甘草酸對UVB誘導人皮膚角質形成細胞凋亡的影響

傅 云，廖 建，張 瓊，王冬梅，王業秋，李建民，張麗宏

（1.黑龍江中醫藥大學 黑龍江 哈爾濱 150040；2.四川省中西醫結合醫院 四川 成都 610041；3.內江市中醫醫院 四川 內江 641000）

近年來，隨著工業化生產的快速發展，環境污染日益加重，臭氧層阻擋紫外線（ultraviolet, UV）的能力減弱，輻射至地球表面的UV逐漸增多[1]。中波紫外線（UVB）波長為290～320nm，長時間接受過度的UVB輻射將導致皮膚光損傷，引發一系列形態學、組織學及生理學轉化[2-3]，導致皮膚皺縮、無彈性、無光澤，嚴重可致色素沉著及惡性腫瘤發生[4]。長期的UVB輻射引起的炎癥反應、氧化應激、DNA損傷和細胞凋亡等是直接導致皮膚光老化的重要機制[5]，同時UVB輻射導致大量活性氧自由基（ROS）堆積于體內，可誘導凋亡相關蛋白的表達，加速細胞凋亡的發生[6]。UVB主要影響人體皮膚表皮細胞，表皮細胞大部分由角質形成細胞（human keratinocytes, HaCaT）組成[7]。研究表明[8]，當UVB照射劑量為30mJ/cm2時，即可導致人皮膚HaCaT細胞光損傷，并且發生凋亡和壞死。甘草酸是甘草根部提取物中含量較高的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、調節免疫、抑制黑色素沉著、抗癌等功效[9]。此外，甘草酸還具有一定的光熱穩定性，可減輕紫外線輻射造成的皮膚光損傷[10]。目前，對于甘草酸通過自身抗氧化、抗炎等藥理作用保護皮膚光老化的研究較多，而對于甘草酸能否抑制UVB誘導的HaCaT細胞凋亡及其相關機制尚不明確。因此，本實驗應用總劑量為30mJ/cm2的UVB誘導HaCaT細胞凋亡，用不同濃度的甘草酸作用于HaCaT細胞，探討甘草酸對UVB誘導HaCaT細胞凋亡的影響及相關機制。

1 材料

1.1 細胞株：人皮膚角質形成細胞（HaCaT）（上海中喬新舟有限公司，批號ZQ0044）。

1.2 藥物和試劑：甘草酸標準品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-16081812）；Annexin-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20170524）；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒（生工生物工程有限公司，批號B532445）；SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX)（生工生物工程有限公司，B532956）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司，批號BA1054）；兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體，兔抗人Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體（博奧森生物有限公司，批號分別為bs-0081R，bs-0049R）。

1.3 儀器：HF240型CO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；MK3型酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；HPC-150型流式細胞儀（Handyem公司）；GTR16-2型高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；mini PROTEAN Tetra Cell型電泳儀，Trans-Blot SD Cell型半干轉膜儀（英國Bio-Rad公司）；Smart chemi Ⅱ型一體式微型化學發光成像儀（北京賽智創業有限公司）；Nano-100型微量分光光度計（杭州奧勝儀器有限公司）；Mx3 000P型實時定量PCR擴增儀（安捷倫科技有限公司）。

2 方法

2.1 甘草酸有效安全濃度的篩選：取對數生長期的人皮膚角質形成細胞（HaCaT），胰酶消化，離心，計數，以濃度為1×104個/孔的細胞數接種至96孔板，每組6個復孔，96孔板的四周用PBS封閉，于37℃、5%CO2的培養箱中培養24h。96孔板內細胞隨機分為空白組和甘草酸組。吸棄培養液，空白組加入200μl新培養液；甘草酸組分別加入（1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，1×10-10）mol/L甘草酸，200 μl/孔。培養24h后，加入5g/L MTT，20μl/孔，孵育4h，吸棄培養液，加入二甲基亞砜（DMSO），150μl/孔，于37℃恒溫培養震蕩器上震蕩10min，在酶標儀492nm波長處測定吸光值（OD）。

