顯微光學切片斷層成像技術(shù)在卒中研究中的應(yīng)用

潘超，張萍，唐洲平

近幾年來，美國、歐洲、日本和中國相繼宣布了媲美“人類基因組計劃”的“腦科學計劃”。這項宏偉的工程將對大腦內(nèi)近千億的神經(jīng)元和血管、神經(jīng)環(huán)路及其相互連接進行全面的研究。腦內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路連接和血管連接是實現(xiàn)腦功能的基本單元。因此，如何獲取高分辨的腦連接圖譜是進行腦科學研究的重中之重。

2010年華中科技大學光電實驗室駱清銘團隊采用其自主設(shè)計研發(fā)的具有顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)（micro-optical sectioning tomography，MOST）和發(fā)明的小鼠全腦高爾基染色、樹脂包埋法，以“邊切片邊成像”的工作方式采集了小鼠腦高分辨高爾基結(jié)構(gòu)三維數(shù)據(jù)集，是目前世界上最大的也是分辨率最高（0.33μm×0.33μm×1 μm）的鼠腦神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)集[1]。隨后，陸續(xù)又利用全腦尼氏染色、印度墨水灌注等方法采集了小鼠神經(jīng)元、腦血管三維數(shù)據(jù)集[2-3]。新一代熒光MOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）的開發(fā)，借助熒光標記的轉(zhuǎn)基因小鼠全腦樹脂包埋技術(shù)，fMOST系統(tǒng)在國際上首次成功獲取了熒光小鼠全腦范圍內(nèi)長程投射神經(jīng)元結(jié)構(gòu)分布數(shù)據(jù)集，結(jié)合開發(fā)的神經(jīng)元追蹤分析技術(shù)實現(xiàn)了對腦內(nèi)特定神經(jīng)投射路徑的立體觀察和精確定量分析[4]（圖1）。此外，整體熒光染色技術(shù)已問世，有望通過特異性免疫熒光抗體標記血管，在一份腦圖譜中同時顯示特定神經(jīng)細胞、神經(jīng)投射及血管連接網(wǎng)絡(luò)[5]。

卒中是一類高發(fā)病率、高致死致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前對卒中的發(fā)病機制、發(fā)病后的病理生理變化及神經(jīng)血管保護仍不甚明朗。如臨床上常見到相同類型的卒中患者，梗死部位和梗死大小均相同，而臨床預(yù)后可能完全不同，這很可能與患者側(cè)支循環(huán)尤其是微循環(huán)的代償能力不同有關(guān)。對于缺血性卒中，血管狹窄或閉塞后其腦內(nèi)微循環(huán)是如何代償?shù)摹⑷毖獏^(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的供血關(guān)系是怎樣變化的、出血性卒中后血腫占位及高顱內(nèi)壓狀態(tài)下的顱內(nèi)微循環(huán)是如何改變、卒中后自體血管再生的過程其發(fā)生發(fā)展機制及時空分布等，卒中后神經(jīng)投射通路是否重建、與卒中后患者康復(fù)密切相關(guān)的神經(jīng)重塑、血管代償?shù)龋彩亲渲谢颊咧匾闹委煱悬c，目前研究亦處于較初級階段（圖2）。這些均是卒中研究的重點和難點，非常值得進一步研究。

圖1 通過顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建腦神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)

圖2 通過顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)技術(shù)對卒中進行研究

磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、電子計算機斷層掃描血管成像（computed tomography angiography，CTA）或數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）等血管成像技術(shù)能很好地觀察大血管，但對微血管尤其是毛細血管難以做到精確的標記和觀察。傳統(tǒng)的血管三維可視化技術(shù)手段如微計算機斷層掃描技術(shù)（micro-computed tomography，micro-CT）血管成像、同步輻射線顯微斷層血管成像等或成像分辨率低，或僅能顯示血管網(wǎng)絡(luò)，但丟失了神經(jīng)元信息，難以同步研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與血管網(wǎng)絡(luò)[6-7]。而對于微循環(huán)的研究，MOST系統(tǒng)可提供高分辨的三維可視化圖譜，結(jié)合fMOST和免疫標記技術(shù)理論上能同時實現(xiàn)血管和神經(jīng)細胞的共標記及共成像，未來借助MOST技術(shù)獲得卒中疾病圖譜將為進行卒中研究提供技術(shù)支持。

