顯微光學(xué)切片斷層成像技術(shù)在卒中研究中的應(yīng)用

潘超，張萍，唐洲平

近幾年來(lái)，美國(guó)、歐洲、日本和中國(guó)相繼宣布了媲美“人類基因組計(jì)劃”的“腦科學(xué)計(jì)劃”。這項(xiàng)宏偉的工程將對(duì)大腦內(nèi)近千億的神經(jīng)元和血管、神經(jīng)環(huán)路及其相互連接進(jìn)行全面的研究。腦內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路連接和血管連接是實(shí)現(xiàn)腦功能的基本單元。因此，如何獲取高分辨的腦連接圖譜是進(jìn)行腦科學(xué)研究的重中之重。

2010年華中科技大學(xué)光電實(shí)驗(yàn)室駱清銘團(tuán)隊(duì)采用其自主設(shè)計(jì)研發(fā)的具有顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)（micro-optical sectioning tomography，MOST）和發(fā)明的小鼠全腦高爾基染色、樹(shù)脂包埋法，以“邊切片邊成像”的工作方式采集了小鼠腦高分辨高爾基結(jié)構(gòu)三維數(shù)據(jù)集，是目前世界上最大的也是分辨率最高（0.33μm×0.33μm×1 μm）的鼠腦神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)集[1]。隨后，陸續(xù)又利用全腦尼氏染色、印度墨水灌注等方法采集了小鼠神經(jīng)元、腦血管三維數(shù)據(jù)集[2-3]。新一代熒光MOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）的開(kāi)發(fā)，借助熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠全腦樹(shù)脂包埋技術(shù)，fMOST系統(tǒng)在國(guó)際上首次成功獲取了熒光小鼠全腦范圍內(nèi)長(zhǎng)程投射神經(jīng)元結(jié)構(gòu)分布數(shù)據(jù)集，結(jié)合開(kāi)發(fā)的神經(jīng)元追蹤分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦內(nèi)特定神經(jīng)投射路徑的立體觀察和精確定量分析[4]（圖1）。此外，整體熒光染色技術(shù)已問(wèn)世，有望通過(guò)特異性免疫熒光抗體標(biāo)記血管，在一份腦圖譜中同時(shí)顯示特定神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)投射及血管連接網(wǎng)絡(luò)[5]。

卒中是一類高發(fā)病率、高致死致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前對(duì)卒中的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病后的病理生理變化及神經(jīng)血管保護(hù)仍不甚明朗。如臨床上常見(jiàn)到相同類型的卒中患者，梗死部位和梗死大小均相同，而臨床預(yù)后可能完全不同，這很可能與患者側(cè)支循環(huán)尤其是微循環(huán)的代償能力不同有關(guān)。對(duì)于缺血性卒中，血管狹窄或閉塞后其腦內(nèi)微循環(huán)是如何代償?shù)摹⑷毖獏^(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的供血關(guān)系是怎樣變化的、出血性卒中后血腫占位及高顱內(nèi)壓狀態(tài)下的顱內(nèi)微循環(huán)是如何改變、卒中后自體血管再生的過(guò)程其發(fā)生發(fā)展機(jī)制及時(shí)空分布等，卒中后神經(jīng)投射通路是否重建、與卒中后患者康復(fù)密切相關(guān)的神經(jīng)重塑、血管代償?shù)龋彩亲渲谢颊咧匾闹委煱悬c(diǎn)，目前研究亦處于較初級(jí)階段（圖2）。這些均是卒中研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，非常值得進(jìn)一步研究。

圖1 通過(guò)顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建腦神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)

圖2 通過(guò)顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)技術(shù)對(duì)卒中進(jìn)行研究

磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描血管成像（computed tomography angiography，CTA）或數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）等血管成像技術(shù)能很好地觀察大血管，但對(duì)微血管尤其是毛細(xì)血管難以做到精確的標(biāo)記和觀察。傳統(tǒng)的血管三維可視化技術(shù)手段如微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro-computed tomography，micro-CT）血管成像、同步輻射線顯微斷層血管成像等或成像分辨率低，或僅能顯示血管網(wǎng)絡(luò)，但丟失了神經(jīng)元信息，難以同步研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與血管網(wǎng)絡(luò)[6-7]。而對(duì)于微循環(huán)的研究，MOST系統(tǒng)可提供高分辨的三維可視化圖譜，結(jié)合fMOST和免疫標(biāo)記技術(shù)理論上能同時(shí)實(shí)現(xiàn)血管和神經(jīng)細(xì)胞的共標(biāo)記及共成像，未來(lái)借助MOST技術(shù)獲得卒中疾病圖譜將為進(jìn)行卒中研究提供技術(shù)支持。

腦圖譜的繪制已在美國(guó)、歐洲、中國(guó)等國(guó)家相繼展開(kāi)。目前的基本路線是從鼠類到非人靈長(zhǎng)類再到人類，從正常腦圖譜到包括腦血管疾病、腦遺傳變性病等腦疾病圖譜，為研究腦疾病和開(kāi)發(fā)腦功能、發(fā)展人工智能等提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。雖然鼠腦疾病圖譜的繪制研究正方興未艾，但由于物種特征相差較大，鼠腦內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接、血管分布及代償特點(diǎn)與人類相差較大，不能深刻揭示人腦疾病后機(jī)制。為此，采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模擬人類疾病研究具有不可替代的作用。猴類動(dòng)物的腦區(qū)分布及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接特點(diǎn)與人類更接近，其腦循環(huán)特點(diǎn)與人類相似，對(duì)研究腦缺血后的循環(huán)代償、卒中后的血管修復(fù)、卒中后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的變化具有天然的優(yōu)勢(shì)。然而，采用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物代替鼠類研究主要具有以下難點(diǎn)：①鼠腦容量遠(yuǎn)小于猴類，獲取猴類腦切片并繪制超微神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)研制難度更大，其數(shù)據(jù)量將遠(yuǎn)大于鼠腦。目前單個(gè)小鼠全腦數(shù)據(jù)集的大小已達(dá)到10 TB級(jí)別，而繪制的非人靈長(zhǎng)類全腦數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)量將到上百TB，甚至PB級(jí)別，因此處理非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦圖譜必然考驗(yàn)大數(shù)據(jù)的計(jì)算和存儲(chǔ)能力，以及軟件技術(shù)的開(kāi)發(fā)都提出了巨大挑戰(zhàn)[8]。②目前，單個(gè)鼠腦的樣本經(jīng)MOST獲取0.5 μm3精度的全腦數(shù)據(jù)集24 h不間斷切片成像需耗時(shí)3～10 d，若獲取猴類腦數(shù)據(jù)將耗費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間，可達(dá)數(shù)月之久，高強(qiáng)度的工作對(duì)儀器的壽命和保養(yǎng)提出了嚴(yán)苛的要求，亟待解決。③較大體積的腦樣本對(duì)樣品制備、染色標(biāo)記技術(shù)要求更高。現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道采用改進(jìn)的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)一定厚度的生物樣本成功標(biāo)記并獲取三維圖譜[5]，但尚未有研究解決如此大體積的腦標(biāo)本標(biāo)記難題，同時(shí)大量的抗體需求也增加了研究成本。

然而，MOST系統(tǒng)目前還是離體研究，不能在體觀察，現(xiàn)階段尚不能滿足連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察的需求。由于最后重建的三維圖譜是基于陽(yáng)性染色標(biāo)記的結(jié)構(gòu)與周圍結(jié)構(gòu)的分辨率對(duì)比，而當(dāng)血腦屏障出現(xiàn)較大破壞時(shí)，如腦梗死后，壞死組織及水腫液等在染色過(guò)程中可能會(huì)被非特異性染色，造成背景干擾，這些對(duì)獲取三維結(jié)構(gòu)造成了較大視覺(jué)影響，需待開(kāi)發(fā)更完善的軟件系統(tǒng)進(jìn)行辨識(shí)和分離。

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8 杜久林，畢國(guó)強(qiáng)，駱清銘，等.腦科學(xué)研究新技術(shù)[J].中國(guó)科學(xué)院院刊，2016，31：783-792.