期則會(huì)一直影響宿主細(xì)胞的凋亡[3]；另外，宿主細(xì)胞凋亡受到抑制有利于柔嫩艾美耳球蟲入侵細(xì)胞之后的發(fā)育[4]。

為研究球蟲早期抑制宿主細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究使用Transwell小室使柔嫩艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細(xì)胞隔離共培養(yǎng)，分別在開始共培養(yǎng)之后的3、6、9 h和12 h測(cè)定共培養(yǎng)組與對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)體系中的Caspase3等5種凋亡相關(guān)因子的活性，分析宿主細(xì)胞凋亡程度的不同，從而推斷在不入侵宿主細(xì)胞的情況下，球蟲可能會(huì)分泌某種信號(hào)物質(zhì)抑制細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 BJ4E.tenlla孢子化卵囊，由北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供，復(fù)壯周期為3個(gè)月。

1.1.2 細(xì)胞 MDBK細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存用于雞球蟲研究的貼壁細(xì)胞系。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡農(nóng)大三號(hào)公雞雛，無(wú)球蟲及其他病原環(huán)境下飼養(yǎng)，使用不含抗球蟲藥的雛雞飼料，飲水任取，至14日齡。

1.2 方法

1.2.1 卵囊的感染 25只14日齡健康雛雞經(jīng)口感染BJ4E.tenlla孢子化卵囊8×104個(gè)/只。

1.2.2 裂殖子的獲取及純化 在灌服BJ4E.tenlla孢子化卵囊108 h，剖殺試驗(yàn)用雞。取出并沿縱向剪開盲腸，在冰浴的條件下刮下盲腸上皮細(xì)胞，勻漿，離心(1 500r/min)并收集沉淀，后離心(600r/min)并收集上清；再次離心(1 500r/min)收集沉淀，用40 ℃洗脫液重懸沉淀備用。安裝DE-52纖維層析柱，加入懸有裂殖子的洗脫液，收集得到純化的E.tenlla裂殖子。

1.2.3 MDBK細(xì)胞的培養(yǎng) 取出保存于液氮中的MDBK細(xì)胞，使之在37 ℃水浴中1 min以內(nèi)快速溶解，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中，緩慢加入DMEM完全培養(yǎng)基后，用移液器吹吸均勻，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，細(xì)胞貼壁后，更換新的培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞瓶80%～90%，進(jìn)行傳代。后轉(zhuǎn)移至6孔板中培養(yǎng)。

1.2.4 試驗(yàn)分組 間接共培養(yǎng)組；對(duì)照組。每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 間接共培養(yǎng)體系的建立 應(yīng)用Transwell培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)，按1∶3的比例，在小室上層加入0.5 mL,約含有1 000萬(wàn)裂殖子的洗脫液，下層則是約330萬(wàn)個(gè)MDBK細(xì)胞及1.5 mL培養(yǎng)基。對(duì)照組上層為0.5 mL,洗脫液，下層與試驗(yàn)組相同。

1.2.6 細(xì)胞凋亡因子活性 分別于共培養(yǎng)第3、6、9 h和12 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出試驗(yàn)組與對(duì)照組每組各三孔細(xì)胞，按Caspase活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)說(shuō)明書測(cè)定Caspase2、Caspase3、Caspase6、Caspase8、Caspase9的活性。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS軟件對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的兩組MDBK細(xì)胞凋亡因子之間的差異進(jìn)行分析比較，當(dāng)P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果

細(xì)胞凋亡因子活性測(cè)定結(jié)果 Caspase3在3、6、9 h時(shí)差異顯著，12 h時(shí)差異極顯著；Caspase2在6 h、9 h 時(shí)差異顯著，12 h時(shí)差異極顯著；Caspase6在 6 h、9 h、12 h時(shí)差異顯著；Caspase8和Caspase9在 6 h、9 h 時(shí)差異顯著，12 h時(shí)差異極顯著。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)共培養(yǎng)組的細(xì)胞凋亡因子的活性始終低于對(duì)照組(圖1)。

圖1 5種Caspase間接共培養(yǎng)組與對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的活性比較

**：P<0.01 ; *:P<0.05

3 討論

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用的蛋白酶家族。本研究中選用其中的Caspase2、3、6、8、9活性來(lái)評(píng)價(jià)兩個(gè)試驗(yàn)組中的宿主細(xì)胞的凋亡水平[5]。其中，Caspase8通常以酶原的形式存在，在細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中被激活，且被認(rèn)為是該過(guò)程中比較上游的Caspase，在Fas-receptor和TNFR-1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase8被激活，形成一個(gè)由p18和p10組成的二聚體，進(jìn)一步激活下游的Caspase9等。線粒體釋放細(xì)胞色素C以后，Caspase9可以和其以及Apaf1形成復(fù)合物同時(shí)被激活，激活的Caspase9可以激活細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵酶Caspase3，從而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號(hào)。Caspase3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究最多的一個(gè)Caspase，Caspase3可以剪切成Procaspase2、6等，并可以直接特異性剪切許多是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制重要組成部分的Caspase底物，另外，Caspase3在細(xì)胞核凋亡過(guò)程中也起到了關(guān)鍵作用，包括染色質(zhì)固縮，DNA片段化等。Caspase2在細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可以被激活，其mRNA可以被剪切成兩種不同長(zhǎng)短的形式，其全長(zhǎng)的mRNA產(chǎn)物可以促進(jìn)凋亡，而短的mRNA的蛋白產(chǎn)物則可以抑制細(xì)胞凋亡。Caspase6最初是從人的Jurkat細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其前體被granzyme B剪切后可以形成活化的Caspase6二聚體，

而活化的Caspase6被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。本研究中，兩組之間Caspase8、3、9的活性差異要大于Caspase2、6的差異，推測(cè)是由于其所處于凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的位置不同所導(dǎo)致。

鄧家儉等研究表明，E.tenlla裂殖子可以在入侵早期抑制MDBK細(xì)胞的凋亡[7]，還有研究表明，E.acervulina在入侵早期也許有類似于E.tenlla或弓形蟲抑制凋亡的機(jī)制，通過(guò)Caspase蛋白及各種抗凋亡或促凋亡因子的相互抗衡，達(dá)到抑制宿主細(xì)胞凋亡的作用[8]。先前有研究用Transwell共培養(yǎng)體系，研究弓形蟲排泄分泌抗原(ESA)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)凋亡的通路中，檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平隨時(shí)間的變化[9]。受此啟發(fā)，本研究中將宿主細(xì)胞與球蟲隔離開來(lái)，通過(guò)Transwell小室進(jìn)行間接共培養(yǎng)，防止E.tenlla裂殖子入侵宿主細(xì)胞，從而研究在這種情況下，宿主細(xì)胞的凋亡是否會(huì)受到抑制。由試驗(yàn)結(jié)果可知，測(cè)定的共培養(yǎng)組的5種凋亡因子的水平均低于對(duì)照組，說(shuō)明在間接共培養(yǎng)開始到12 h時(shí)，MDBK細(xì)胞的凋亡受到了抑制。根據(jù)本研究中的結(jié)果，在共培養(yǎng)3、6、9 h和12 h時(shí)，球蟲裂殖子在沒有入侵宿主細(xì)胞的情況下仍然會(huì)抑制宿主細(xì)胞的凋亡，可以推斷球蟲裂殖子可能會(huì)分泌抑制凋亡的物質(zhì)作用于宿主細(xì)胞，而究竟是何種物質(zhì)或作用機(jī)制使得宿主細(xì)胞凋亡受到抑制仍有待進(jìn)一步的研究。

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