視網(wǎng)膜缺血再灌注后視網(wǎng)膜的病理變化及造模前后CREB的表達(dá)隋源

cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白( cAMP response element binding protein， CREB)是一種存在于真核生物細(xì)胞核內(nèi)蛋白， CREB 與真核生物 cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，又稱之為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。 CREB 功能表現(xiàn)在生命活動(dòng)的各個(gè)方面，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期， 影響胎兒 T 細(xì)胞的發(fā)育，影響肝臟代謝、影響神經(jīng)元細(xì)胞的存活和再生等。在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，利用 siRNA 及基因敲除等技術(shù)證明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò) MSK-1 激活 CREB 促進(jìn)神經(jīng)元的存活。研究表明 CREB 對(duì)心腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[1]。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的小鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的丟失主要集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinal ganglion cells,RGC)。我們觀察了視網(wǎng)膜缺血1 h再灌注后，中長(zhǎng)期( 7、 14、21 d)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。 CREB 在腦組織缺血再灌注的研究結(jié)果顯示對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，因此，我們檢測(cè)了 CREB 在該模型中的表達(dá)改變，研究其與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的關(guān)系。

資料與方法

一、材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取健康清潔的 8 周齡 C57/BL6J 小鼠 90 只，雌雄兼有(我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。所有動(dòng)物均在我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的 SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物的飼養(yǎng)與處死均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院( National Institutes of Health， NIH )的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南》進(jìn)行。

主要試劑與抗體：Trizol Invitrogen， 15596-018)；顯影定影試劑 谷歌生物；Actin santa cruz；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒 Bio-rad；cDNA 第一鏈合成試劑盒， Fermentas #K1622；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)： Fermentas ， #K0242；Ex TaqTM TAKARA， DRR100A；DL2000 DNA Marker TAKARA， D502A；引物合成 金斯瑞；CREB CST， #9197。

二、方法

1.視網(wǎng)膜缺血再灌注模型的建立用前房加壓灌注方法，將 200 ml 生理鹽水輸液袋懸于距大鼠眼球 1.36 m 高處。麻醉后，在顯微鏡下用 32G×6 mm 胰島素針頭穿刺入前房，此時(shí)眼壓 相當(dāng)于 100 mmHg(136 cm H20=100 mmHg， 1 kPa=7.5 mmHg ， 100 mmHg=13.3 kPa)，觀察若出現(xiàn)瞳孔逐漸散大，虹膜、視網(wǎng)膜缺血，角膜逐漸水腫呈霧狀，則視網(wǎng)膜缺血再灌注模型構(gòu)建成功。……