顯微光學切片斷層成像技術在卒中研究中的應用

潘超，張萍，唐洲平

近幾年來，美國、歐洲、日本和中國相繼宣布了媲美“人類基因組計劃”的“腦科學計劃”。這項宏偉的工程將對大腦內近千億的神經元和血管、神經環路及其相互連接進行全面的研究。腦內的神經環路連接和血管連接是實現腦功能的基本單元。因此，如何獲取高分辨的腦連接圖譜是進行腦科學研究的重中之重。

2010年華中科技大學光電實驗室駱清銘團隊采用其自主設計研發的具有顯微光學切片斷層成像系統（micro-optical sectioning tomography，MOST）和發明的小鼠全腦高爾基染色、樹脂包埋法，以“邊切片邊成像”的工作方式采集了小鼠腦高分辨高爾基結構三維數據集，是目前世界上最大的也是分辨率最高（0.33μm×0.33μm×1 μm）的鼠腦神經突起網絡數據集[1]。隨后，陸續又利用全腦尼氏染色、印度墨水灌注等方法采集了小鼠神經元、腦血管三維數據集[2-3]。新一代熒光MOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）的開發，借助熒光標記的轉基因小鼠全腦樹脂包埋技術，fMOST系統在國際上首次成功獲取了熒光小鼠全腦范圍內長程投射神經元結構分布數據集，結合開發的神經元追蹤分析技術實現了對腦內特定神經投射路徑的立體觀察和精確定量分析[4]（圖1）。此外，整體熒光染色技術已問世，有望通過特異性免疫熒光抗體標記血管，在一份腦圖譜中同時顯示特定神經細胞、神經投射及血管連接網絡[5]。

卒中是一類高發病率、高致死致殘率的中樞神經系統疾病。目前對卒中的發病機制、發病后的病理生理變化及神經血管保護仍不甚明朗。如臨床上常見到相同類型的卒中患者，梗死部位和梗死大小均相同，而臨床預后可能完全不同，這很可能與患者側支循環尤其是微循環的代償能力不同有關。對于缺血性卒中，血管狹窄或閉塞后其腦內微循環是如何代償的、缺血區域神經網絡的供血關系是怎樣變化的、出血性卒中后血腫占位及高顱內壓狀態下的顱內微循環是如何改變、卒中后自體血管再生的過程其發生發展機制及時空分布等，卒中后神經投射通路是否重建、與卒中后患者康復密切相關的神經重塑、血管代償等，也是卒中患者重要的治療靶點，目前研究亦處于較初級階段（圖2）。這些均是卒中研究的重點和難點，非常值得進一步研究。

圖1 通過顯微光學切片斷層成像系統技術構建腦神經血管網絡

圖2 通過顯微光學切片斷層成像系統技術對卒中進行研究

磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、電子計算機斷層掃描血管成像（computed tomography angiography，CTA）或數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）等血管成像技術能很好地觀察大血管，但對微血管尤其是毛細血管難以做到精確的標記和觀察。傳統的血管三維可視化技術手段如微計算機斷層掃描技術（micro-computed tomography，micro-CT）血管成像、同步輻射線顯微斷層血管成像等或成像分辨率低，或僅能顯示血管網絡，但丟失了神經元信息，難以同步研究神經網絡與血管網絡[6-7]。而對于微循環的研究，MOST系統可提供高分辨的三維可視化圖譜，結合fMOST和免疫標記技術理論上能同時實現血管和神經細胞的共標記及共成像，未來借助MOST技術獲得卒中疾病圖譜將為進行卒中研究提供技術支持。

腦圖譜的繪制已在美國、歐洲、中國等國家相繼展開。目前的基本路線是從鼠類到非人靈長類再到人類，從正常腦圖譜到包括腦血管疾病、腦遺傳變性病等腦疾病圖譜，為研究腦疾病和開發腦功能、發展人工智能等提供強有力的技術支持。雖然鼠腦疾病圖譜的繪制研究正方興未艾，但由于物種特征相差較大，鼠腦內的神經網絡連接、血管分布及代償特點與人類相差較大，不能深刻揭示人腦疾病后機制。為此，采用非人靈長類動物模擬人類疾病研究具有不可替代的作用。猴類動物的腦區分布及神經網絡連接特點與人類更接近，其腦循環特點與人類相似，對研究腦缺血后的循環代償、卒中后的血管修復、卒中后神經網絡連接的變化具有天然的優勢。然而，采用非人靈長類動物代替鼠類研究主要具有以下難點：①鼠腦容量遠小于猴類，獲取猴類腦切片并繪制超微神經血管網絡的系統研制難度更大，其數據量將遠大于鼠腦。目前單個小鼠全腦數據集的大小已達到10 TB級別，而繪制的非人靈長類全腦數據集的數據量將到上百TB，甚至PB級別，因此處理非人靈長類動物的腦圖譜必然考驗大數據的計算和存儲能力，以及軟件技術的開發都提出了巨大挑戰[8]。②目前，單個鼠腦的樣本經MOST獲取0.5 μm3精度的全腦數據集24 h不間斷切片成像需耗時3～10 d，若獲取猴類腦數據將耗費更長時間，可達數月之久，高強度的工作對儀器的壽命和保養提出了嚴苛的要求，亟待解決。③較大體積的腦樣本對樣品制備、染色標記技術要求更高。現已有文獻報道采用改進的免疫熒光標記技術對一定厚度的生物樣本成功標記并獲取三維圖譜[5]，但尚未有研究解決如此大體積的腦標本標記難題，同時大量的抗體需求也增加了研究成本。

然而，MOST系統目前還是離體研究，不能在體觀察，現階段尚不能滿足連續動態觀察的需求。由于最后重建的三維圖譜是基于陽性染色標記的結構與周圍結構的分辨率對比，而當血腦屏障出現較大破壞時，如腦梗死后，壞死組織及水腫液等在染色過程中可能會被非特異性染色，造成背景干擾，這些對獲取三維結構造成了較大視覺影響，需待開發更完善的軟件系統進行辨識和分離。

1 Li A，Gong H，Zhang B，et al.Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain[J].Science，2010，330：1404-1408.

2 Wu J，He Y，Yang Z，et al.3D Brain CV：simultaneous visualization and analysis of cells and capillaries in a whole mouse brain with one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2014，87：199-208.

3 Xue S，Gong H，Jiang T，et al.Indian-ink perfusion based method for reconstructing continuous vascular networks in whole mouse brain[J].PLoS One，2014，9：e88067.

4 Gong H，Zeng S，Yan C，et al.Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2013，74：87-98.

5 Renier N，Wu Z，Simon DJ，et al.iDISCO：a simple，rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging[J].Cell，2014，159：896-910.

6 Urao N，Okonkwo UA，Fang MM，et al.MicroCT angiography detects vascular formation and regression in skin wound healing[J].Microvasc Res，2016，106：57-66.

7 Plouraboue F，Cloetens P，Fonta C，et al.X-ray highresolution vascular network imaging[J].J Microsc，2004，215：139-148.

8 杜久林，畢國強，駱清銘，等.腦科學研究新技術[J].中國科學院院刊，2016，31：783-792.