2.2 MTT法測定HaCaT增殖率：96孔板內細胞隨機分為空白組、UVB組、甘草酸+UVB組。細胞培養24h后，吸棄培養液，PBS清洗2次，每孔加200μl PBS，使用鋁箔紙將空白組覆蓋，用30mJ/cm2UVB照射UVB組和甘草酸+UVB組，根據公式：照射劑量（mJ/cm2)=照射強度（mW/cm2)×照射時間(s)，輻射強度為0.5mW/cm2，計算出照射時間為60s。照射完畢，棄去PBS，甘草酸+UVB組分別加入1×10-7，1×10-6，1×10-5mol/L甘草酸，200μl/孔，UVB組和空白組加入DMEM培養液，200μl/孔，培養24h，加入MTT，20μl/孔，孵育4h，吸棄培養液，加入DMSO，150μl/孔，37℃恒溫培養震蕩器上震蕩10min，在酶標儀492nm波長處測定吸光值（OD）。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率：取對數生長期的HaCaT細胞，胰酶消化，離心，計數，以濃度為1×106個/孔的細胞數接種至6孔板。6孔板內細胞參照2.2方式進行分組和造模。待細胞生長密度達80%～90%時，收集6孔板中各組細胞，將舊培養液吸取至15ml離心管中，使用PBS清洗細胞2次，加入胰蛋白酶進行消化，再加入舊培養液終止消化，1 000rpm，離心5min，棄上清，加入3ml PBS重懸，在細胞計數板上計數，取4～12萬個細胞，置于1.5ml離心管中，1 000rpm，離心5min，棄上清。按照試劑盒說明書操作，最后用流式細胞儀檢測，檢測結果用Flowjo軟件處理。

2.4 實時熒光定量（RT-PCR）法檢測Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平：待細胞生長密度達80%～90%時，收集6孔板中各組細胞，每管細胞中加入1ml細胞裂解液（Trizol），室溫下靜止10min，用移液槍吹打5min，使細胞完全破碎，轉移到1.5ml EP管中。每個EP管對應加入0.2ml氯仿，劇烈晃動15s，室溫靜置3min，4℃，13 200rpm，離心15min。將上層液體提取約400μl至EP管中，每管加入等體積的異丙醇，上下顛倒使混勻，-20℃過夜。-20℃取出后，4℃，12 000rpm離心10min，EP管底部有少許的白色物質，即為總RNA，棄上清，加入預冷的75%乙醇，移液槍吹打洗滌RNA，4℃，10 500rpm離心5min，倒扣控干液體10min，加入20μl無RNA酶水溶解RNA。用Nano-100微量分光光度計測總RNA的濃度及純度，取A260/A280吸光度比值在1.8～2.0之間得樣品用于后續實驗。根據cDNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。20μl體系[MLtraSYBR Mixture(2×) 10μl，正向和反向引物各0.4μl，ddH2O 8.4μl，cDNA 0.8μl]進行反應，反應條件：95℃ 3min（預變性），95℃ 20s（變性），72℃ 20s（退火/延伸），40個循環。在擴增程序中讀取不同組的Ct值，按照2-△△Ct分析法，公式為：??Ct=（Ct目的基因-Ct內參基因）給藥組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組，計算出各組mRNA的相對表達。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列信息

2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平：待細胞生長密度達80%～90%時，收集6孔板中各組細胞，裂解液（RIPA）和蛋白酶抑制劑（PMSF）以99:1的比例混勻，以100μl/孔的量加入混合液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣品和上樣緩沖液以4:1的比例混勻，加熱煮沸10min。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）80V，30min，更換電壓110V，60min。半干轉膜30min，室溫封閉2h，用封閉液以1:500的比例稀釋一抗，4℃過夜，TBST洗膜4次，加二抗（1:10 000稀釋），置于水平搖床上孵育2h，TBST洗膜4次，加入ECL發光液（A液和B液按1:1的比例配制），使用發光成像儀拍攝，利用Lane ID凝膠軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶灰度值和內參條帶灰度值的比值，反映目的蛋白表達水平。

