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顯微光學(xué)切片斷層成像技術(shù)在卒中研究中的應(yīng)用

2018-01-12 07:34:59潘超張萍唐洲平
中國(guó)卒中雜志 2017年2期
關(guān)鍵詞:小鼠研究

潘超,張萍,唐洲平

近幾年來(lái),美國(guó)、歐洲、日本和中國(guó)相繼宣布了媲美“人類基因組計(jì)劃”的“腦科學(xué)計(jì)劃”。這項(xiàng)宏偉的工程將對(duì)大腦內(nèi)近千億的神經(jīng)元和血管、神經(jīng)環(huán)路及其相互連接進(jìn)行全面的研究。腦內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路連接和血管連接是實(shí)現(xiàn)腦功能的基本單元。因此,如何獲取高分辨的腦連接圖譜是進(jìn)行腦科學(xué)研究的重中之重。

2010年華中科技大學(xué)光電實(shí)驗(yàn)室駱清銘團(tuán)隊(duì)采用其自主設(shè)計(jì)研發(fā)的具有顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)(micro-optical sectioning tomography,MOST)和發(fā)明的小鼠全腦高爾基染色、樹(shù)脂包埋法,以“邊切片邊成像”的工作方式采集了小鼠腦高分辨高爾基結(jié)構(gòu)三維數(shù)據(jù)集,是目前世界上最大的也是分辨率最高(0.33μm×0.33μm×1 μm)的鼠腦神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)集[1]。隨后,陸續(xù)又利用全腦尼氏染色、印度墨水灌注等方法采集了小鼠神經(jīng)元、腦血管三維數(shù)據(jù)集[2-3]。新一代熒光MOST(fluorescence micro-optical sectioning tomography,fMOST)的開(kāi)發(fā),借助熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠全腦樹(shù)脂包埋技術(shù),fMOST系統(tǒng)在國(guó)際上首次成功獲取了熒光小鼠全腦范圍內(nèi)長(zhǎng)程投射神經(jīng)元結(jié)構(gòu)分布數(shù)據(jù)集,結(jié)合開(kāi)發(fā)的神經(jīng)元追蹤分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦內(nèi)特定神經(jīng)投射路徑的立體觀察和精確定量分析[4](圖1)。此外,整體熒光染色技術(shù)已問(wèn)世,有望通過(guò)特異性免疫熒光抗體標(biāo)記血管,在一份腦圖譜中同時(shí)顯示特定神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)投射及血管連接網(wǎng)絡(luò)[5]。

卒中是一類高發(fā)病率、高致死致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前對(duì)卒中的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病后的病理生理變化及神經(jīng)血管保護(hù)仍不甚明朗。如臨床上常見(jiàn)到相同類型的卒中患者,梗死部位和梗死大小均相同,而臨床預(yù)后可能完全不同,這很可能與患者側(cè)支循環(huán)尤其是微循環(huán)的代償能力不同有關(guān)。對(duì)于缺血性卒中,血管狹窄或閉塞后其腦內(nèi)微循環(huán)是如何代償?shù)摹⑷毖獏^(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的供血關(guān)系是怎樣變化的、出血性卒中后血腫占位及高顱內(nèi)壓狀態(tài)下的顱內(nèi)微循環(huán)是如何改變、卒中后自體血管再生的過(guò)程其發(fā)生發(fā)展機(jī)制及時(shí)空分布等,卒中后神經(jīng)投射通路是否重建、與卒中后患者康復(fù)密切相關(guān)的神經(jīng)重塑、血管代償?shù)龋彩亲渲谢颊咧匾闹委煱悬c(diǎn),目前研究亦處于較初級(jí)階段(圖2)。這些均是卒中研究的重點(diǎn)和難點(diǎn),非常值得進(jìn)一步研究。

圖1 通過(guò)顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建腦神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)

圖2 通過(guò)顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)技術(shù)對(duì)卒中進(jìn)行研究

磁共振血管造影(magnetic resonance angiography,MRA)、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描血管成像(computed tomography angiography,CTA)或數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)等血管成像技術(shù)能很好地觀察大血管,但對(duì)微血管尤其是毛細(xì)血管難以做到精確的標(biāo)記和觀察。傳統(tǒng)的血管三維可視化技術(shù)手段如微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(micro-computed tomography,micro-CT)血管成像、同步輻射線顯微斷層血管成像等或成像分辨率低,或僅能顯示血管網(wǎng)絡(luò),但丟失了神經(jīng)元信息,難以同步研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與血管網(wǎng)絡(luò)[6-7]。而對(duì)于微循環(huán)的研究,MOST系統(tǒng)可提供高分辨的三維可視化圖譜,結(jié)合fMOST和免疫標(biāo)記技術(shù)理論上能同時(shí)實(shí)現(xiàn)血管和神經(jīng)細(xì)胞的共標(biāo)記及共成像,未來(lái)借助MOST技術(shù)獲得卒中疾病圖譜將為進(jìn)行卒中研究提供技術(shù)支持。