腦圖譜的繪制已在美國、歐洲、中國等國家相繼展開。目前的基本路線是從鼠類到非人靈長類再到人類，從正常腦圖譜到包括腦血管疾病、腦遺傳變性病等腦疾病圖譜，為研究腦疾病和開發(fā)腦功能、發(fā)展人工智能等提供強有力的技術(shù)支持。雖然鼠腦疾病圖譜的繪制研究正方興未艾，但由于物種特征相差較大，鼠腦內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接、血管分布及代償特點與人類相差較大，不能深刻揭示人腦疾病后機制。為此，采用非人靈長類動物模擬人類疾病研究具有不可替代的作用。猴類動物的腦區(qū)分布及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接特點與人類更接近，其腦循環(huán)特點與人類相似，對研究腦缺血后的循環(huán)代償、卒中后的血管修復(fù)、卒中后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的變化具有天然的優(yōu)勢。然而，采用非人靈長類動物代替鼠類研究主要具有以下難點：①鼠腦容量遠小于猴類，獲取猴類腦切片并繪制超微神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)研制難度更大，其數(shù)據(jù)量將遠大于鼠腦。目前單個小鼠全腦數(shù)據(jù)集的大小已達到10 TB級別，而繪制的非人靈長類全腦數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)量將到上百TB，甚至PB級別，因此處理非人靈長類動物的腦圖譜必然考驗大數(shù)據(jù)的計算和存儲能力，以及軟件技術(shù)的開發(fā)都提出了巨大挑戰(zhàn)[8]。②目前，單個鼠腦的樣本經(jīng)MOST獲取0.5 μm3精度的全腦數(shù)據(jù)集24 h不間斷切片成像需耗時3～10 d，若獲取猴類腦數(shù)據(jù)將耗費更長時間，可達數(shù)月之久，高強度的工作對儀器的壽命和保養(yǎng)提出了嚴苛的要求，亟待解決。③較大體積的腦樣本對樣品制備、染色標記技術(shù)要求更高。現(xiàn)已有文獻報道采用改進的免疫熒光標記技術(shù)對一定厚度的生物樣本成功標記并獲取三維圖譜[5]，但尚未有研究解決如此大體積的腦標本標記難題，同時大量的抗體需求也增加了研究成本。

然而，MOST系統(tǒng)目前還是離體研究，不能在體觀察，現(xiàn)階段尚不能滿足連續(xù)動態(tài)觀察的需求。由于最后重建的三維圖譜是基于陽性染色標記的結(jié)構(gòu)與周圍結(jié)構(gòu)的分辨率對比，而當血腦屏障出現(xiàn)較大破壞時，如腦梗死后，壞死組織及水腫液等在染色過程中可能會被非特異性染色，造成背景干擾，這些對獲取三維結(jié)構(gòu)造成了較大視覺影響，需待開發(fā)更完善的軟件系統(tǒng)進行辨識和分離。

1 Li A，Gong H，Zhang B，et al.Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain[J].Science，2010，330：1404-1408.

2 Wu J，He Y，Yang Z，et al.3D Brain CV：simultaneous visualization and analysis of cells and capillaries in a whole mouse brain with one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2014，87：199-208.

3 Xue S，Gong H，Jiang T，et al.Indian-ink perfusion based method for reconstructing continuous vascular networks in whole mouse brain[J].PLoS One，2014，9：e88067.

4 Gong H，Zeng S，Yan C，et al.Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution[J].Neuroimage，2013，74：87-98.

5 Renier N，Wu Z，Simon DJ，et al.iDISCO：a simple，rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging[J].Cell，2014，159：896-910.

6 Urao N，Okonkwo UA，F(xiàn)ang MM，et al.MicroCT angiography detects vascular formation and regression in skin wound healing[J].Microvasc Res，2016，106：57-66.

7 Plouraboue F，Cloetens P，F(xiàn)onta C，et al.X-ray highresolution vascular network imaging[J].J Microsc，2004，215：139-148.

8 杜久林，畢國強，駱清銘，等.腦科學研究新技術(shù)[J].中國科學院院刊，2016，31：783-792.