2.6 統計學分析：采用SPSS 21.0軟件進行分析，實驗數據以xˉ±s表示，組間比較采用ANOVA方差分析，多組間比較采用LSD、SNK法檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 甘草酸對正常HaCaT細胞增殖率的影響：與空白組比較，1×10-8、1×10-9、1×10-10mol/L甘草酸可明顯促進細胞增殖（P＜0.01）；1×10-3、1×10-4mol/L甘草酸可明顯抑制細胞增殖（P＜0.01）；1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸組細胞增殖率與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），對細胞無明顯的促進及抑制作用。因此，本實驗選擇10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸用于后續實驗研究。見表2。

表2 甘草酸對正常HaCaT細胞增殖率的影響 （xˉ±s，n=6）

3.2 甘草酸對光老化HaCaT細胞增殖率的影響：與空白組比較，UVB組細胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組細胞增殖率顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 甘草酸對光老化HaCaT細胞增殖率的影響 （xˉ±s，n=6）

3.3 甘草酸對光老化HaCaT細胞總凋亡率的影響：與空白組比較，UVB組細胞總凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組細胞總凋亡率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 甘草酸對光老化HaCaT細胞總凋亡率的影響 （xˉ±s，n=6）

3.4 甘草酸對光老化HaCaT細胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平的影響：與空白組比較，UVB組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖1。

表5 甘草酸對光老化HaCaT細胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平的影響

圖1 甘草酸對光老化HaCaT細胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達水平的影響

3.5 甘草酸對光老化HaCaT細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的影響：與空白組比較，UVB組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表6、圖2。

表6 甘草酸對光老化HaCaT細胞Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達水平的影響

圖2 甘草酸對光老化HaCaT細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的影響

4 討論

生物體內環境的穩定，不僅需要依賴細胞的增殖、分化，細胞的凋亡也起著關鍵作用[11]。正常的細胞凋亡是一個主動發起以便更好維持內環境穩定的過程[12]。UVB輻射至人體皮膚，因其穿透力較淺，因此主要作用于表皮內的色基，可使組織受到損傷，導致明顯的人皮膚角質細胞（曬傷細胞）凋亡[13]。細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，可分為凋亡激活信號、啟動、承諾、執行和清除五個步驟[14]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族對細胞凋亡起著關鍵作用，正常情況下Caspase是以無活性的酶原形式存在，在受到外界刺激時，發生水解被激活，引發Caspase級聯反應[15]。目前研究認為細胞凋亡主要由兩條信號通路介導，即Fas/FasL及TNF/TNFR通路和線粒體通路，而這兩條通路的激活最后都需要活化Caspase完成凋亡并在Caspase-3處匯合[16]。Caspase-3被稱為細胞凋亡的“執行者”，處于級聯反應的中下游，是凋亡執行因子以及凋亡途徑的匯聚點[17]。UVB作為凋亡刺激因素作用于細胞后，誘使活性氧（ROS）的產生，通過MAPK等信號通路可向下刺激Caspase-3，活化后的Caspase-3作用于細胞核內的DNA，在PARP-1等效應蛋白的協同作用下，使染色體固縮，并伴隨著DNA片段化及凋亡小體形成等，引發細胞調亡[18]。Caspase-9 則被稱之為細胞凋亡的“發起者”，活化的Caspase-9可激活Caspase-3，活化的Caspase-3可特異性的水解細胞內各種底物，從而引發 Caspase級聯反應，使細胞形成典型的凋亡小體，進而導致細胞凋亡[19]。線粒體受到外界凋亡信號刺激后，促使細胞色素C由線粒體釋放到細胞質中，Caspase-9可與細胞色素C以及Apaf-1結合形成活性復合體，進一步啟動細胞凋亡級聯反應，激活下游的效應組成員 Caspase-3、Caspase-6等，最終激活線粒體介導的細胞凋亡[20]。本實驗結果顯示，UVB輻射后，細胞總凋亡率顯著升高，Caspase-3、Caspase-9 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高，提示UVB輻射可激活 Caspase 級聯反應，可促進凋亡因子Caspase-3 及Caspase-9的表達。加入甘草酸藥物干預后，細胞總凋亡率顯著降低，Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，提示甘草酸可降低Caspase-3、Caspase-9的表達水平，進一步抑制UVB誘導的細胞凋亡。

綜上所述，甘草酸可通過降低細胞的總凋亡率，減少Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的表達，從而抑制UVB輻射誘導細胞凋亡。對于甘草酸能否通過調控其他凋亡相關通路或凋亡因子的表達抑制細胞凋亡，有待進一步研究。

[1]張宇,曹南開,張小卿,等.桃紅四物湯對光老化小鼠皮膚組織中MMP-1、MMP-3 mRNA及血清中TNF-α、IL-1含量表達的影響[J].中華中醫藥學刊,2015,33(4):919-921.