腦圖譜的繪制已在美國(guó)、歐洲、中國(guó)等國(guó)家相繼展開(kāi)。目前的基本路線是從鼠類到非人靈長(zhǎng)類再到人類,從正常腦圖譜到包括腦血管疾病、腦遺傳變性病等腦疾病圖譜,為研究腦疾病和開(kāi)發(fā)腦功能、發(fā)展人工智能等提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。雖然鼠腦疾病圖譜的繪制研究正方興未艾,但由于物種特征相差較大,鼠腦內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接、血管分布及代償特點(diǎn)與人類相差較大,不能深刻揭示人腦疾病后機(jī)制。為此,采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模擬人類疾病研究具有不可替代的作用。猴類動(dòng)物的腦區(qū)分布及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接特點(diǎn)與人類更接近,其腦循環(huán)特點(diǎn)與人類相似,對(duì)研究腦缺血后的循環(huán)代償、卒中后的血管修復(fù)、卒中后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的變化具有天然的優(yōu)勢(shì)。然而,采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物代替鼠類研究主要具有以下難點(diǎn):①鼠腦容量遠(yuǎn)小于猴類,獲取猴類腦切片并繪制超微神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)研制難度更大,其數(shù)據(jù)量將遠(yuǎn)大于鼠腦。目前單個(gè)小鼠全腦數(shù)據(jù)集的大小已達(dá)到10 TB級(jí)別,而繪制的非人靈長(zhǎng)類全腦數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)量將到上百TB,甚至PB級(jí)別,因此處理非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦圖譜必然考驗(yàn)大數(shù)據(jù)的計(jì)算和存儲(chǔ)能力,以及軟件技術(shù)的開(kāi)發(fā)都提出了巨大挑戰(zhàn)[8]。②目前,單個(gè)鼠腦的樣本經(jīng)MOST獲取0.5 μm3精度的全腦數(shù)據(jù)集24 h不間斷切片成像需耗時(shí)3~10 d,若獲取猴類腦數(shù)據(jù)將耗費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間,可達(dá)數(shù)月之久,高強(qiáng)度的工作對(duì)儀器的壽命和保養(yǎng)提出了嚴(yán)苛的要求,亟待解決。③較大體積的腦樣本對(duì)樣品制備、染色標(biāo)記技術(shù)要求更高。現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道采用改進(jìn)的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)一定厚度的生物樣本成功標(biāo)記并獲取三維圖譜[5],但尚未有研究解決如此大體積的腦標(biāo)本標(biāo)記難題,同時(shí)大量的抗體需求也增加了研究成本。

然而,MOST系統(tǒng)目前還是離體研究,不能在體觀察,現(xiàn)階段尚不能滿足連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察的需求。由于最后重建的三維圖譜是基于陽(yáng)性染色標(biāo)記的結(jié)構(gòu)與周圍結(jié)構(gòu)的分辨率對(duì)比,而當(dāng)血腦屏障出現(xiàn)較大破壞時(shí),如腦梗死后,壞死組織及水腫液等在染色過(guò)程中可能會(huì)被非特異性染色,造成背景干擾,這些對(duì)獲取三維結(jié)構(gòu)造成了較大視覺(jué)影響,需待開(kāi)發(fā)更完善的軟件系統(tǒng)進(jìn)行辨識(shí)和分離。

1 Li A,Gong H,Zhang B,et al.Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain[J].Science,2010,330:1404-1408.

2 Wu J,He Y,Yang Z,et al.3D Brain CV:simultaneous visualization and analysis of cells and capillaries in a whole mouse brain with one-micron voxel resolution[J].Neuroimage,2014,87:199-208.

3 Xue S,Gong H,Jiang T,et al.Indian-ink perfusion based method for reconstructing continuous vascular networks in whole mouse brain[J].PLoS One,2014,9:e88067.

4 Gong H,Zeng S,Yan C,et al.Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution[J].Neuroimage,2013,74:87-98.

5 Renier N,Wu Z,Simon DJ,et al.iDISCO:a simple,rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging[J].Cell,2014,159:896-910.

6 Urao N,Okonkwo UA,F(xiàn)ang MM,et al.MicroCT angiography detects vascular formation and regression in skin wound healing[J].Microvasc Res,2016,106:57-66.

7 Plouraboue F,Cloetens P,F(xiàn)onta C,et al.X-ray highresolution vascular network imaging[J].J Microsc,2004,215:139-148.

8 杜久林,畢國(guó)強(qiáng),駱清銘,等.腦科學(xué)研究新技術(shù)[J].中國(guó)科學(xué)院院刊,2016,31:783-792.

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