[2]張琛,楊亞,加楊娥,等.枸杞多糖對中波紫外線輻射后角質形成細胞炎癥因子表達的影響[J].中國醫藥導報,2017,14(19):20-23.

[3]楊柳,王業秋,張寧,等.黃芩素對UVB導致人皮膚角質形成細胞光老化的保護作用[J].中醫藥信息,2017,34(4):18-21.

[4]陳高敏,王順春,王璐,等.中藥植物多糖抗皮膚光老化的研究進展[J].南京中醫藥大學學報,2016,32(4):396-400.

[5]李辰,齊雪松,李寧,等.UVB輻射對人角質形成細胞HaCaT的DNA損傷及其機制[J].中國工業醫學雜志,2015,28(6):403-405,424.

[6]王麗雯,孫娟,燕華玲,等.藏雪蓮水提取物減輕中波紫外線輻射后HaCaT細胞凋亡的體外研究[J].實用醫學雜志,2016,32(8):1240-1243.

[7]甄雅賢.UVA在日光誘導皮膚生物學變化中的重要作用[J].中華皮膚科雜志,2011,44(5):371-375.

[8]周玉杰,李瑞欣,孫凱,等.五味子乙素對UVA損傷組織工程皮膚保護作用的研究[J].中國美容醫學,2014,23(6):457-461.

[9]吳宗耀,牛李義,梁喜愛.甘草化學成分及藥理作用分析[J].河南中醫,2010,30(12):1235-1236.

[10]帥友霞.甘草酸對納米氧化鋅導致的人皮膚細胞光損傷的保護作用[D].武漢:華中科技大學,2014.

[11]劉昭晗.納米矢車菊-3-葡萄糖苷干預UVB急性光損傷小鼠皮膚p53線粒體凋亡通路的研究[D].廣州:暨南大學,2016.

[12]Bhattacharya S,Ramesh MR,Johnson LR.Cyclin-dependent kinases regulate apoptosis of intestinal epithelial cells[J].Apoptosis,2014,19(3):451-466.

[13]李哲.苦杏仁精油誘導HaCaT細胞凋亡和抑制NF-κB途徑的機理[D].楊凌:西北農林科技大學,2016.

[14]程曉暉.PGRN在AD模型小鼠海馬內的表達及與凋亡相關因子Bax/Bcl-2/Caspase-3關系的研究[D].廣州:廣東藥科大學,2016.

[15]加楊娥,任立汆,燕華玲.黑枸杞水提物對中波紫外線輻射后人角質形成細胞增殖與凋亡及凋亡相關蛋白表達水平的影響研究[J].中國全科醫學,2017,20(27):3400-3404.

[16]張琦.黃芪苷Ⅳ通過PI3K/Akt信號通路抗H2O2誘導的H9c2細胞氧化損傷[D].天津:天津醫科大學,2010.

[17]王瑩.Caspase-3、Bax、Bcl-2和Beclin-1在慢性紫外線損傷小鼠模型表皮角質形成細胞中的表達及意義[D].天津:天津醫科大學,2012.

[18]Pereira C,Lopes-Rodrigues V,Coutinho I,et al.Potential small-molecule activators of caspase-7 identified using yeast-based caspase-3 and -7 screening assays[J].Eur J Pharm Sci,2014,18(54):8-16.

[19]賈文斌.脂肪間充質干細胞抑制燒傷創面內殘存角質形成細胞凋亡的實驗研究[D].西安:第四軍醫大學,2014.

[20]孫百慧.晚期氧化蛋白產物誘導人角質形成細胞凋亡機制的研究[D].廣州:南方醫科大學,2016.